大鼠IL-6基因真核表达质粒的构建.pdf

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1、大鼠I L - 6基因真核表达质粒的构建 * 韩明国1 * *,赵学信1,哈木拉提吾甫尔2,武贵臻1,黄静静1,库热西玉努斯1* * * ( 新疆医科大学1基础医学院生物化学教研室, 2新疆地方病分子生物学实验室,新疆 乌鲁木齐 8 3 0 0 5 4) 摘要:目的: 为应用R NA i技术调节白细胞介素6( i n t e r l e u k i n - 6,I L - 6) 基因表达, 构建大鼠I L - 6基因真核表达 质粒。方法: 从大鼠结肠中提取总R NA, 经逆转录( r e v e r s et r a n s c r i p t i o n) 得到目的基因的c D NA, 经P

2、 C R得到目 的基因扩增片段, 将其连接入p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O载体中, 对重组体进行鉴定。结果: 成功构建了目的基 因的重组体, 测序报告显示核苷酸序列无误。结论: 大鼠真核表达质粒p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O/I L - 6的成功 构建, 为应用R NA i技术调节I L - 6基因表达提供了实验基础, 为研究I L - 6与溃疡性结肠炎的关系提供实验平台。 关键词: I L - 6; 逆转录;p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O 中图分类号:R - 3 3 2;R

3、 3 4 文献标识码:A 文章编号: 1 0 0 9 - 5 5 5 1(2 0 0 6)0 6 - 0 4 8 0 - 0 3 T h ec o n s t r u c t i o no f r a t i n t e r l e u k i n - 6g e n ee u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r H A N M i n g - g u o,Z H A OX u e - x i n,H a m u l a t iW u p u e r,e t a l (D e p a r t m e n t o fB i o c h e m

4、 i s t r y,P r e c l i n i c a lM e d i c i n eC o l l e g e,X i n j i a n gM e d i c a lU n i v e r s i t y, U r u m q i8 3 0 0 5 4,C h i n a) A b s t r a c t:O b j e c t i v e:W ec o n s t r u c ta ne u k a r y o t i ce x p r e s s i o nr e c o m b i n a n tc o n t a i n i n gt h er a tI L - 6g e

5、n et o r e g u l a t eI L - 6g e n e e x p r e s s i o nw i t hR NA i t e c h n i q u e .M e t h o d s:T h e r a t I L - 6c D NAw a s r e v e r s e t r a n s c r i p t e d f r o mt o t a lR NAw h i c hw a s e x t r a c t e d f r o mr a t s c o l o n,a m p l i f i e db yP C R,t h e n i tw a s i n s e

6、 r t e d i n t o t h ev e c - t o rp c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O. R e s u l t:S e q u e n c i n gr e s u l t ss h o w e dt h a ta ne u k a r y o t i ce x p r e s s i o nv e c t o r, p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O/I L - 6w a s c o r r e c t l yc o n s t r u c t e d . C o n c l u s i o n: S

7、 u c c e s s f u l c o n s t r u c t i o no f r a t I L - 6e u k a r y o t i c e x p r e s s i o nv e c t o r c r e a t e s a no p p o r t u n i t y f o ru s t od i s s e c t t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e n I L - 6a n du l - c e r a t i v ec o l i t i sb yR NA i t e c h n i q u e . K e yw

8、 o r d s:i n t e r l e u k i n - 6;r e v e r s e t r a n s c r i p t i o n;p c D NA 3. 1/C T - G F P -T O P O 溃疡性结肠炎(u l c e rc o l i t i s,U C) 是一种非特异 性的肠道炎症性疾病,临床主要表现为腹泻、 脓血 便, 伴有精神情绪反应, 腹痛即泻, 泻后痛减。白细 胞介素6( I L - 6) 由激活的巨噬细胞、 淋巴细胞及上 皮细胞分泌, 能被I L - 1 和TN F - 诱导。当炎症刺 激时, 由单核细胞、 巨噬细胞和内皮细胞所释放, 也 是急性期反

9、应的主要细胞因子。本实验构建大鼠 I L - 6基因真核表达质粒, 旨在为探讨I L - 6与溃疡性 结肠炎的关系提供实验平台。 1 材料与方法 1 . 1 实验动物与试剂 W i s t a r大鼠( 雄性) 由新疆医 科大学实验动物中心提供。I L - 6引物由上海生工生 物有限公司合成: 上游引物5 - A G T T T C T C T C C G - C A A G A - 3 , 下 游 引 物5 - G C C G A G T A G A C C T C A T - A G T G A- 3 , 产物长度6 2 4b p。UN I Q - 1 0总R NA 抽提试剂盒、AMV第一

10、链c D NA合成试剂盒、 即用 扩增试剂盒、 质粒提取试剂盒均购自上海生工生物 工程技术服务有限公司。B I O - R A DD NA冷冻纯化 柱购自美国B I O - R A D公司。G F PF u s i o nT O P O TA E x p r e s s i o n K i t s购自美国I NV I T R O G E N公 司。 1. 2 方法 1. 2. 1 造模方法 动物模型为大鼠溃疡性结肠炎 模型: 每日不定时电击2次, 电压3 0 V, 时间2 0 084 新疆医科大学学报 J OURNA LO FX I N J I ANG ME D I C A LUN I V E

11、 R S I T Y 2 0 0 6J u n.,2 9(6) * * * 新疆维吾尔自治区教育厅高校重点资助项目(X J E DU 2 0 0 4 I 2 6) 作者简介: 韩明国(1 9 7 9-) , 男, 在读硕士研究生, 助教, 研究方向: 应用RNA i技术调节基因表达。 通讯作者为库热西玉努斯 m i n, 合并隔日饥饱法, 电击1 4d后对其结肠58 c m处灌8%的乙酸2m l, 待乙酸作用1 5s后用5m l 生理盐水冲洗, 除去乙酸效果。灌酸7d后脱颈椎 处死大鼠, 取大鼠58c m段结肠, 剪取明显溃疡部 位, 放入液氮中保存。 1. 2. 2 动物组织总R NA提取

12、UN I Q - 1 0总R NA 提取按试剂盒说明书进行操作。R NA纯度和浓度 鉴定用紫外分光光度计,O D 2 6 0/O D2 8 0比值2时, 应用于R T - P C R。 1. 2. 3 R T - P C R 反应混合物在7 0水浴5m i n 后, 冰浴3 0s, 3 7温浴6 0m i n, 得到c D NA。P C R 参数: 9 43 0s,5 53 0s,7 23 0s, 共3 5个循环, 最终7 2延伸5m i n。扩增产物用2%琼脂糖电泳, 溴化乙淀显色, 紫外灯下观察, 选取合适P C R产物 进行测序。 1. 2. 4 P C R产物回收纯化 凝胶颗粒-2 0

13、冰浴 5m i n, 室温离心3m i n(1 30 0 0r/m i n) 。 1. 2. 5 重组体构建 采用T /A克隆法将目的基因 与p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O载 体 连 接 后 转 化 E. c o l iT o p 1 0, 筛选阳性克隆。(1)D NA的重组及 转化: 重组体转化入E. c o l iT o p 1 0。在含有5 0g/ m l氨苄青霉素的L B固体培养基中培养过夜。(2) 阳性克隆的筛选: 选择在氨苄青霉素平板上生长的 菌落, 挑选单菌落至5m l含5 0g/m l氨苄青霉素 的L B液体培养基内, 3 7 2 0 0

14、r/m i n振荡培养过 夜。( 3) 克隆菌的鉴定: 提取重组体D NA, 用特异性 引物进行扩增, 电泳鉴定扩增产物, 并初选重组体 后, 测序以确定阳性克隆。 2 结果 2. 1 大鼠总R NA电泳结果 总R NA 电泳结果显 示, 总R NA中2 8 S/1 8 S=2, 证明mR NA完性好, 见 图1。 2. 2 R T - P C R电泳结果 扩增出高纯度目的基因 ( 6 2 4b p) , 见图2。 2. 3 重组质粒提取后用特异性引物扩增出相应片 断大小的目的基因, 见图3。 2. 4 测序结果 P C R产物测序结果显示, 扩增出 的目的基因是大鼠I L - 6基因。重组质

15、粒测序结果 显示成功构建重组体, 且测序结果输入到美国国立 医学图书馆( B L A S T) , 对比序列一致。 图1 大鼠总R N A电泳结果(R N AM a - r k e r为R NAL a d d e r . H i g hR a n g e r .) 图2 R T - P C R电泳结果(D NA M a r k - e r为G e n e R u l e r TM1 0 0b pD NA L a d - d e r) 图3 重组质粒提取后用特异性引物 扩增 目 的 基 因 结 果 (D NAM a r k e r为 G e n e R u l e r TM1 0 0b pD N

16、AL a d d e r) 3 讨论 近年国内报道的溃疡性结肠炎病例逐渐增多, 但其病因及发病机制至今尚未完全明确 1。其发病 原因可能是遗传、 环境和免疫等方面因素共同作用 的结果 2。 I L - 6在急性炎症反应中的作用主要表 现为对多种细胞的促炎作用和诱导肝组织产生急性 反应蛋白。H o l u b等 3的研究发现, 溃疡性结肠炎 患者血清I L - 6浓度明显升高, 且与病变范围和病变 严重程度呈正相关。G r o t t r u p等 4报道, 活动期溃 疡性结肠炎患者病变粘膜的I L - 6mR NA和蛋白表 达较非病变粘膜、 感染性肠道炎症对照组和正常对 照组明显升高, 并和炎

17、症分级呈正相关, 治疗后随着 病情的缓解I L - 6浓度下降。说明I L - 6在溃疡性结 肠炎的发病中起重要的作用, 并可用来监测疾病活 动和判断治疗效果。 R NA种类繁多, 其中mR NA在总R NA中只 占2% 3%, 同 时R NA酶 降 解 效 率 极 高, 使 得 R NA的提取成为分子生物学实验的关键一步。为 了获得高质量R NA, 可采取的有效措施包括: ( 1) 使 用R NA酶抑制剂, 如焦碳酸二乙酯(D E P C) ; ( 2) 用 强变性剂, 如异硫氰酸胍能迅速导致细胞结构破碎, 使R NA酶变性失活; ( 3) 避免痕量R NA酶污染, 如 取组织的手术器械、

18、实验器皿须严格消毒, 实验操作 过程防止污染。而总R NA电泳结果是判断其纯度 和检验其是否被降解的重要指标。要求动物组织总 R NA的电泳条带2 8 S/1 8 S为2/1, 可以认为在总 R NA中mR NA种类及完整性得到保证。本实验在 很大程度上杜绝了R NA酶污染问题。 本实验在p c D NA 3. 1/C T - G F P - T O P O重组体 构建中, 对P C R产物做到了以下几点: ( 1)5 端的起 184 新疆医科大学学报 J OURNA LO FX I N J I ANG ME D I C A LUN I V E R S I T Y 2 0 0 6J u n.,

19、2 9(6) 始密码子AT G结构; ( 2) 自起始密码子开始无终止 密码子, 同时与质粒连接3 末端无TAA结构形成; ( 3) 自起始密码子开始未对后续G F P荧光蛋白表达 造成移码突变。 R NA干扰是1 9 9 8年由F i r e首次发现并命名 的转录后水平的基因沉默机制。R NA i的主要过程 是 双链R NA( d s R NA) 被核酸酶切割成小分子干扰 性R NA( s i R NA) , 形成R NA诱导的沉默复合体 (R NAi n d u c e ds i l e n c ec o m p l e x,R I S C) , 识别并靶 向切割同源性靶mR NA分子,

20、使其降解, 出现基因 沉默 5, 诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。所 以R NA i技术可以作为研究相应基因或者蛋白质功 能的方法。应用R NA i技术研究相应基因的功能, 需要先建立相应基因的真核表达体系, 所以重组体 的构建对应用R NA i技术调节相关基因在真核细胞 的表达具有现实意义。 本实验为R NA i的前期实验, 目的是获得高纯 度的R NA及其扩增产物, 并重组于真核表达质粒。 本实验方法具有R NA提取速度快、 稳定、 效果好的 特点, 所以其可重复性非常好, 为R T - P C R打下了 好的基础。本实验为后期的R NA i实验建立了可靠 的实验体系, 提供了良好的实验

21、环境和实验依据。 参考文献: 1 J i a n gX L,C u iHF.A na n a l y s i so f1 0 2 1 8u l c e r a t i v ec o l i t i sc a - s e s i nC h i n aJ.W o r l dJG a s t r o e n t e r o l,2 0 0 2,8(1) :1 5 8 - 1 6 1. 2 B a r t n i k W. I n f l a mm a t o r yb o w e ld i s e a s ep o l i s hc o n t r i b u t i o n J. JP h y s

22、 i o lP h a r m a c o l,2 0 0 3,5 4(3) :2 0 5. 3 H o l u bMC,M a k oE,D e b a yT,e ta l . I n c r e a s e di n t e r l e u k i n - 6 i s r e l a t e d t od i s e a s eJ. JC l i nG a s t r o e n t e r o l,1 9 9 8,2 2 8:4 7 - 5 0. 4 G r o t t r u p - W o l f e r sE,M o e l l e rJ,K a r b a c hU,e ta l

23、. E l e b a t e d c e l l - a s s o c i a t e dl e v e l so f i n t e r l e u k i n - 1a n di n t e r l e u k i n - 6i ni n - f l a m e dm u c o s ao f i n f l a mm a t o r yb o w e ld i s e a s eJ.E u rJC l i n I n v e s t,1 9 9 6,2 6(2) :1 1 5 - 1 1 6. 5 S c h e r rM,B a t t m e rK,W i n k l e rT,

24、e t a l . S p e c i f i c i n h i b i t i o no f b c r - a b l g e n ee x p r e s s i o nb ys m a l l i n t e r f e r i n gRNAJ. B l o o d, 2 0 0 3,1 0 1(4) :1 5 6 6 -1 5 6 9. 收稿日期:2 0 0 6 - 0 3 - 1 0 ( 上接4 7 9页) 近些年也有文献报道, p 2 7基因转移能下调S u r - v i v i n表达。S u r v i v i n在食管癌细胞中呈高表达, 而 p 2 7基因转移后, S

25、u r v i v i n表达明显下降, 提示p 2 7 能下调S u r v i v i n的表达 69。S u r v i v i n具有细胞周 期依赖性表达的特性, 主要在G 2/M期表达,p 2 7 能使细胞产生G 1阻滞, 导致S u r v i v i n表达下降, 这 可能是p 2 7下调S u r v i v i n表达的主要原因。 综上所述, 乳腺癌的发生是多因素、 多阶段、 进 行性的过程, 存在着细胞周期调控的异常、 基因的突 变、 缺失或蛋白水平的变化, 在人类肿瘤中广泛存在 p 2 7表达异常( 主要为蛋白水平的下降) , 乳腺癌也 不例外。S u r v i v i

26、 n是迄今为止发现的最强的凋亡抑 制因子, 它的抗凋亡的主要机制是抑制C a p a s e - 3、 7 的活性, 这是凋亡发生的最终步骤, 故S u r v i v i n能 对抗多种刺激所诱导的凋亡, 乳腺癌中存在S u r - v i v i n的高表达。目前, 对p 2 7、S u r v i v i n的研究尚在 初级阶段, 一些作用机制有待进一步阐明。 参考文献: 1 P o l a yK,L e eMH,E r d j u m e n t - B r o m a g eH,e ta l .C l o n i n go f p 2 7ac y c l i n - d e p e

27、n d e n tk i n a s e i n h i b i t o ra n dap o t e n t i a lm e d i a - t o ro fe x t r a c e l l u l a ra n t i m i t o g e n i cs i g n a l sJ.C e l l,1 9 9 4,7 8: 5 9. 2 F e r n a d e zP L,A r c eY,F a r r eX,e ta l .E x p r e s s i o no fp 2 7i s d o w n - r e g u l a t e d i nh u m a np r o s

28、t a t y ec a r c i n o m ap r o r e s s i o nJ. AmJP a t h o l,1 9 9 9,1 8 7:5 6 3. 3 C h a k r a v a r t iA,N o l lE,B l a c kPM,e t a l . Q u a n t i t a t i v e l yd e t e r - m i n e ds u r v i v i n ge x p r e s s i o n l e v e l s a r eo f p r o g n o s t i cv a l u e i nh u - m a ng l i o m a

29、 sJ. JC l i nO n c o l,2 0 0 2,2 0(4) :1 0 6 3 -1 0 6 8. 4 R o h a y e mJ,D i e s t e l k o e t t e rP,W e i g l eB,e ta l .A n t i b o d yr e - s p o n s et ot h et u m o ra s s o c i a t e di n h i b i t o ro fa p o p t o s i sp r o t e i n s u r v i v i n gi nc a n c e rp a i t i e n t sJ.C a n c

30、 e rR e s,2 0 0 0,6 0(7) : 1 8 1 5 - 1 8 1 7. 5 T a mmI,W a n gY,S a uE,e ta l .E x p r e s s i o no fS u r v i v i ni n b r e a s t c a n c e rJ. C a n c e rR e s,1 9 9 8,5 8:5 3 1 5 - 5 3 2 0. 6 张卫国, 吴清明, 于皆平, 等.泛素-蛋白酶体抑制剂对食管癌细 胞增殖的影响J.中国药理学通报,2 0 0 4,2 0(3) :3 5 5 - 3 5 6. 7 张卫国, 吴清明, 王小虎, 等. S u

31、 r v i v i n基因在食管癌中的表达 与生物学特性的关系J.中国医师杂志,2 0 0 3,5(1 0) :1 3 7 8 - 1 3 8 0. 8 S h a mm aA,D o k iY,T s u j i n a k aT,e ta l . L o s so fp 2 7(K I P 1) e x p r e s s i o np r e d i c t sp o o rp r o g n o s i s i np a t i e n t sw i t he s o p h a g e a l s q u a m o u sc e l l c a r c i n o m aJ. O

32、 n c o l o g y,2 0 0 0,5 8(2) :1 5 2 - 1 5 8. 9 L iF,Am b r o s i n iG,C h uE Y,e ta l . C o n t r o lo fa p o p t o s i sa n d m i t o t i cs p i n d l ec h e c k p o i n tb ys u r v i v i nJ.N a t u r e,1 9 9 8,3 9 6 (6 7 1 1) :5 8 0 - 5 8 4. 收稿日期:2 0 0 5 - 1 2 - 1 2 284 新疆医科大学学报 J OURNA LO FX I N J I ANG ME D I C A LUN I V E R S I T Y 2 0 0 6J u n.,2 9(6)