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1、5 2 6福建医科大学学报2 0 0 8 年1 1 月第4 2 卷第6 期 小鼠肝K u p 仟e r 细胞分离方法探讨 严茂林，王耀东，田毅峰，赖智德，周松强，邱福南 摘要：目的探讨分离队L B c 小鼠肝K u p f f e r 细胞( K C ) 的方法。方法采用在体酶灌注和离体酶消 化、不连续密度梯度离心、选择性贴壁三步法分离K C 并比较链霉蛋白酶、型胶原酶及联用链霉蛋白酶和型胶 原酶等3 种不同酶消化分离方法所得K C 得率及纯度结果3 种不同酶消化分离方法细胞得率分别为( 6 3 2 士0 5 ) 1 0 g ( 3 6 6 士O 4 ) 1 0 6 9 ( 1 0 3 士0
2、7 ) 1 0 g - 1 f 细胞纯度分别为( 9 3 2 士1 7 ) ，( 9 0 7 士1 5 ) ( 9 4 5 士1 9 ) 结论联合链霉蛋白酶和型胶原酶在体灌注和离体消化是分离小鼠K C 的较好方法。 关键词：肝I 枯否细胞，离心法。梯密度I 小鼠近交B A B L c ，细胞分离 中图分类号：R 3 2 9 2 4 R 5 7 5文献标识码：文章编号：1 6 7 2 4 1 9 4 ( 2 0 0 8 ) 0 6 0 5 2 6 0 3 肝K u p f f e r 细胞( K u p f f e rc e l l ，K C ) 为定居在肝 窦内的巨噬细胞，约占全身单核巨噬细胞
3、总数的 8 0 9 0 。肝K C 能吞噬、杀灭病原微生物，清除 体内的内毒素，并具有抗原递呈、分泌细胞因子等 免疫调节作用同时影响肝细胞、贮脂细胞及内皮 细胞的生物学功能 1 。近期发现K C 能诱导同种异 体T 淋巴细胞凋亡，在调节肝移植免疫耐受中发挥 重要作用 2 。如何获得较多数量和较高纯度的K C 是研究其在机体中作用机制的首要条件。而传统 的分离方法往往因数量和纯度不足而影响实验结 果。本试验采用在体酶灌注和离体酶消化、不连续 密度梯度、选择性贴壁三步法分离K C ，探讨分离小 鼠肝K C 的较好方法。 1 材料与方法 1 1材料 1 1 1 实验动物B A B L c 小鼠，雄性
4、，1 0 1 2 周 龄，清洁级，由四川大学华西医学中心试验动物中 心提供( 许可证号：0 4 6 ) 。试验前禁食1 2h ，自由饮 水，随机分为3 组。 1 1 2 主要试剂和仪器型胶原蛋白酶、 D N A a s e I 、P e r c o U 及H E P E S ( 美国S i g m a 公司) ； 兔抗人溶菌酶( 1 y s o z y m e ，美国D A K O 公司) ；链霉 蛋白酶E ( 瑞士R o c h e 公司) ；R P M I 一1 6 4 0 培养基 ( 美国G i b c o 公司) 。超净工作台( 苏州净化设备 厂) ，倒置显微镜( 日本N i k o
5、n 公司) ，低温高速离心 机( 美国B e c k m a n 公司) 。 1 1 3主要液体的配制( 1 ) 前灌注液( H a n k ，s 平 衡盐溶液) K C l5m m o l L ，K H 2P O 1m m o l L ， 收稿日期：2 0 0 7 1 2 1 3 修回日期：2 0 0 8 一0 9 - 0 9 基金项目：福建省科技厅青年人才资助项目( 1 4 0 1 0 1 ) ，福建省自然 科学基金( 2 0 6 0 2 0 3 ) 作者单位：福建省立医院肝胆外科福州3 5 0 0 0 l 作者简介：严茂林( 1 9 7 4 一) 男，主治医师医学博士 N a C l1
6、1 5m m o l L ，H E P E S2 5m m o I L 。调整p H 值为7 4 。( 2 ) 后灌注液及酶消化液配制。后灌注 液、酶消化液均由h a n k s 平衡盐溶液配制。方法1 中的后灌注液含O 2 0 链霉蛋白酶2m L f 酶消化 液：含o 2 0 链霉蛋白酶2m L 、o 0 1 2 D N A a s eI 2m L ，方法2 中的后灌注液含O 0 2 5 型胶原酶 2 m L 。酶消化液：含O 0 5 I V 型胶原酶2m L ；方法 3 中的后灌注液含o 0 5 型胶原酶1m L 、O 4 链霉蛋白酶1m L ；酶消化液：含O 1 0 型胶原酶 lm L
7、、O 4 0 链霉蛋白酶lm L 、O 0 1 2 D N A a s eI 2m L ： 1 1 4 S P S 液的配制1 0 0 P e r c o l l 液和8 5 N S 以9 ：1 的比例混合，配制成S P S 原液；以7 0 P e r c o l l 液2m L 配制：S P S1 4m L 和P B S0 6m L 混合配制所得；3 0 P e r c o U 液的配制：P B S1 4m L 和S P S0 6m L 混合配制所得。 1 1 5R P M I 一1 6 4 0 完全培养基的配制 按说明书 配制，o 2 2 弘m 滤器过滤除菌，临用前加入1 0 新 鲜灭活的
8、小牛血清，青霉素1 0 0U m L ，链霉素1 0 0 p g m L 。 1 2B A B L c 小鼠K C 分离方法 1 2 1 原位肝脏灌注步骤参考文献 3 。 1 2 2 肝脏非实质细胞的提取及离心将上述肝 细胞滤液4 离心( 8 0 0r m i n 8m i n ) ，取沉淀。 加入P B S4m L ，4 离心( 8 0r m i n 3m i n ) ，除去 沉淀，取上清。加入P B S4m L 充分混匀，再次以 4 离心( 1 5 0r m i n 8m i n ) ，取沉淀。沉淀加入 P B S2m L ，充分混匀。取1 0m L 离心管1 支，依次 加入7 0 P e
9、 r c o l l 、3 0 P e r c o l l 、细胞悬液各2m L 及 少许P B S ，4 离心( 16 0 0r m i n 2 2m i n ) 。离心 管自上而下依次为：细胞碎片、3 0 P e r c o l l 层、3 0 P e r c o l l 层与7 0 P e r c o l I 层之间的是大量K C 及少 量肝窦内皮细胞、7 0 P e r c o l l 层、离心管底层为少 许红细胞。取3 0 P e r c o U 和7 0 P e r c o U 层之间的 万方数据 严茂林等：小鼠肝K u p f f e r 细胞分离方法探讨 5 2 7 白色物，P
10、 B S8m L 稀释细胞，4 离心1 次( 6 0 0 r m i n 8m i n ) ，4 分别离心( 1 5 0r m i n 8m i n ) 2 次，除去上清。 1 2 3 K C 贴壁培养将上述细胞沉淀用适量 1 0 胎牛R P M I1 6 4 0 稀释，取1 0 肛L 用台盼蓝染色 检测细胞活性及细胞计数，分别计算3 种方法的 K C 得率及纯度。于3 7 、体积分数为0 0 5 的 C 0 z 孵箱中培养。4 6h 后更换培养液，去除非贴 壁细胞，贴壁细胞即为试验所需的K C 。分别于1 ， 2 4 ，4 8h 下观察细胞形态及贴壁情况。 1 3 K C 的鉴定 1 3 1
11、 荧光显微镜观察将K C 悬液滴于细胞玻 片上，3 2 8n m 激发光，荧光显微镜下观察细胞自发 荧光情况。 1 3 2 吞噬试验K C 分别培养6 ，2 4h 后，加入 5 0 碳素墨水2m L2h 后，洗涤细胞以除去未吞噬 的碳素颗粒，倒置显微镜下观察细胞吞噬情况。 1 3 3 免疫组织化学染色常规免疫组织化学染 色，一抗为兔抗大鼠l y s o z y m e ，每次试验均设置阴 性对照组，以O 0 1m m o l LP B S 代替一抗。 1 4 统计学处理计量数据以i s 表示，采用 S P S S1 1 5 统计软件分析。组间差异用单因素方差 分析，以P O 0 5 为差别有统
12、计学意义。 2 结果 2 1 荧光显微镜观察在3 2 8n m 荧光激发下，未 见K C 发出荧光。 2 2K C 的形态变化 新鲜分离的K C 呈圆形，细 胞核大，细胞质少，折光性较强，远小于肝细胞，接 种1h 后少部分细胞已贴壁；培养2 4h 后，多数细 胞已伸展；培养4 8h 后，绝大多数细胞已贴壁，且充 分伸展，可见星形或不规则形；方法3 所得K C 培养 2 4h 后的细胞贴壁及形态情况( 图1 A ) 。 K C ：肝K u 出r 细胞 A ：K C 培养2 4h 后的形态( 1 0 ) ；B ：K c 培养6h 后吞噬试验( 1 0 ) l c ：l ( c 培养4 8h 后免疫
13、组织化学图像( 2 0 ) 图1K C 培养2 4h 后的形态、6h 后的吞噬试验、4 8h 后的免疫组织化学表现 F i g1M o r p h o u so fK Ca f t e r2 4h o u r sc u l t u r e ，t h ep h a g o c y t o s i st e s to fK Ca f t e r6h o u r sc u l t u r e ，i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yo f K Ca f t e r4 8h o u r sc u l t u r e 2 3 3 种方法分离的K C 活力、得率及纯
14、度情况 ( 表1 ) 。 农l3 种分离方法细胞得率及细胞纯度的比较 T h bl C o m p a r i s o nt h ey i e l da n dp u r i t yo fK Ci nt h r e es e p a r a t i o nm e t h o d s 捆= l O 与方法1 比较，：P O 0 5 与方法2 比较# ：P O 0 5 ，与方法1 比较，l P o 0 5 2 4 吞噬试验K C 分别培养6h ，再与碳素墨水 颗粒培养2h ，可见K C 内吞噬大量碳素墨水颗粒 ( 图1 B ) 。 2 5 免疫组织化学染色K C 培养4 8h 后，免疫组 织化学染
15、色显示细胞内溶菌酶9 6 以上为阳性染 色，细胞内呈棕黄色( 图1 C ) ，证实所分离贴壁细胞 为K C 。 3 讨论 目前分离肝脏非实质细胞的方法主要有密度 梯度离心法、离心淘析法及将两者相结合的方法。 V a l a t a s 等先用密度梯度法将死亡的肝细胞与肝非 实质细胞分离，然后利用离心淘析法分离大鼠K C ， 进一步利用选择性贴壁纯化K C ，获得较好的细胞 得率和纯度H 。由于离心淘析法设备昂贵，难以在 一般试验室推广。本实验利用联合酶在体和离体 灌注、密度梯度离心和选择性贴壁法，具有以下优 点：( 1 ) 型胶原酶和链霉蛋白酶的用量少。以相 同体质量的肝组织计算，型胶原酶的使
16、用量仅仅 万方数据 5 2 8福建医科大学学报2 0 0 8 年1 1 月第4 2 卷第6 期 相当于J i a n g 等用量的1 5 0 嘲，( 2 ) 细胞得率、纯度 相对较高。本实验注重在体灌注和酶的联合应用。 提高酶的效率I ( 3 ) 灌注时间较短，污染机会较少， ( 4 ) 操作方便，无需特殊设备。与其他方法相比 较 3 淳7 1 ，本实验方法同样取得与其相当的细胞得率 和纯度，且节省分离时间和酶用量。 本实验系统地比较了3 种不同分离方法的K C 细胞纯度和得率，结果显示，联合链霉蛋白酶与 型胶原酶在体灌注和体外消化所获得的K C 纯度和 得率均较为理想。方法3 同时使用了3
17、种酶，其中 链霉蛋白酶裂解肝细胞，型胶原酶解除肝非实质 细胞间的连接，D N A 酶降解D N A ，从而形成较为完 全的单细胞悬液，比其他2 种方法获得较高的细胞 得率。方法2 由于没有使用链霉蛋白酶，肝细胞破 坏较少，形成的单细胞悬液较为不完全，所以细胞 纯度及细胞得率较低。方法1 使用了链霉蛋白酶和 D N A 酶，减少了絮状物的形成，相对方法2 所获得 的细胞得率较高。 门静脉插管是完成在体灌注的关键。首先使 门静脉保持一定张力，从肠系膜上静脉处沿门静脉 方向呈1 5 。进针，使针尖超过脾静脉入口，然后用血 管夹夹闭以阻断入肝血流。同时灌注时应排尽针 管空气，防止血管空气栓塞导致肝组织
18、消化不良。 另外笔者术中采用血管夹以固定头皮针，防止针管 移动和滑脱，同时防止灌注液的流失和停止灌注时 肠系膜上静脉及脾静脉的血液回流，是在体灌注顺 利完成的关键。 笔者认为K C 得率影响因素主要有以下几点： ( 1 ) 门静脉灌注良好与否是影响肝K C 得率的关键， 这与其它学者报道一致 3 3 ，( 2 ) 消化不完全时，难以 获得完全的单细胞悬液，含有K C 的组织被滤网滤 除或离心时丢失，细胞不纯会进一步影响K C 贴壁。 联合链霉蛋白酶和型胶原酶离体消化能获得较 为完全的单细胞悬液叫；( 3 ) 用链霉蛋白酶E 消化 后，细胞悬液中很快出现絮状物。絮状物中会网络 较多K C ，影响
19、离心过程中K C 的分离。加用D N A 酶I 能有效防止絮状物的形成，提高细胞得率；( 4 ) 在贴壁时间相同的情况下，K C 的纯度和数量是相 互矛盾的。 参考文献： 1 w i n w o o dPJ ，A r t h u rMJ K u p f f e r I l lT h e i ra V a t i o na n d m I ei n8 n i m ln I o c I e l 6o f l i v e ri I l j u r ya I l dh u 脚nl i v e rd i 3 e a 3 e 刀& m 打L f w rD “，1 9 9 3 1 3 ( 1 ) 1 5 0
20、 - 5 9 2 s u nzL ，w a d aT ，M a e m u mK ，以口z H e p a t i ca I l o g 珀f t _ d e r i v e d k u p f f e rc d l sr e g u I a t eTc e l Ir e 5 p o n 5 ei nm t 5 J L 钟rt ，口刖- p k H 缸t l o n ，2 0 0 3 ，9 ( 5 ) l4 8 9 4 9 7 3 J i a n gJX ，Z h a n gY ，J isH ，盯4 ，K i n e t i o fn l i t o 睇n a c t i “ 。 t e dp
21、 t e i nk i n a 5 ef a i l yi nl i p o p o I y 5 B c c h a r i d e - 5 t i m u h t e dI u s e k u p f f e rc e l l sa n dt h e kr o l ei nc y t o k i n ep 1 o d u c t i o n J S o 幽。 2 0 0 2 ，1 8 ( 4 ) 1 3 3 6 3 4 1 4 V 札札V x i d a 妇C ，R 埘l m 阳k iH ，以以I l a t i o no fr a tk u p f f c r 傀l bIB m b i n
22、 e dm e t h o d o l o g yf o rh i g h l yp u r i f i e dp 血n a r yc u 卜 t e s J C f “B f o z o g y 竹盯犯t D 懈Z ，2 0 0 3 ，2 7 ( 1 ) 1 6 7 7 3 5 P u l f o r dK s o u h a I I l iRLc e l ld i v i s i o na n dg i a n tc e l lf o rm a t i o n i nk u 啦r l lc m t u 瑚 J a 抽p h 舢加z 1 9 8 0 4 2 ( 1 ) l 6 7 - 7 6
23、 6 T e n H a g e nTL ，“ l 卜V i a n e nw ，B a k k e rw 九I l a t i a l I d c h m c t c r i z a t i o no fm u r i n ek u p f f e r U sa n ds p l e n i cm c r o p h l g e 8 J JJ 优，摊H n o zM f f D d 1 9 9 6 ，1 9 3 ( 1 ) 1 8 l 一9 1 7 E d I i s t o nKH ，S h 两iY M i iT ，以4 f R o l eo fn i t r i co 】【i d ea
24、n d 5 u p e 枷ea n i o ni ne l i m i 眦t i o no f l o wm e t a s t 8 t i ch u m nc o l o r - 矗= t 丑Ic a r d m a sb yu n 8 t i m u I a t e dh e p a t i cs i n u i d a lc n d o t h e l i a l c e l l s 刀C 4 行c f r R f j ，1 9 9 8 ，5 8 ( 7 ) 1 1 5 2 4 - 1 5 3 1 8 孙晓东周志伟，万德森，等小鼠肝枯否细胞的分离培养与鉴 定 J 中固现代臣生，2 0 0
25、 7 ，4 5 ( 6 ) 。2 2 2 3 T h el s o I a t j o no fK u p 仟e rC e si nB A L B cM o u s e Y A NM a O n ，W A N GY a O d O n g ，T I A NY i f e n g ，L A IZ h i d e ，Z H O US o n g q i a n g ，Q I UF u n a n 瞻p a r 佣ta rH e t o b a r ys u r r y F u j i 硼P r o v j i a IH p i t B I ，F u z h 叫3 5 0 0 0 l C h i n
26、 a A B S T R A C T ：O b j e c t I v eT oe x p l o r eab e t t e rm e t h o df o ri s o l a t i o no fm o u s eK u p f f e rc e l l s ( K C ) M e t h o d sK Cw a si s o l a t e df r o mt h el i v e ro fm o u s eb yi ns i t up e r f u s i o nw i t he n z y m e ，e n z y m a t i cd i g e s t i o n e xv
27、i v o ，d i s c o n t i n u o u sd e n s i t yg r a d i e n tc e n t r i f u g a t i o na n ds e l e c t i V ea d h e r e n c e ，w ec o m p a r e dp r o n a s eE ， c o l l a g e T m s e ，p r o n a s eEa n dc o l l a g e m s e m i xf o ri s o l a t i o no fK Ci ny i e l da n dp u r i t y R e s u I t s
28、T h e y i e l do fK Cw i t ht h r e ed i f f e r e n tm e t h o d sw a s ( 6 3 2 0 5 ) 1 0 6g ，( 3 6 6 士O 4 ) 1 0 6g ，( 1 0 3 士O 7 ) 1 0 6g ，r e s p e c t i v e l y T h ep u r i t yw a s ( 9 3 2 土1 7 ) ，( 9 0 7 1 5 ) ，( 9 4 5 士1 9 ) ，r e s p e c t i v e l y C o n c I u s i o n ( k m b i n i n gp r o m s eEw i t hc o l l a g e n a s e i ns i t up e r f u s i o na n de n z y m a t i cd i g e s t i o ne xv i v o m a yb eab e t t e rm e t h o df o ri s o l a t i o no fK C K E YW O R D Sl l i v e r ；k u p f f e rc e l l sIm i c e ，i n b r e dB A B L cl c e I ls e p a r a t i o n ( 编辑：张恙茹) 万方数据