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1、基础论著 应用S Y B RG r e e nI荧光定量R T - P C R测定糖尿病大鼠 肾皮质T G F - 1表达水平 陈英剑 涂晓文 胡成进 【 提要】 S Y B RG r e e nI荧光定量R T - P C R法检测正常、 糖尿病和牛磺酸治疗组大鼠T G F - 1 mR NA/- a c t i nmR NA比值为(7. 00. 8)1 0 -3, ( 6 4. 48. 0)1 0 -3和( 1 6. 72. 0)1 0 -3; 终点法 R T - P C R检测比值分别为0. 2 80. 1 2,0. 5 80. 1 6和0. 4 30. 1 0。与终点法R T - P
2、C R相比,T G F - 1 mR NAS Y B RG r e e nI荧光定量R T - P C R实时检测法, 方便快捷, 敏感特异。 【 关键词】 转化生长因子;S Y B RG r e e nI荧光R T - P C R;终点法R T - P C R; 糖尿病 M e a s u r e m e n to f t r a n s f o r m i n gg r o w t h f a c t o rb e t a1m R N Ae x p r e s s i o n i nr e n a l c o r t e xo f d i a b e t i c r a t s u s i
3、 n g r e a l - t i m er e v e r s e t r a n s c r i p t a s e - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nw i t hS Y B RG r e e nI CHENY i n g - j i a n,T U X i a o - w e n,HUC h e n g - j i n.D e p a r t m e n t o fl a b o r a t o r ym e d i c i n e,G e n e r a lH o s p i t a l o fJ i n a nM i l i
4、 t a r y A r e a,J i n a n 2 5 0 0 3 1,C h i n a 【S u mm a r y】 E x p r e s s i o n l e v e l so fT G F - 1mR NAi nr e n a l c o r t e xo f c o n t r o l g r o u p,d i a b e t i cg r o u p a n dt a u r i n eg r o u pm e a s u r e db yr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v eR T - P C Rw e r e(7. 00.
5、8)1 0 -3,( 6 4. 48. 0) 1 0 -3a n d( 1 6. 72. 0)1 0 -3, r e s p e c t i v e l y .T h ec o r r e s p o n d i n gr e s u l t sw i t he n d - p o i n tR T - P C R m e t h o dw e r e0. 2 80. 1 2,0. 5 80. 1 6a n d0. 4 30. 1 0,r e s p e c t i v e l y . C o m p a r e dw i t he n d - p o i n tR T - P C Rm e
6、t h o d,r e a l - t i m eq u a n t i t a t i v ew i t hS Y B RG r e e nIw a se a s i e r,f a s t e r,s e n s i t i v ea n ds p e c i f i c . 【K e yw o r d s】 T r a n s f o r m i n gg r o w t hf a c t o rb e t a;S Y B RG r e e nIR T - P C R;E n d - p o i n tR T - P C R; D i a b e t e sm e l l i t u s
7、 T G F - 1在肾小球细胞外基质(E CM) 代谢调控中起重 要作用, 其基因表达及生物活性升高是导致肾小球E CM积 聚的重要机制。T G F - 1参与了糖尿病肾病(D N) 的病理生 理过程, 检测肾皮质T G F - 1mR NA水平常用于研究D N发 生发展和判断药物防治机制和效果 1。本研究建立了糖尿 病(DM) 大鼠T G F - 1表达水平的S Y B R G r e e nI荧光定量 R T - P C R方法, 并检测了DM大鼠肾皮质T G F - 1表达水平。 一、 材料与方法 1. DM大鼠模型的建立、 分组和标本留取: 雄性W i s t a r 大鼠随机分为正
8、常对照(N C) 组、DM组、 糖尿病牛磺酸治疗 (DM+T) 组, 每组7只, 后两组给予链脲佐菌素6 0m g/ k g 单次腹腔注射,7 2h后血糖持续高于1 6. 7mm o l/L为DM 成模。DM+T组给予1%牛磺酸水溶液,N C组与DM组予 自来水自由饮用。4周后处死动物, 用生理盐水灌洗肾脏血 管。取肾脏皮质部分约1 5 0m g置于1m l组织保存液R NA l a t e r中, 存-2 0备用。 2.大鼠T G F - 1表达水平的S Y B R G r e e nI荧光定量 R T - P C R方法建立:R NA提取按试剂盒说明书操作。R NA 质量由A2 6 0/A
9、2 8 0比值和0. 7%琼 脂 糖 凝 胶 电 泳 确 定。取 A2 6 0/A2 8 0比值在1. 8以上、 电泳至少出现2条带的R NA进 行下一步实验。取1gR NA, 以O l i g o - d T为引物反转录。 作者单位:2 5 0 0 3 1 济南, 济南军区总医院实验诊断科 实时荧 光 定 量R T - P C R:2 0l体 系 中 含 有0. 5lS Y B R G r e e nI(4 0水溶液) ,1l逆转录产物,1 0l 2H o t s t a r t P C R混合物,31 0p m o l引物(T G F - 1 2和 - a c t i n 1) 及一 定量
10、的M g C l 2。同时设无模板对照、 无R T对照和阳性对 照。扩增条件: 9 52m i n;9 41 0s,5 41 0s,7 22 0s, 低于溶解温度2时检测荧光, 共4 0个循环。扩增完毕进 行熔解曲线分析。对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析特 异性。用样点拟合法分析结果。 3. T G F - 1mR NA的定量: 采用相对定量法。以- a c t i n 为参照, 利用C t值计算T G F - 1mR NA的相对量。T G F -1 mR NA/- a c t i nmR NA用下述公式计算 3: 2 C t(T G F)-C t(A C T)。 终点法定量利用4 0个循环后
11、扩增产物的荧光强度I, 计算 T G F - 1mR NA/- a c t i nmR NA比值:IT G F/IA C T。 4.统计学处理: 数据以-xs表示, 组间差异显著性分 析采用t检验。 二、 结果 1.方法优化和特异性评价:T G F - 1和- a c t i n的最佳 M g C l2反应浓度分别为2. 5mm o l/L和3. 5mm o l/L, 引物浓 度为0. 8mm o l/L和0. 5mm o l/L。T G F - 1和- a c t i n的特 异产物的熔解温度分别为8 7. 2和8 8. 6, 因此在8 5收 集荧光信号。琼脂糖电泳证实扩增产物为单一条带。
12、2. DM大鼠 肾 皮 质T G F - 1表 达 水 平 的 测 定:DM组 T G F - 1表达水平比N C组高9倍多, 给予牛磺酸后T G F -1 841 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 表达水平下降, 但仍明显高于N C组( 表1) 。 表1 牛磺酸对DM大鼠T G F - 1表达水平的影响(-xs) T a b1 E f f e c t so f t a u r i nt r e a t m e n to nT G F - 1 e x p r e s
13、s i o n i nDMr a t(-xs) 组别 G r o u p 例数 n C tT G F- C tA C T T G F - 1m R N A/ - a c t i nm R N A( 1 0 - 3) N C7-7. 1 50. 1 77. 00. 8 DM7-3. 9 70. 1 8*6 4. 48. 0* DM+T7-5. 9 10. 2 3#1 6. 72. 0# 与DM组比较v sDM, *P 0 . 0 1;与N C组比较v sN C,#P 0 . 0 1 3. S Y B RG r e e nI荧光定量R T - P C R与终点法的比较: 终点法检测到N C组、DM
14、组和DM+T组的T G F - 1mR NA / - a c t i nmR NA比 值 分 别 为0. 2 80. 1 2,0. 5 80 . 1 6和 0 . 4 30. 1 0。DM组T G F - 1表达水平比N C组高2倍多, 给予牛磺酸后下降, 但仍明显高于N C组。与S Y B RG r e e nI 荧光定量P C R方法相比, 终点法得到的T G F - 1mR NA相 对含量高, 组与组之间的差别无统计学意义。 三、 讨论 目前检测T G F - 1表达多用竞争R T - P C R和内源参比 基因R T - P C R, 它们属于终点法检测, 由于平台效应的存在, 很难对
15、起始模板准确定量 4。实时荧光定量 R T - P C R在 P C R反应仍在指数扩增期检测反应产物的量。根据在指数 扩增期的产物量来推算初始模板的量。这种技术在精确度、 敏感性、 检测范围、 产出率及P C R后处理步骤方面均优于经 典的定量方法。 目前常用的荧光模式有T a q m a n探针和S Y B RG r e e n。 T a q m a n探针特异性好, 除需要合成序列特异引物外, 还需 合成荧光探针, 成本较高;S Y B RG r e e n 法经济, 只需合成 序列特异引物, 但特异性较差。但通过摸索优化反应条件和 荧光捕捉点, 并用熔解曲线和凝胶电泳证实特异性,S Y
16、 B R G r e e n 荧光定量R T - P C R可以成为一种高敏感性和特异 性的方法 5。 通过优化反应体系、M g C l 2和引物反应浓度, 采用4温 P C R循环, 选择最佳检测点, 本研究建立了检测大鼠T G F - 1表达水平的S Y B R G r e e nI荧光定量R T - P C R方法。该 法简便, 无P C R后处理步骤; 特异性高, 熔解曲线峰和凝胶 电泳条带单一; 在P C R反应指数期分析结果, 精确度和准确 度高。用该法检测DM大鼠肾皮质T G F - 1表达水平, 发现 DM组大鼠T G F - 1表达水平比对照组高达9倍多, 给予牛 磺酸后的D
17、M大鼠T G F - 1表达水平明显下降, 但仍显著高 于N C组。S Y B RG r e e nI荧光定量R T - P C R方法检测到的 T G F - 1水平比用终点法检测明显降低, 仅为其十几分之一 到几十 分 之 一, 差 别 很 大。因 为 二 者 分 析 点 不 同,S Y B R G r e e nI法分析指数扩增期的产物增加, 而终点法是分析扩 增完毕的产物。从P C R动力学方程 6可以算出扩增效率为 0. 8 5, 酶为1. 2 5单位时, 相差1 0 0倍的模板经4 0个循环扩 增后, 产物只相差1. 6 9倍, 而由相应的C t值计算出的结果 为1 0 0倍, 这
18、就可以很好的解释二种方法检测结果的差别。 因此可以说S Y B RG r e e nI法检测结果更接近实际值, 可以 更好地用于研究疾病的病理生理进程, 有利于发现问题。 参考文献 1 徐向进, 吴玉水, 冯修高, 等.槲皮素对糖尿病大鼠肾脏转化生长 因子- 1( T G F - 1) 表达的影响.中国糖尿病杂志, 2 0 0 1,9:4 4 - 4 7. 2 A r i a sM,S a u e r - L e h n e nS,T r e p t a uJ,e ta l .A d e n o v i r a l e x p r e s - s i o no f a t r a n s f
19、o r m i n gg r o w t h f a c t o r - 1a n t i s e n s emRNAi s e f f e c - t i v ei np r e v e n t i n gl i v e rf i b r o s i si nb i l e - d u c tl i g a t e dr a t s .BMC G a s t r o e n t e r o l o g y,2 0 0 3,3:2 9. 3 R a s m u s s e nR.Q u a n t i f i c a t i o no nt h eL i g h t C y c l e r .
20、R a p i dC y c l e R e a l - t i m eP C R:M e t h o d sa n dA p p l i c a t i o n s .H e i d e l b e r g:S p r i n g e r P r e s s,2 0 0 1. 2 1 - 3 0. 4 G i n z i n g e rD G.G e n eq u a n t i f i c a t i o nu s i n gr e a l - t i m eq u a n t i t a t i v e P C R:A ne m e r g i n gt e c h n o l o g
21、yh i t s t h em a i n s t r e a m. E x p e r i m e n - t a lH e m a t o l o g y,2 0 0 2,3 0:5 0 3 - 5 1 2. 5 D e p r e zR L,F i j n v a n d r a a tA C,a n dM o o r m a nA. S e n s i t i v i t ya n d a c c u r a c yo f q u a n t i t a t i v e r e a l - t i m ep o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i
22、o nu s i n g S Y B Rg r e e nId e p e n d so nc D NAs y n t h e s i s c o n d i t i o n s . A n a l y t i c a l B i o c h e m i s t r y,2 0 0 2,3 0 7:6 3 - 6 9. 6 克丙申, 黄象艳, 陈世敏, 等. P C R 扩增试验的动力学数学模型. 遗传,2 0 0 2,2 4:5 5 - 5 8. ( 收稿日期:2 0 0 4 - 0 1 - 1 4 ) 国际著名儿童糖尿病学者贵田嘉一教授病逝 国际著名儿童糖尿病学者、 国际糖尿病联盟儿童糖尿病和国际儿童糖尿病学会领导人、 日本爱媛大学贵田嘉一教授因病 去世。贵田嘉一教授生前一直热心中日两国糖尿病学界的学术交流, 亲自参与组织和主持历届中日糖尿病学术会议,2 0 0 4年 还带病组织参加在桂林举行的第七届中日糖尿病学术会议, 我们对贵田教授的去世深表哀悼。 本刊编辑部 941 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2