大肠杆菌O11 O抗原基因簇序列的破译及特异分子标识的鉴定.pdf

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1、46 卷3 期 2006 年 6 月 4 日 微生物学报 Acta Microbiologica Sinica 46 （3） ： 341 346 4 June 2006 基金项目： 国家 “863 计划”（2002AA2Z2051）； 国家杰出青年科学基金资助项目 （30125001） *通讯作者。Tel： 86-22-66229584； Fax： 86-22-66229596； E-mail： wanglei 作者简介： 王威 （1977 - ） ， 男， 山东蓬莱人， 讲师， 博士。主要从事微生物基因组学和功能基因组学研究， 病原微生物的遗传进化和快速 检测的研究。 收稿日期： 2005

2、-11-24； 接受日期： 2006-01-09； 修回日期： 2006-02-07 大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇序列的破译及特异分子标识的鉴定 王威， 彭霞， 王荃， 程剑松， 王磊* （南开大学泰达生物技术学院天津300457） 摘要： 大肠杆菌 O11 是一种可在人畜间交叉传染的强致病菌， 具有潜在流行性爆发的危险。现完成了 O11 O-抗 原基因簇的破译， 筛选和鉴定了多种特异分子标识， 并实现了对大肠杆菌 O11 的快速、 灵敏和准确的分子分型检 测。利用鸟枪法测定大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇的序列全长为 14180bp， 生物信息学方法分析序列结构， 共发现 12 个基因：

3、 GDP-L 型岩藻糖合成途径基因（gmd，fcl，gmm，manC，manB） 、 UDP-N 乙酰葡萄糖 C4 异构酶基因 （gne） 、 O-抗原转运酶基因 （wzx） 、 O-抗原聚合酶基因 （wzy） 和 4 个糖基转移酶基因； 用 PCR 方法筛选出 2 个针对大肠杆菌 O11 的特异基因和 4 对特异引物， 并进行环境样品检测实验鉴定了该 PCR 检测方法的灵敏度； 设计并筛选出 8 条针 对大肠杆菌 O11 的特异探针。 关键词：大肠杆菌 O11； O-抗原基因簇； 分子分型； 特异基因； 探针 中图分类号： Q78文献标识码： A 文章编号： 0001-6209（2006）0

4、3-0341-06 大肠杆菌分为 170 余种 O 抗原血清型 1， O-抗 原由含 2 6 个单糖的寡糖单位重复连接组成， 是大 肠杆菌等革兰氏阴性菌脂多糖的最外层结构。在大 肠杆菌、 沙门氏菌和志贺氏菌中， 大部分编码负责 O-抗原合成的酶的基因相邻排列于两个持家基因 galF 和 gnd 之间， 在染色体上形成一个基因簇 2，3。 O-抗原的多样性， 使编码合成 O-抗原的基因簇成为 筛选特异分子标识的最佳靶位点之一。 一些大肠杆菌具有较强致病性， 可引起腹泻及 尿道炎、 败血症等其他非肠道感染疾病， 并能引起人 和动物间的交叉传染， 尤其在发展中国家非常流行。 在食源性和水源性新发传染

5、病病原中， 最重要的是 致病性大肠杆菌， 近几年新发现多种非 O157 的致病 性大肠杆菌， 已被证实引起小规模爆发， 并且具有潜 在的大规模流行性爆发的危险性 4，5。快速、 准确 地鉴定这些致病菌是控制其传播的重要防御手段。 传统的血清学检验方法耗时长、 灵敏度低、 漏检率 高、 准确性差， 而近年来 PCR 和基因芯片 （DNA 芯 片） 技术等现代分子生物学方法的出现很大程度上 弥补了传统方法的不足。其中， 基因芯片技术发展 迅速， 并且由于其可实现对生物样品快速、 并行、 高 效的检测， 而必将成为微生物检测鉴定的最佳手段 之一。目前， 许多国家将大量的人力和物力投入到 快速鉴定致病

6、菌的研究， 特别是特异 DNA 探针的筛 选工作中 6，21。 本文研究的大肠杆菌 O11， 属于产志贺毒素大 肠杆菌 （Shiga toxin-producing E . coli， STEC） ， 可引起 人肠道和尿道感染 7等疾病， 是一种人畜交叉传染 的较强致病菌， 并且多次在某些地区的牛、 猪及环境 中被检测到 8，9， 具有潜在的流行性爆发的危险。 目前， 尚未有大肠杆菌 O11 的 O-抗原基因簇序列破 译及其相关研究的报道。本文在破译大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇序列的基础上， 筛选和鉴定了多种特 异分子标识， 并实现了对大肠杆菌 O11 的快速、 灵 敏和准确分子分型检测。

7、 1材料和方法 1.1材料 1.1.1菌种和质粒： 大肠杆菌 O11 菌株由澳大利亚 悉尼大学 Reeves 教授实验室提供， 受体菌株 （大肠 杆菌 Escherichia coli DH5） 由本室保存； pGEM-T-Easy 购自 Promega 公司。 1.1.2试剂和仪器： Expand Long Template PCR 酶购 自 Boehringer Mannheim 公司， PCR 纯化试剂盒、 T4 DNA 连 接 酶、 Wizard PCR Preps 纯 化 试 剂 盒 购 自 Promega 公司， EcoRI、 DNaseI、 X-Gal、 IPTG、 氨苄青霉 素

8、购自上海 Sangon 公司， 引物和探针由北京奥科生 物技术有限责任公司合成， dUTP-Cy3 购自 Amersham 公司， 杂交液由中国军事医学科学院提供。醛基化 玻片为美国 CEL 公司产品， Flexys 生物芯片点样仪 为美国 GSI 公司产品， UV 交联仪为 Hoefer 公司产 品。 1.2O-抗原基因簇的鸟枪法测序 采用 Bastin 10法提取大肠杆菌 O11 的基因组 DNA。根据 galF 基因和 gnd 基因分别设计上、 下游 引物， 用长距离 PCR 方法扩增 O-抗原基因簇， 合并 6 管 PCR 产物， 用 Wizard PCR Preps 纯化试剂盒纯化。

9、 用 DNaseI 消化 PCR 纯化产物，提取大小集中在 1.5 3kb 之间的片段， 与 pGEM-T-Easy 载体在 T4 DNA 连接酶作用下 16连接 12h。取连接产物电转化感 受态大肠杆菌 DH5， 涂布在含有氨苄青霉素、 X-Gal 和 IPTG 的 LB 固体培养基上， 37 培养 12h。筛选 白色克隆， 用 96 孔平板碱裂解法提质粒， 用 EcoR 酶切挑选插入片段在 1kb 以上的克隆。采用 T7/sp6 通用引物， 用 ABI3730 型 DNA 自动测序仪测序。 1.3序列拼接和分析 用英国剑桥 MRC 分子生物学实验室的 Staden package 软件包中

10、 Pregap4/Gap4 软件拼接和编辑序 列 11。用英国 Sanger 中心 Artemis （7.0 版） 发现基因 和完成序列注释 12， 用美国国家生物技术信息学中 心 （NCBI） 的 blast 软件搜索 GenBank 推测开放的阅 读框架的功能， 用 ClustalW 软件做序列间的全局比 对， 用 TMHMM 2.0 进行蛋白质跨膜片段的分析。用 BlockMaker 发现基序，用 Pfam 和 Prosite 搜索蛋白质 基序数据库。 1.4特异基因的鉴定 在大肠杆菌 O85 O-抗原基因簇的 wzx 和 wzy 基 因内部各设计 2 对引物 （表 1） ， 以所有的不

11、同 O-抗原 血清型的 166 株大肠杆菌和 43 株志贺氏菌 （表 2） 的 基因组为模板进行 PCR。PCR 反应条件： 95预变性 2min； 95变性 30s， 退火温度见表 1， 退火 30s， 72延 伸 1min， 共 30 个循环； 72 5min， 反应体系为 25 L。 表 1 大肠杆菌 O11 的特异基因 PCR 反应 Table 1The PCR results of E . coli O11 specific genes Gene Putative function Forward primers （base positions） ，oligonucleotide s

12、equence reverse primers （base positions） ，oligonucleotide sequence Length of PCR fragments（bp） No. of pools giving correct band Annealing temperature of PCR（） wzxO-antigen flippase wl-2162（1573-1588） ，5-GCACGCTTACTTACAC-3 wl-2163（1951-1967） ，5-TTCCTATTAGTACTGCT-3 3950* 48 wl-2164（1227-1243） ，5-TGAAC

13、CTACAGGATACG-3 wl-2165（1888-1903） ，5-CGTGATGTTCCGCAAT-3 6770* 52 wzyO-antigen polymerase wl-2166（3154 -3169） ，5-TTTGCCTCTTGCTTTA-3 wl-2167（3998-4013） ，5-TACTGCTCCGTTCTCA-3 8600* 52 wl-2168（3529-3544） ，5-AATAAGCGTAATCCCA-3 wl-2169（4034-4051） ，5-TCAAATGAAGAAAACGAC-3 5230* 52 *Only the pools containing

14、 E . coli O11 gave the PCR products of correct size. 表 2 166 株大肠杆菌和 43 株志贺氏菌的分组及来源 Table 2166 E . coli and 43 Shigella type strains and PCR pools used for testing Pool No.Strains of which chromosomal DNA included in the poolSource 1.E . coli type strainsO1， O2， O5， O7， O8， O9， O12， O13， O14， O15， O1

15、6， O17， O18，O19ab， O20， O21， O22， O23， O24IMVSa 2.E . coli type strainsO4， O10， O25， O26， O27， O28， O29， O30， O32， O33，O34， O35，O36， O37， O38， O40， O41， O42， O43IMVSa 3.E . coli type strainsO6， O44， O45， O46， O48， O49， O50， O51， O52， O54， O55， O56，O57， O58， O60， O61， O62， O53IMVSa 4.E . coli type st

16、rainsO63， O65， O66， O69， O70， O71， O74， O75， O76， O77， O78，O79， O80， O81， O82， O83， O68IMVSa 5.E . coli type strainsO84， O85， O86， O87， O88， O89， O90， O91， O92， O98， O99，O101， O102， O103， O104， O105， O106， O97IMVSa 6.E . coli type strainsO107， O108， O109，O111， O112ab， O112ac， O113，O115， O116， O118，

17、O120， O123， O125， O126， O128， O117IMVSa 7.E . coli type strainsO129， O130， O131， O132， O133， O134， O135， O136， O137，O138， O139， O141，O142， O143， O144， O145， O140IMVSa 8.E . coli type strainsO146， O147， O148， O150， O152， O154， O156， O157， O158，IMVSa O159， O160， O161， O163， O164， O165， O166， O153b 9.E

18、 . coli type strainsO168， O169， O170， O171， O172，O173，c and S . dysenteriae type strainsD1， D2， D3， D4， D5， D6， D7， D8， D9， D10， D11， D12， D13d 10.S . boydii type strainsB1， B2， B3， B4， B6， B7， B8， B9， B10， B11， B12， B13， B14， B15，B16， B17， B18d 11.S . flexneri type strainsF1a， F1b， F2a， F2b， F3， F4

19、a， F4b， F5 （v： 4） ， F5 （v： 7） ， F6，DS， DRd 12.E . coli type strainsO3， O110， O39， O59， O64， O73， O96， O95，O114， O151， O155，IMVSa O124， O167， O162， O121， O127， O149， O119 13.Same as pool 12，with E . coli O11 addedIMVSa a. Institute of Medical and Veterinary Science，Anelaide，Australia；b. Statens Serum

20、 Institute，Copenhagen，Denmark；c. O172 and O173 from Statens Serum Institute， Copenhagen，Denmark，the rest from IMVS；d. Institute of Communicable Disease Prevention and Control，Chinese Center for Disease Prevention and Control，Beijing，People s Republic of China. 243WANG Wei et al ./Acta Microbiologica

21、 Sinica （2006） 46 （3） 1.5环境样品的检测 1.5.1基因组： 将提取的基因组按 101 109分别做 梯度稀释， OD 检测并换算成质量含量。分别取 1L 稀释好的基因组为模板， 用 4 对特异引物进行 PCR 反应。PCR 反应条件同上。 1.5.2掺入猪肉： 分别在 5 份生猪肉馅 （20g/份） 中 掺入 5 103、 5 10 2、 5 101、 5 个和 0 个活菌， 搅拌 均匀， 加入 200mL LB 培养基， 经纱布过滤， 滤液于 37， 200r/min 培养 3 5h。分别取 1L 培养的菌液 水煮裂解上清液为模板， 按上述相同条件进行 PCR 反应

22、。 1.5.3掺入粪便： 将 5 103、 5 102、 5 101、 5 个和 0 个活菌分别掺入 5 份各 0.2g 的粪便样品中， 于 37 200r/min 培养 3 5h， 取 1.2mL 菌液用试剂盒 提取基因组。取 1L 基因组为模板， 按上述相同条 件进行 PCR 反应。 1.6基因芯片特异探针的筛选 1.6.1探针设计： 用 OligoArray2.1 在大肠杆菌 O11 O 抗原基因簇中的 wzx 和 wzy 基因内部的不同位置 各设计 6 条探针。 1.6.2芯片和样品制备： 50% DMSO 溶解探针， 以 醛基化玻片为载体， 利用 Flexys 生物芯片点样仪点 样制

23、备芯片。室温过夜， 在 UV 交联仪中 60mJ/cm2 下交联 2 次， 保存备用； 以基因组为模板， 特异引物 一步扩增获得被 dUTP-Cy3 标记的双链 PCR 产物。 1.6.3杂交和扫描： 以无菌去离子水冲洗芯片， 置 于杂交炉 （Hybaid ST200，England） 中 45烘干并预 热。将烘干的标记 PCR 产物， 用 30L 杂交液-2 充 分混合均匀， 取 15L 于 PCR 仪中 98变性 5min， 点 至芯片上， 40杂交 16h。杂交结束后， 分别用洗液 洗涤并烘干， 使 用 Genepix 4100A 芯 片 扫 描 仪， 以 532nm 波长的通道扫描芯片

24、， Genepix pro 4.1 软件分 析结果。 2结果和讨论 2.1大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇的序列测定 以基于 galF 基因设计的上游引物 （ # wl1523： 5-ATTGTGGCTGCAGGGATCAAAGAAAT-3）和 基 于 gnd基 因 设 计 的 下 游 引 物（ #wl1524：5- TAGTCGCGTGNGCCTGGATTAAGTTCGC-3） ，采 用 长 PCR 方法扩增大肠杆菌 O11 的 O-抗原基因簇， 通过 0.8%琼脂糖凝胶电泳检测， 在 15kb 附近的位置出 现一条电泳带。根据帕松公式 p0= e - nw/ L （ p 0： 未测 定序列

25、的概率， n： 测定序列的克隆数， w： 序列平均 长度， L： 测序模板总长） 13， 以序列平均读长 600bp 计算， 要保证每个碱基 3 倍覆盖的高质量序列并且 获得对 15kb 测序模板的 95%的覆盖率， 至少要进行 75 个克隆以上的测序反应。但实际上， 需要进行比 理论计算更多的测序反应才能达到预期的效果。本 文对 100 个插入片段在 1kb 以上的克隆进行单向 （T7） 测序， 并对部分克隆进行反向 （sp6） 测序打通序 列缺口， 经 Pregap4 和 Gap4 软件拼接和编辑得到大 肠杆菌 O11 的 O-抗原基因簇的全序列， 序列全长 14180bp。 2.2大肠杆

26、菌 O11 O-抗原基因簇的序列分析 大肠杆菌的 O-抗原基因簇一般含有 3 类基因： 单糖合成酶基因、 糖基转移酶基因和寡糖单位处理 基因。我们用 orffinder 在大肠杆菌 O11 的 O-抗原基 因簇中发现基因， 共找到 12 个开放的阅读框 （除 galF 和 gnd）（图 1） 。采用生物信息学方法对大肠 杆菌 O11 的 O-抗原基因簇中基因的功能进行了预 测 （表 3） 。 图 1 大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇结构 Fig.1Structure of E . coli O11 O-antigen gene cluster. 2.2.1单糖合成酶基因：大肠杆菌中的常见糖由

27、于它们为细菌基础代谢底物， 其合成酶基因存在于 基因组的其它位置， 一般不在 O-抗原基因簇里重复 出现， 而罕见糖需由 O-抗原基因簇的单糖合成酶基 因负责合成。单糖合成酶基因由于有极高的同源 性， 很容易通过与已知功能基因的序列进行比较而 鉴定。通过检索和比较， 在大肠杆菌 O11 的 O-抗原 基因簇中发现 UDP-N 乙酰葡萄糖 C4 异构酶基因和 一套编码 GDP-L 型岩藻糖合成酶的基因， 我们推测 在大肠杆菌 O11 的 O-抗原的结构中可能存在两种 罕见单糖。 orf5 编 码 的 蛋 白 与 小 肠 结 肠 耶 尔 森 氏 菌 （Yersinia enterocolitica

28、）（type 0:8） 中编码的 UDP-N 乙 酰葡萄糖 C4 异构酶 （由 gne 基因编码） 有 61%的氨 基酸序列一致性， 75% 的相似性， 通过对 Pfam 蛋白 基序数据库的搜索， 发现 orf5 编码的蛋白与已知的 UDP-N 乙酰葡萄糖 C4 异构酶的共有序列的同源性 343王威等： 大肠杆菌 O11 O-抗原基因簇序列的破译及特异分子标识的鉴定 ./微生物学报 （2006） 46 （3） 预期值为 1.1e - 136， 因此我们将这个基因命名为 gne。UDP-N 乙酰葡萄糖 C4 异构酶催化 UDP-N-乙 酰葡萄糖中的第四位碳异构化， 形成 UDP-N-乙酰半 乳糖

29、。 表 3 大肠杆菌 O11 O 抗原基因簇中基因的功能 Table 3Function of genes in E . coli O11 O antigen gene cluster Gene Location in sequence No. of aa （G + C）% Similar proteins （accession no. of aa in GenBank） %Identical/%similar （aa overlap） Putative function wzx1138 - 237341130.0putative O-antigen transporter Escherich

30、ia coli K12（AAC75098）38/62 （403）O-antigen flippase orf22382 - 310724128.9putative glycosyl transferase Escherichia coli（AAG41755）35/62 （224）glycosyl transferase wzy3104 - 433941126.2O-antigen polymerase Wzy Escherichia coli（AAD50486）23/46 （398）O-antigen polymerase orf44341 - 540835531.2putative glyc

31、osyltransferase Campylobacter jejuni（AAM90643）28/49 （344）glycosyl transferase gne5429 - 644533835.7Gne Yersinia enterocolitica（type 0： 8）（AAC60777）61/75 （336）glcNAc 4-epimerizase orf66514 - 752133532.5mannosyltransferase-like protein Yersinia pestis（CAB63280）51/69 （337）glycosyl transferase gmd7532 -

32、 865337338.8 GDP-mannose-4， 6-dehydratase Yersinia pseudotuberculosis （type O： 1b）（CAB63300） 84/91 （372） GDP-mannose-4， 6-dehydratase fcl8657 - 962232135.3Fcl Yersinia enterocolitica（type 0： 8）（AAC60774）72/86 （320）GDP-L-fucose synthetase gmm9625 - 1008015135.3GDP-mannose mannosylhydrolase Klebsiella

33、 pneumoniae（BAD03940）50/72 （146）GDP-mannose mannosylhydrolase manC 10092 - 1147746137.3mannose-1-phosphate guanyltransferase Salmonella enterica（AAB49390）59/78 （463）mannose-1-phosphate guanyltransferase orf1111561 - 1230724832.3putative glycosyl transferase Escherichia coli（AAG41755）100/100 （326）gly

34、cosyl transferase manB 12332 - 1370245654.5phosphomannomutase Shigella sonnei（AAC80270）98/99 （456）phosphomannomutase orf7，8，9， 10， 12 分 别 与 gmd， fcl， gmm， manC，manB 基因有很高的序列一致性。Gmd，Fcl， ManC，ManB 是负责合成 GDP-L 型岩藻糖的重要 酶。6-磷酸果糖在焦磷酸甘露糖异构酶 （ManA） 、 磷 酸甘露糖变位酶 （ManB） 及 1-磷酸甘露糖鸟苷酸转 移酶 （ManC） 的作用下形成 GDP-甘露糖，

35、 GDP-甘露 糖在 GDP-甘露糖 C4， 6 位脱水酶 （GMD） 和 GDP-L-岩 藻糖合成酶 （Fcl） 的作用下通过 3 步反应得到 GDP-L 型岩藻糖 14，15。 manB 和 manC 基因一般位于 O 抗 原基因簇中， 而 manA 基因在基因组的其他位置。 Gmm 是 GDP-甘露糖水解酶， 普遍存在于含有 GDP-L 型岩藻糖的 O 抗原的基因簇中， 其在 GDP-L 型岩藻 糖合成途径中的具体功能未知。因此我们推测大肠 杆菌 O11 的 O 抗原中含有 GDP-L 型岩藻糖， 并将 orf7，8，9， 10， 12 相 应 命 名 为 gmd， fcl， gmm，

36、manC，manB。 2.2.2寡糖单位处理酶基因： 寡糖单位处理酶基因 包括 O-抗原转运酶基因 （wzx） 和 O-抗原聚合酶基因 （wzy） ， 其编码的蛋白由于有典型的 10 14 个跨膜 片段， 可以用生物信息学方 法 鉴 定 16，17。 orf1 和 orf3 是大肠杆菌 O11 中仅有的两个编码存在跨膜片 段的蛋白的基因。orf1 编码的蛋白与大肠杆菌 K12 的 O-抗原转移酶有 38%的序列一致性， 62%的相似 性， 并且有 12 个均匀的跨膜片段 （Wzx 蛋白的典型 特征） ， 所以命名为 wzx。 orf3 编码的蛋白与大肠杆 菌 （AAD50486） 的 O-抗原

37、聚合酶有 23% 的一致性， 46%的相似性， 并且有 10 个跨膜片段和 1 个大的胞 质内亲水环 （Wzy 蛋白的典型特征） ， 所以命名为 wzy。 2.2.3糖基转移酶基因： orf2，orf4，orf6，orf11 4 个基因编码的蛋白与其他已知的糖基转移酶有较高 的序列一致性和相似性。通过对 Pfam 中糖基转移 酶基序数据库的搜索， 这 4 个基因编码的蛋白与已 知的糖基转移酶家族 1 和 2 的共有序列具有较高的 同源性， 我们推测这 4 个基因编码糖基转移酶， 命名 为 orf2，orf4，orf6，orf11。通常情况下每个糖基转 移酶特异性催化形成一种二糖键， 因此我们推

38、测大 肠杆菌 O11 的 O-抗原的寡糖单位可能由 5 个单糖 组成。 2.3大肠杆菌 O11 特异基因的鉴定 大肠杆菌的 O-抗原基因簇中的寡糖单位处理 基因和糖基转移酶基因有很高特异性 18。我们针 对这两个基因设计 PCR 引物， 在每个基因内设计两 对引物， 每对引物分布在相应基因内的不同区域， 以 确保其检测的准确性。对所有 166 株大肠杆菌和 43 株志贺氏菌分组进行 PCR 反应， 并以含有大肠杆菌 O11 的第 13 组菌作为正对照 （表 1） 。每对引物除了 在第 13 组中得到了正确大小的一条带， 在其他组中 都没有扩增到任何电泳可见产物， 所以大肠杆菌 O11 的 wz

39、x 和 wzy 基因对大肠杆菌 O11 是高度特异 的 （表 3） 。本文提供的引物， 以及基于这两个基因 设计的其他引物和探针可作为特异分子标识， 用于 快速准确地检测人体、 畜类和环境中的大肠杆菌 O11 型菌。 2.4在环境样品中检测大肠杆菌 O11 传统方法检测食品、 粪便、 污水等样品中致病菌 的步骤繁琐费时， 需经富集培养、 分离培养、 形态特 征观察、 生理生化反应、 血清学鉴定以及必要的动物 443WANG Wei et al ./Acta Microbiologica Sinica （2006） 46 （3） 试验等过程， 并且无法对那些难以人工培养的微生 物进行检测。199

40、8 年在美国国家传染病控制中心 召开的世界各国专家和官员参加的讨论如何改进传 统的血清学鉴定方法的会议， 其主要结论便是必须 尽快研究可靠的基于 DNA 分子的细菌鉴定方法。 本文在采用特异引物的 PCR 检测方法针对基 因组及掺入猪肉、 掺入粪便两种模拟环境样品中的 大肠杆菌 O11 进行检测， 得到检测灵敏度分别为 1pg/L、 0.25cfu/g 和 2.5 103cfu/g， 检测时间为 6 10h。实验结果表明， 该方法检测灵敏度高、 速度快， 相比传统检测方法具有明显的优势。 2.5大肠杆菌 O11 特异探针的筛选 基于探针 Tm值和长度的考虑， 通过软件共设 计出 12 条探针。

41、经过 3 次稳定杂交， 筛去 4 条杂交 无信号或信号弱的探针 （编号 PX2， 5 和 PY1， 4） ， 最 后筛选鉴定出针对大肠杆菌 O11 特异的探针 8 条 （表 4， 图 2） 。 表 4 大肠杆菌 O11 特异探针的筛选 Table 4Selection of E . coli O11 specific probes Target gene No. of probes Location Length /bp Tm/ Result of hybridization wzxPX11320-13583979.2+ PX21391-14304080.0- PX31505-15444080

42、.1+ PX41723-17624079.6+ PX51740-17763778.9- PX61814-18493679.0+ wzyPY13291-33304080.3- PY23425-34644080.2+ PY33488-35263979.8+ PY43603-36413980.0- PY53810-38453678.9+ PY63859-38963879.2+ 图 2 大肠杆菌 O11 特异探针的杂交 Fig.2Hybridization of E . coli O11 specific probes. Dots circled by frames are E . coli 16S

43、rDNA probes. Underlined dots are E . coli O11 specific probes，PX1， PX3， PX4， PX6（first row，from left to right） ； PY2， PY3， PY5， PY6（ second row，from left to right） . 随着基因组学的飞速发展， 大量动、 植物和微生 物的基因组信息相继获得， 基因芯片 （DNA 芯片） 技 术得到广泛重视和快速发展， 在食品安全、 医疗检 测、 药物筛选、 生物安全等领域具有巨大的应用价 值 19，20。目前， 在基于基因芯片技术对病原微生物 的检测

44、领域， 特异 DNA 片段或探针的筛选是最关键 的环节。O-抗原是极强的抗原， 是大肠杆菌和志贺 氏菌重要的致病因素之一， 同时它又具有极强的多 样性， 这启示我们可将其作为重要的研究对象。 stx 和 eae 基因是至今除 O-抗原基因簇以外最好的靶基 因 21， 但它们的特异性远远低于本研究所用的特异 基因。本文筛选的大肠杆菌 O11 的探针具有很好 的特异性和稳定性， 为开发针对致病性大肠杆菌的 快速检测基因芯片提供了必要的基础。 参考文献 1 Whitfield C. Biosynthesis of lipopolysaccharide O antigens. Trends Micro

45、biol，1995，3 ：178 - 185. 2 ReevesPR.Bacterialpolysaccharide synthesisandgene nomenclature. Trends Microbiol，1996，4 ：495 - 503. 3 Curd H，Liu D，Reeves PR. Relationships among the O antigen gene clusters of Salmonella enterica groups B，D1，D2，and D3. J Bacteriol，1998，180 （4）： 1002 - 1007. 4 Scotland SM，W

46、illshaw GA，Smith HR，et al . Virulence properties of Escherichia coli strains belonging to serogroups O26，O111 and O128 isolated in the United Kingdom in 1991 from patients with diarrhoea. Epidemiol Infect，1993， 111：429 - 438. 5 Schmidt HGC，Tarr I，Frosch M， et al . Non-O157 pathogenic Shiga toxin-pro

47、ducingEscherichia coli： Phenotypic and genetic profiling of virulence traits and evidence for clonality. J Infect Dis， 1999， 179：115 - 123. 6 Park CH，Vandel NM，Hixon DL. Rapid Immunoassay for detection of Escherichia coli O157 directly from stool specimens.J Clin Microbiol，1996，34：988 - 990. 7 Ramch

48、andani M，Manges AR，DebRoy C，et al . Possible animal originofhuman-associated， multidrug-resistant， uropathogenic Escherichia coli . Clin Infect Dis，2005， 40 （2） ： 251 - 257. 8 Fratamico PM， BagiLK， BushEJ， etal .Prevalenceand characterization of Shiga toxin-producing Escherichia coli in swine feces

49、recovered in the national animal health monitoring system s swine 2000 study. Appl Environ Microb，2004，70 （12） ：7173 - 7178. 9 Vernozy-Rozand C，Montet MP，Bertin Y，et al . Serotyping，stx2 subtyping，and characterization of the locus of enterocyte effacement island of Shiga toxin-producing Escherichia coli and E . co