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1、书书书 论 著 延迟整流钾通道在人 AGS 胃癌细胞的表达及 Kv1.5 对 AGS 细胞生长的影响 兰 梅 时永全 韩者艺 郝志明 潘阳林 樊代明 摘 要 目的 观察9 种延迟整流钾通道在人 AGS 胃癌细胞的表达及下调 Kv1.5 表达对 AGS 细胞生长的影响。方法 用 RT- PCR 方法检测 Kv1.1、 Kv1.2、 Kv1.3、 Kv1.5、 Kv1.6、 Kv2.1、 Kv2.2、 Kv3.1 和 Kv3.2 亚单位在 AGS 细胞的表达； 用间接免疫荧光法证实 Kv1.5 的蛋白表达后， 采用小干扰 RNA （siRNA） 下调 Kv1.5 表达， 用 MTT 及流式细胞术观
2、察其对细胞生长、 细胞周期分布的影响。结 果 在 AGS 细胞中可检测到7 种延迟整流钾通道的表达， 其中 Kv1.3、 Kv1.5 和 Kv2.1 的 mRNA 水平较高， Kv1.6 和 Kv3.1 的水平较 低。间接免疫荧光法证实 Kv1.5 主要表达于 AGS 的细胞膜上。用 siRNA 下调内源性 Kv1.5 的表达后， AGS 细胞生长明显减慢， 细胞 阻滞于 G1期， 细胞增殖指数明显降低。结论 在 AGS 细胞中有多种延迟整流钾通道的表达， Kv1.5 可能通过对细胞周期的影响而 参与胃癌细胞的增殖调节。 关键词 延迟整流钾通道； 胃肿瘤； 逆转录聚合酶链反应； RNA 干扰；
3、 细胞增殖 中国图书资料分类号 R329.28 Expression of delayed rectifier potassium channels in AGS cells and the effects of down-regulation of Kv1.5 on AGS cell proliferation Lan Mei， Shi Yongquan， Han Zheyi et al. Institute of Digestive Diseases， Xijing Hospital， Fourth Military Medical University， Xi an 710032， Ch
4、ina Abstract Objective To study the expression of 9 delayed rectifier potassium channel subunits in human gastric cancer cell line AGS， as well as the effect of down-regulation of the expression of Kv1.5 on AGS cells proliferation. Methods RT-PCR technique was employed to detect the mRNA expression
5、of Kv1.1， Kv1.2， Kv1.3， Kv1.5， Kv1.6， Kv2.1， Kv2.2， Kv3.1 and Kv3.2 in AGS cells. Once the expression of Kv1.5 protein was confirmed by immunofluorescence， small interference RNA（siRNA）was applied to down -regulate the Kv1.5 protein expression， then MTT assay and flow cytometry were used to observe
6、the cell proliferation and the cell cycle distribution. Results Totally 7 delayed rectifier potassium channel subunits were detected in AGS cells，among them the mRNA levels of Kv1.3，Kv1.5 and Kv2. 1 were much higher than that of the others. It was confirmed by immunofluorescence that the Kv1.5 prote
7、in was expressed mainly in AGS cytomem- brane. After the endogenous Kv1.5 expression in AGS cells was down regulated by siRNA， the cell proliferation obviously slowed down and the cell growth stopped in G1 period. Conclusion Multiform expression of delayed rectifier potassium channel subunits existe
8、d in AGS cells， and Kv1.5 may be involved in the regulation of gastric carcinoma cell proliferation by modulating the cell cycle. Key words delayed rectifier potassium channels；stomach neoplasms；reverse transcription polymerase chain reaction；RNA interfer- ence； cell proliferation 延迟整流钾通道属电压门控性钾通道 （
9、voltage-ga- ted potassium channel， Kv） 家族， 具有电压依赖、 慢失活 或不失活、 对 4-AP 敏感等特性。目前已知除 eag、 KC- NQ 家族外， Kv1 Kv3 家族多数成员编码的电流具有 延迟整流样特性 1， 2。延迟整流钾通道不仅在可兴奋 细胞普遍表达， 而且在肿瘤细胞也有表达， 并与肿瘤细 胞的增殖有关 3。我们的前期研究也证实在 SGC7901 胃癌细胞中存在着与细胞增殖有关的延迟整流性钾电 流 4， 5， 但有关 Kv 家族成员在胃癌细胞系表达及功能 方面的研究较少， 为此本研究观察了9 种延迟整流钾 通道 亚单位在人 AGS 胃癌细胞
10、的表达及 Kv1.5 与 胃癌细胞增殖的关系， 以期为胃癌发生、 发展及逆转治 疗提供一定的理论依据。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒和细胞株 siRNA 表达载体 mU6pro 6为 美国密西根大学 Turner 教授惠赠。该载体含有 RNA U6 启动子。人胃癌细胞系 AGS 为本研究所实验室保 存。 1.1.2 主要试剂 细胞总 RNA 提取试剂 Trizol 为 In- vitrogen 公司产品； M-MuLV 反转录酶为 MBI 公司产 品； 一管便捷式 PCR 扩增试剂盒购自天为时代； 羊抗人 Kv1.5 多抗为 Santa Cruz 公司产品； 抗 -actin
11、 的单抗 为 Sigma 公司产品； FITC 及辣根过氧化物酶标记的兔 抗羊二抗购自北京中山生物技术有限公司； FuGENE6 为 Roche 公 司 产 品；T4DNA 连 接 酶 及 各 种 作者简介： 兰 梅， 医学博士， 副教授， 副主任医师。主要从事肿瘤缺氧信 号转导方面的研究。已发表论文10 余篇 作者单位： 710032 西安 第四军医大学西京医院全军消化疾病研究所 （兰 梅、 时永全、 韩者艺、 郝志明、 潘阳林、 樊代明） 基金项目： 国家自然科学基金资助课题 （编号30100079） 907 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin
12、PLA Vol 30 No 8 August 2005 限制性 DNA 内切酶均购自 TaKaRa 公司； 小量质粒提 取试剂盒购自 Omega 公司； 噻唑蓝 （MTT） 为华美公司 产品。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 人 AGS 胃癌细胞系生长于含10% 小牛血清的 RPMI 1640 培养液中， 于 37、 5%CO2培 养箱中培养。 1.2.2 RT-PCR 按试剂盒说明书完成 AGS 细胞 RNA 的抽提纯化和 cDNA 的合成。所使用的各引物序列见 表1。PCR 反应体系为 50l， 反转录产物 1l， 上下游 引物各2l， 2 Taq PCR master mix 25l
13、。PCR 反应条 件： 94 5min； 94 96 45s 1min， 50 58 45s 1min， 72 45s 1min， 共30 个循环； 72 10min； 4保 存。-actin 的条件为 95 1min， 94 40s， 56 40s， 72 40s， 26 个循环； 72 10min。之后， 各取20l PCR 扩增产物在2%琼脂糖凝胶上电泳， UVP 紫外凝胶成像 仪上观察照相。 表1 RT-PCR 扩增时所使用的各延迟整流钾通道成员的 引物序列及反应参数 Table 1 Primer sequences for rectified delayed potassium ch
14、annels used for RT-PCR 基 因引物序列 （5-3） 片段大小 （bp） 定位 退火温度 （） Kv1.1 5-ccatgaccactgtaggatac-3 5-cgatctccatgtactcatac- 3 2681 104 1 37251 Kv1.2 5-aaaggtctccagattctagg-3 5-actaatggtagaggcacttc-3 4291 429 1 85851 Kv1.3 5-cggttcttcgcttgtcctag-3 5-ctggcaatgcgatggtcaag-3 4901 160 1 65055 Kv1.5 5-tctcggtcttggtt
15、atcctc-3 5-tggccaccacatcgatgatg-3 330919 1 24958 Kv1.6 5-ggtcattctcatctccatag-3 5-ccaccaagtcaatgatgttc-3 3621 411 1 77351 Kv2.1 5-ctgtctgaaaccagctcaag-3 5-gaagaaactagagtgctggc-3 4771 482 1 95954 Kv2.2 5-catcagtaccatcctcttag-3 5-tgacttcactcacagcatgg -3 3712 840 3 21152 Kv3.1 5-gaggacgagctggagatgac-3
16、5-ggcagaagatgacacgcatg-3 367501 86855 Kv3.2 5-gctgtagtgaccatgactac-3 5-tggtactagagcgtctgatg-3 4061 290 1 69654 -actin 5-ggccgggacctgactgactac-3 5-tctttgcggatgtccacgtc-3 309684 99360 1.2.3 间接免疫荧光法 AGS 细胞在固化好多聚赖 氨酸的盖玻片上生长到约80%融合， PBS 冲洗10min 3 次， 95%乙醇室温固定 30min， 固定细胞用 PBS 冲洗 10min 3 次后， 加 0.3%Triton
17、X-100 室温 10min， 正常 山羊血清 37 封闭 10min， 加入羊抗人 Kv1.5 多抗 （1:100） 4孵育过夜。PBS 溶液洗涤 10min 3 次， 加 入1:100 的 FITC 标记的兔抗山羊 IgG， 37孵育 2h。 PBS 洗10min 3 次， 荧光显微镜观察照相。 1.2.4 Kv1.5-siRNA 的构建和细胞转染 特异性 siRNA 的设计： 以 GenBank 收录的 Kv1.5 的基因序列 作为分析序列， 根据 siRNA 的设计原则， 合成两对特异 的 siRNA 靶序列， 以保证 RNAi 对 Kv1.5 的抑制效率。 具体为： siRNA1：5
18、-tttgagatgttgatgtggacgcacagcgtcca-cat- caacatctcttttt-3， 5-ctagaaaaagagatgttgatgtggacgctgtg-cgtc- cacatcaacatct-3； siRNA2：5-tttgatactcgaagataagcc-aacat- ggcttatcttcgagtatcttttt-3， 5-ctagaaaaagatactcgaag-ataagc- catgttggcttatcttcgagtat-3。siRNA 表达载体的构建： 取 等量的100mmol/ L 的正反义寡核苷酸片段， 在退火缓 冲液 （1mol/ L NaC
19、l， 100mmol/ L Tris， pH7.4） 中于95 保温5min 后， 缓慢降至室温， 将退火后的双链 siRNA 与 Bpil 和 Xba 线性化的 mU6pro 载体16连接过夜， 转化 DH5 感受态细胞， 挑取单菌落， 采用 Hind 和 Xba 双酶切鉴定重组质粒， 测序正确后， 进行下一步的 细胞转染实验。细胞转染与鉴定： 将 AGS 细胞接种 于24 孔板， 待细胞生长至60% 70%融合时， 采用 Fu- GENE6 转染试剂， 分别将 Kv1.5-siRNA1、 Kv1.5-siRNA2 及空载体 mU6pro 转入 AGS 细胞， G418 选择性培养液 培养3
20、 周后， 随机挑取Kv1.5-siRNA1、 Kv1.5-siRNA2 和 空载体对照组转染细胞的单克隆， 继续扩大培养。 转染细胞的鉴定： 取对数生长期的各稳定转染的细胞， 加三去污裂解液裂解细胞制备总蛋白， Bradford 法测定 蛋白浓度； 取 100g 总蛋白上样， 行 SDS-PAGE 电泳， 电转至硝酸纤维素膜， 8%脱脂奶粉封闭后， 与羊抗人 的 Kv1.5 多克隆抗体 （稀释度 1: 200） 4孵育过夜， TBST 漂洗10min 3 次后， 再加辣根过氧化物酶标记的 二抗室温孵育 2 3h， TBST 漂洗 10min 3 次， 化学发 光法显影， 以 -actin 为内
21、参照。 1.2.5 转染细胞的生长曲线 取对数生长期的 AGS 转染与未转染细胞， 以每孔 2 103个细胞密度接种入 96 孔板， 分别于培养的第1、 2、 3、 4、 5、 6 天取出细胞， 每 孔加 MTT 20l， 继续培养4h， 吸弃孔内培养上清， 加入 150l 二甲基亚砜， 振摇溶解形成的结晶， 然后在酶标 仪上测定490nm 处的吸光度值 （A） ， 用只加培养液不加 细胞的空白孔调零。以时间为横坐标、 3 复孔的平均光 吸收值为纵坐标， 绘制细胞生长曲线。 1.2.6 转染细胞的细胞周期检测 未转染及稳定转染 的细胞生长至 70% 80% 融合时， 胰酶消化， PBS 洗 涤
22、， 70%乙醇/ PBS 制备单细胞悬液， 4固定24h 以上， 流式细胞仪测定细胞周期， 计算细胞增殖指数 （PI） ： PI = （S +G2） / （G1+S +G2） 。 2 结 果 2.1 AGS 细胞中延迟整流钾通道 亚单位的表达 017 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin PLA Vol 30 No 8 August 2005 采用 RT-PCR 法检测了除 Kv1.4 外其他 9 种 Kv 家族 成员 亚单位在 AGS 细胞的表达情况， 结果发现除 Kv1.2、 Kv3.2 外， 其余 7 种延迟整流钾通道在 AGS 细 胞均有表达，
23、 其中 Kv1.3、 Kv1.5 和 Kv2.1 的 mRNA 水 平较高， Kv1.6 和 Kv3.1 的水平较低 （图1） 。 图1 AGS 胃癌细胞中9 种延迟整流钾通道的表达 Figure 1 RT-PCR amplification of nine delayed rectifier potassium channels from RNA of AGS human gastric cancer cells 2.2 间接免疫荧光法检测 Kv1. 5 在 AGS 细胞的表达 选择 mRNA 水平较高的 Kv1. 5， 采用间接免疫荧光 法检测其在 AGS 细胞的表达， 结果发现 Kv1.
24、 5 的荧 光信号很强， 且主要集中在 AGS 细胞的膜上 （图2） 。 图2 Kv1.5 蛋白在 AGS 细胞的表达 （免疫荧光， 100） Figure 2 Immunofluorescence staining for Kv1.5 in AGS cells 2.3 Kv1.5-siRNA 对 AGS 细胞生长的影响 2.3.1 Kv1.5-siRNA 表达载体的构建及鉴定 合成的 Kv1.5-siRNA 寡核苷酸片段退火后得到约 50bp 的 DNA 片段， 将 Kv1.5-siRNA 片段连入含有 RNA U6 启 动子的 mU6pro 载体， Hind 和 Xba 双酶切， 重组载体
25、 释放大小约400bp 的片段， 分别命名为 Kv1.5-siRNA1、 Kv1.5-siRNA2； 非重组载体释放约1 100bp 片段。测序 结果显示 Kv1.5-siRNA 片段已正确连入 mU6pro 载体， 提示特异的 siRNA 载体构建成功。 2.3.2 Kv1.5-siRNA 转染细胞的 Western blot 鉴定 将构建好的 Kv1.5 的 RNAi 载体 Kv1.5-siRNA1 和 Kv1.5-siRNA2 以及 mU6pro 空载体以脂质体法分别转 入 AGS 细胞， G418 筛选阳性克隆， 鉴定结果如图 3 所 示。由图中可见， 与亲本细胞及空载体转染细胞相比，
26、 两 siRNA 均可部分抑制 Kv1.5 的表达， Kv1.5-siRNA2 的抑制效率较 Kv1.5-siRNA1 明显， 因此后续实验均采 用 Kv1.5-siRNA2 进行。 图3 Kv1.5-siRNA 抑制效果的 Western blot 鉴定 Figure 3 Western blot analysis of the suppression of Kv1.5 expression in Kv1.5-siRNA transfected cells 2.3.3 Kv1.5-siRNA 对 AGS 细胞生长的影响 用 MTT 法检测细胞生长情况， 结果显示前 3 天尽管 Kv1.5-s
27、iRNA 转染组细胞的生长慢于空载体转染细胞， 但二者间并无明显差别； 从第 4 天起， Kv1.5-siRNA 转 染组细胞明显慢于空载体转染组细胞 （图4） 。 图4 Kv1.5-siRNA 转染细胞的生长曲线 Figure 4 The growth curve of Kv1.5-siRNA transfected cells 2.3.4 Kv1.5-siRNA 对细胞周期的影响 空载体转染 组细胞的 G0/ G1期细胞百分数为 52.3%， 而 Kv1.5- siRNA 转染组增加为 71.2%； 空载体组细胞的增殖指 数为 47.8%， 而 Kv1.5-siRNA 转染组增殖指数降为
28、28.9% （表2） 。 117 解放军医学杂志 2005 年8 月 第30 卷 第8 期 Med J Chin PLA Vol 30 No 8 August 2005 表2 下调 Kv1.5 表达对 AGS 细胞周期分布的影响 （%） Table 2 Effect of down-regulation of the expression of Kv1.5 in AGS with RNA interference on cell cycle distribution 细胞系 G0/ G1期 S 期 G2/ M 期 PI mU6pro52.332.615.247.8 Kv1.5-siRNA71.
29、222.66.328.9 3 讨 论 Kv 通道由 和 亚单位组成， 亚单位形成通道 复合物的孔区及电压敏感区， 4 个相同的 亚单位共 同组装形成同源四聚体， 同一家族不同亚家族成员组 装形成异源四聚体； 辅助性的 亚单位只存在于部分 Kv 通道中， 本身不形成功能性通道， 相当于分子伴侣， 与共表达的 亚单位的失活及门控特性的调节等有 关 7。 Kv 通道不仅广泛存在于可兴奋细胞， 而且在非兴 奋性细胞如淋巴细胞及乳腺癌、 小细胞肺癌、 前列腺 癌、 结肠癌、 肝癌等多种肿瘤细胞中均有表达 3， 但有 关胃癌细胞中 Kv 通道表达及其分布的报道则较少。 我们的研究显示， 在人 AGS 胃癌
30、细胞中， 存在多种具有 延迟整流特性的 Kv 通道成员， 其中 Kv1.3、 Kv1.5 和 Kv2.1 的 mRNA 水平较高， Kv1.6 和 Kv3.1 的水平较 低， 而 Kv1.2 和 Kv3.2 则几乎无表达 （尽管我们不排除 其在胃癌细胞中存在的可能） ， 提示有不只一种延迟整 流钾通道存在于 AGS 细胞中， 这些通道在胃癌细胞中 的作用可能不尽相同。 虽然我们从基因水平上检测到 AGS 细胞中有多 种延迟整流钾通道的存在， 但有 mRNA 的存在， 并不能 保证有编码蛋白的存在， 如在培养的 AT-1 心肌细胞中 有 Kv2.1 mRNA 的存在， 但并无相应的蛋白存在 8。
31、 尽管我们不可能逐一检测 AGS 细胞上所有 Kv 成员的 蛋白表达， 但我们还是选择 mRNA 水平较高的 Kv1.5 检测了其蛋白表达， 结果显示 Kv1.5 不仅能在 AGS 细 胞中转录， 而且还能翻译产生相应的蛋白， 提示 Kv1.5 不仅仅是一种 “心血管特异” 的通道 9， 它还可能与 AGS 细胞的增殖、 分化等过程有关。 大量的研究表明， 延迟整流钾通道/ 钾电流与肿瘤 细胞的增殖密切相关 3。在延迟整流钾通道中， Eag 家 族成员特别是 HERG （human eag-related） 与肿瘤细胞 增殖的关系已得到公认 10， 目前虽然也有 Kv1.1 和 Kv1.3 与
32、人乳腺癌细胞 MCF-7 增殖关系方面的报 道 3， 但有关 Kv1 Kv3 家族其他成员在肿瘤细胞增殖 作用中的研究则较少。虽然 Kv1.5 最先从心脏克隆而 获得， 但现有证据表明其在人恶性胶质细胞瘤中也有 表达 11， 提示 Kv1.5 可能与肿瘤的恶性增殖及侵袭表 型有关， 那么 AGS 细胞中高表达的 Kv1.5 是否也与胃 癌细胞的增殖有关呢？为此， 我们采用特异的针对 Kv1.5 的 RNA 干扰技术下调内源性 Kv1.5 的表达， 观 察其对胃癌细胞增殖的影响， 结果发现降低 Kv1.5 的 表达能明显抑制 AGS 细胞的增殖， 诱导细胞周期的 G1 期阻滞， 使细胞的增殖指数
33、减低， 提示 Kv1.5 可能通过 控制细胞周期进程而参与胃癌细胞的增殖调节。 除 Kv1.5 外， AGS 细胞上有不止一种延迟整流钾 通道存在， 其他成员是否也与胃癌细胞的增殖有关， 其 与 Kv1.5 的关系如何， 它们在胃癌发生、 发展中的作用 到底如何目前仍不清楚， 还需进一步研究才能确定。 参 考 文 献 1Baranauskas G， Tkatch T， Surmeier DJ. Delayed rectifier currents in rat globus pallidus neurons are attributable to Kv2.1 and Kv3.1/3.2 K+
34、channels. J Neurosci， 1999， 19 （15） ： 6394 2Coma M， Vicente R， Busquets S et al. Impaired voltage-gated K+chan- nel expression in brain during experimental cancer cachexia. FEBS Lett， 2003 （1-3） ， 536： 45 3Wang Z. Roles of K+channels in regulating tumour cell proliferation and apoptosis. Pflugers Ar
35、ch， 2004， 448 （3） ： 274 4韩 英， 郎 兵， 樊代明 等. 人胃癌 SGC7901 细胞膜钾离子通道的 特性. 第四军医大学学报， 2002， 23 （7） ： 608 5吴汉平， 吴开春， 韩 英 等. 人胃癌细胞环氧合酶-2 调节延迟整流 钾通道的实验研究. 中华肿瘤杂志， 2002， 24 （5） ： 440 6Yu JY，DeRuiter SL，Turner DL. RNA interference by expression of short-interfering RNAs and hairpin RNAs in mammalian cells. Proc
36、Natl Acad Sci USA， 2002， 99 （9） ： 6047 7Chung YH， Joo KM， Nam RH et al. Immunohistochemical study on the distribution of the voltage-gated potassium channels in the gerbil cerebel- lum. Neurosci Lett， 2005， 374 （1） ： 58 8Deal KK，England SK，Tamkun MM. Molecular physiology of cardiac potassium channel
37、s. Physiol Rev， 1996， 76 （1） ： 49 9Choe H， Lee YK， Lee YT et al. Papaverine blocks hKv1.5 channel cur- rent and human atrial ultrarapid delayed rectifier K+currents. J Phar- macol Exp Ther， 2003， 304 （2） ： 706 10 Crociani O， Guasti L， Balzi M et al. Cell cycle-dependent expression of HERG1 and HERG1
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