抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定.pdf

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1、金垂鳗笠煎擅苤蕉固蕴鎏透昱赶丝腿垒塞抵菹塑照盟鉴定筮! 毖 患者均能耐受。顺而宁( 孟鲁司特) 可以减轻哮喘症状，改善肺 功能，减少哮喘的恶化；但其作用不如吸人型糖皮质激素。也不 能取代皮质激素。所以，孟鲁司特和糖皮质激素联合使用可更 好地控制哮喘，并能减少糖皮质激素的吸入量，以避免吸入高 剂量激素的副作用。 4 参考文献 1A t t w o o dS E 。L q c w i $ c J ，B r o n d e rC S 。e ta E o s i n o p h i l i co e s o p h a g i t i s ：an o - v e lt r e a t m e n tu

2、 s i n gm o n t e l u k a s t J G u t ，2 0 0 3 ；5 2 ( 2 ) ：1 8 1 - 5 2 孟鲁司特I 临床实验协作组白三烯受体拮抗剂孟鲁司特治疗轻中 度哮喘疗效和安全性评价 J 中华结核和呼吸杂志，2 0 0 2 ；2 5 ( 3 ) ： 1 8 0 一1 3 中华医学会哮喘学组支气管哮喘防治指南( 支气管哮喘的定义诊 断、治疗、疗效判断标准及教育和管理方案) 【J ) 中华结核和呼吸 杂志，2 0 0 3 ；2 6 ( 3 ) ：1 3 2 - 8 4 武玉清白三烯受体拮抗剂盂鲁司特的研究进展( J 国外医学 药学分册，2 0 0 3 ；3

3、 0 ( 5 ) ：2 8 4 5 张维溪。李昌崇联合治疗在支气管哮喘治疗中的应用【J 医学综 述，2 0 0 5 ；1 1 ( 9 ) ：8 1 5 6C u r r i eG P ，L e eD K ，H a g g a r tK 。da E f f e c t so fm o n t e l u k a s to ns u r r o g a t e i n f l a m m a t o r y 咄e i nc o r t i c o s t e m i d t r e a t e dp a t i e n t s “ w i t ha s t h n l a 【J A mJR e s

4、 p i rC r i tC a r eM e d ，2 0 0 3 ；1 6 7 ( 9 ) ：1 2 3 2 - 8 7 沈华浩，徐峰支气管哮喘的药物治疗进展 J ) 世界临床药物， 2 0 0 4 ；2 5 ：1 4 4 - 8 2 0 0 9 - 0 2 - 2 4 收稿2 0 0 9 - 0 3 1 0 修回 ( 编辑张永贵胡国义) 抵抗素基因转染诱导肝性胰岛素抵抗细胞的鉴定 金正贤商战平 ( 泰山医学院病理生理学教研室，山东泰安2 7 1 0 0 0 ) 摘要目的将编码人抵抗素基因的p c D N A3 1 ( + ) 真核表达载体在H e p G 2 肝癌细胞中进行稳定转染，以建

5、立抵抗素诱导的肝性胰岛素 抵抗细胞模型。方法实验分3 组：H e p G 2 细胞组；空质粒组；抵抗索基因转染组，通过免疫细胞化学和R T P C R 方法进行抵抗素基因和蛋白表达鉴 定，用微量化的葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的摄取作用。结果免疫细胞化学染色结果表明：与对照组比较，抵抗素基因转染组抵抗索蛋白 平均光密度值显著升高( P 0 0 5 ) 。R T - P C R 扩增产物电泳表明：抵抗素基因转染组有目的条带出现，而对照组 和空质粒组尤目的条带出现，细胞葡萄糖摄取实验表明：抵抗素基因转染细胞对葡萄糖摄取作用下降。结论过度表达人抵抗索基因的胰岛素抵抗 的肝细胞建模成功。 关键词)

6、抵抗素；基因转染；H e p G 2 细胞；胰岛素抵抗 【中图分类号】R 3 6 3 文献标识码 A【文章编号) 1 0 0 5 - 9 2 0 2 ( 2 0 0 9 ) 1 8 - 2 3 0 7 - 0 3 2 型糖尿病的发病机制主要与胰岛素抵抗有关，抵抗素在 啮齿类由脂肪细胞产生并可诱导其产生胰岛素抵抗，而人体内 抵抗素主要由单核细胞产生，其诱导人胰岛素抵抗的作用尚无 定论。本研究拟通过基因转染技术将编码人抵抗素基因的真 核表达载体转染入来源于人的H e p G ：肝癌细胞形成稳定转染， 研究抵抗素诱导人肝细胞性胰岛素抵抗形成的作用，为进一步 研究抵抗素诱导胰岛素抵抗的详细分子机制提供

7、科学的研究 工具。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 细胞、质粒和抵抗素基因真核表达载体H e p G ：细胞， p e D N A 3 1 ( + ) 质粒，p c D N A3 1 ( + ) 人抵抗素基因真核表达 载体均由吉林大学中日联谊医院中心实验室提供。 1 1 2 主要试剂D M E M 高糖培养基( G i b c o 公司) ；小牛血 清( 天津T B D 公司) ；R T P C R 试剂盒和引物( 上海生工公司) ； 转染试剂盒( I n v i t r o g e n 公司) ；抵抗素单克隆抗体( S i g m a 公 司) ；免疫细胞化学染色试剂盒( 福州迈新

8、公司) ；T r i z o l ( 天津 第一作者：金正贤( 1 9 6 5 一) 男。博士，讲师，主要从事糖尿病发病的分子 机制研究。 T B D 公司) ；G 4 1 8 ( 北京鼎国生物技术公司) 。 1 1 3 主要仪器9 r 7 0 0P C R 扩增仪( 美国P E 公司G e n eA m p P C RS y s t e m ) ；G I S - 2 0 0 8 凝胶图像分析系统( 上海培清科技公 司) ，H P I A S - 1 0 0 0 高清晰度彩色图文分析系统( 同济医科大学 千屏影像公司) ；低温高速离心机( 日本H i t a c h i 公司) 。 1 2 方

9、法 1 2 1 细胞培养、转染和筛选将对数生长期的H e p G ：细 胞在转染前1 天接种在2 4 孔板中，使其在转染日生长融合达 6 0 7 0 ，并换不含双抗的D M E M 高糖培养液。转染当日 先把原培养液弃去，用不含血清和双抗的培养液1m l 冲洗细胞 两次，再每孔加4 0 0 斗l 的不含血清和双抗的D M E M 高糖培养 液。转染按试剂盒说明书进行：共准备9 孔，分成三组：对照 组：只加正常培养液；空质粒组：转染未连接抵抗素基因的p c D N A3 1 ( + ) 质粒；抵抗素基因转染组：转染连接人抵抗素基 因的p e D N A3 1 ( + ) 抵抗素基因真核表达载体。

10、转染后4h 吸去转染复合物，每孔加6 0 0 斗l 的正常培养液，转染后7 2h 开 始加8 0 0 斗m l 浓度的C 4 1 8 ( 新霉素) 进行筛选，培养。约2W 后新生克隆出现，继续筛选培养。 1 2 2 抵抗素基因转染细胞的鉴定 1 2 2 1 R T P C R 方法检测抵抗素基因m R N A 细胞总 R N A 提取：按z 0 1 一步法提取总R N A ：引物设计：依据引物 万方数据 设计原则，参照G e n b a n k 上抵抗素基因m R N A 序列，用P r i m e r5 软件进行引物设计。抵抗素上游引物：5 - G T A A A G C T C T C T

11、 ( 瓢T C C T C - 3 ；下游引物：5 - G G A A T G C T G c l T A l - I G C c C T - 3 。扩 增片段长度1 3 7b p 。内参B a e t i n 上游引物：5 C T A C A A T - G A G C T G C G T G T G G C - 3 ；下游弓I 物：5 C A G G T C C A G A C G C A C - G A T G G C 0 3 ；扩增片段长度2 7 0b p 。引物提交上海生物工程技 术有限公司合成。R T - P C R 反应体系：按试剂盒说明将样品 及试剂加入反应管内。R T P C

12、 R 反应条件：4 0 ，3 0r a i n ， 9 4 ，2m i n ；9 4 ，3 0s ，5 5 ，4 5s ，7 2 ，3 0s ，3 0 个循环，7 2 ， 5m i n 。P C R 产物用I 5 浓度的琼脂糖凝胶电泳，用G I S - 2 0 0 8 凝胶图像分析系统进行分析和拍照。 1 2 2 2 免疫细胞化学染色法鉴定细胞爬片的制备：在 2 4 孔板中放置预先高温高压灭菌的切割好的玻片，然后均匀种 植细胞，分三组：对照组，空质粒组，抵抗素基因转染组。每组 三个样本，每个样本3 复孔。待细胞生长融合达9 0 时，取出 玻片，进行免疫细胞化学染色，同时做阴性对照。免疫细胞 化

13、学染色分析：将制备好的免疫细胞化学染色玻片用H P I A S - 1 0 0 0 高清晰度彩色图文分析系统进行分析，每张玻片取6 个视 野，取平均光密度值为免疫细胞化学染色强度定量指标。 1 2 3 抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响应用 微量化的葡萄糖氧化酶法，通过检测细胞培养液上清中的残余 葡萄糖浓度的改变，由此判断抵抗素对细胞摄取葡萄糖作用的 影响；先行噻唑蓝实验( M I T 实验) 检测抵抗素对细胞生长增 殖作用的影响，排除由于细胞增殖引起的细胞数量的差异给实 验带来的误差。 1 2 3 1 抵抗素基因转染对H e p G ：细胞生长增殖作用的影响 ( Mr I I 实验)

14、分三大组：H e p G ：细胞组，空质粒组和抵抗素基 因转染组，每组又分为：对照组，胰岛素组，每组8 个样本。分 别将各组细胞均匀接种在9 6 孔板中，细胞密度2 00 0 0 个孔。 用含1 0 小牛血清的D M E M 高糖培养液培养，待细胞生长至 6 0 融合时，弃去旧培养液，分别加：正常培养液，含胰岛素培 养液，每孔2 0 0 山。实验中的药物浓度：胰岛素浓度1 1 0 - 。m o l L ，药物作用4 8h 后。每孔加含5g L 的M T T2 0 斗l ， 在3 7 。C ，5 的C O ：孵箱中孵育4h ，吸去培养液，每孔加入 1 5 0 出D M S O ，混匀后在孵箱中孵

15、育3 0r a i n 后，在4 9 0n I n 处进 行吸光度检测。 1 2 3 2 细胞葡萄糖摄取实验分组和培养条件同M 1 1 。药 物作用4 8h 后换含1 0 小牛血清不含酚红的R P M I l 6 4 0 培养 液，作用2 4h 后，取培养液上清4 0 斗l ，再取葡萄糖检测试剂盒 中的工作液1 5 0 一，混合均匀，在3 7 0 C ，5 二氧化碳孵箱中孵 育1 5m i n ，取出置酶标仪上在4 9 0l l l a 波长处读取吸光度值。 1 3 统计学处理用S P S S l 3 0 软件包进行数据处理，数据以 孑s 来表示，统计学分析采用t 检验。 2 结果 2 1 R

16、 T - P C R 抵抗素基因m R N A 表达检测结果见图l ，抵抗 素基因转染组细胞R T P C R 扩增产物经1 5 琼脂糖凝胶电泳 分离，结果在1 3 7b p 处可见一清晰扩增条带，与目的条带的位 置一致，而对照组和空质粒组细胞的R T - P C R 扩增产物经电泳 无目的条带显现。 2 2 抵抗素蛋白免疫细胞化学染色结果免疫细胞化学染色 结果表明，抵抗素基因转染组细胞，胞桨中抵抗素蛋白染色呈 棕黄色，而空白质粒组和对照组细胞只出现微弱的黄染。光密 度检测结果：对照组：0 1 4 00 士0 0 0 79 ；空质粒组：0 1 4 02 o 0 0 77 ；抵抗素基因转染组：0

17、 1 7 80 0 0 0 82 ，抵抗素基因转 染组与对照组比较差异显著( P 0 0 5 ) ，见图2 。 1 ：I B - a c t i n ；2 ：抵抗素基因转染组；3 空质粒组；4 ：对照组；5 ：M a r k e r 图l 抵抗素基因R T P C R 扩增产物电泳图谱 图2 抵抗素基因转染H e p G ：细胞免疫细胞化学染色( x 2 0 0 ) 万方数据 金垂竖笠抵蕴塞基固箍垫透昱压丝照璺塞抵抗缉照笪鉴定筮! 翅 2 3 抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影响抵抗 素基因转染对细胞增殖作用的影响见表1 ，胰岛素作用4 8h 后，对正常H e p G ：细胞组和空质粒组细

18、胞有明显的促进增殖作 用，与对照组比较差异显著；而对抵抗素基因转染组细胞无促 进增殖作用。抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用的影 响见表2 。用完全培养液培养4 8h 后，2 4h 细胞葡萄糖摄取 实验结果表明：与对照组比较，空质粒组无显著差异( P 0 0 5 ) ，而抵抗素基因转染组葡萄糖浓度有显著的增加，差异显 著( P 0 0 1 ) ，表明抵抗素有抑制细胞对葡萄糖的摄取作用。 在胰岛素作用下，抵抗素基因转染组与相应的H e p G ：细胞组比 较差异显著( P 0 0 1 ) ，而空质粒组无显著性差异。 表1 抵抗素基因转染对H e p G ：细胞 增殖作用的影响( i4 - $ ，

19、露= 8 ) 与对照组比较：I ) P 0 0 5 ，2 ) P 0 0 1 表2 抵抗素基因转染对细胞葡萄糖摄取作用 的影响( i4 - $ 。m m o V L ，一- - 8 ) 与H e p G 2 细胞组比较：1 ) P O O l 3 讨论 抵抗素是2 0 0 1 年由S t e p p a n 等研究噻唑烷二酮类( T Z D s ) 类药物的药理作用时发现的一种下调基因，当时发现应用 T Z D s 类胰岛素增敏剂后，小鼠的血清抵抗素水平下降，同时该 肥胖小鼠对胰岛素的敏感性增强，从而认为抵抗素可能是联系 肥胖和2 型糖尿病的桥梁。目前认为人体中抵抗素主要来源 于血液中的单核细

20、胞，由于肝脏不表达抵抗素，血循环中的单 核细胞产生的抵抗素( 包括脂肪组织中浸润的巨噬细胞产生的 抵抗素) 将通过血循环作用于肝组织产生作用。动物研究表明 抵抗素可诱导肝源性的胰岛素抵抗的发生。在肝脏高表达抵 抗素的小鼠模型中，存在肝源性胰岛素抵抗，表现为空腹血糖 明显升高，糖耐最减低和高胰岛素血症。高抵抗素使肝脏中胰 岛素对腺苷酸激酶( A M P K ) 的激活作用减弱，胰岛素受体底物- 2 ( I n s u l i nR e c e p t o rS u b s t r a t e s - 2 ，I R S - 2 ) 减少及其酪氨酸残基磷 酸化水平降低啦J ，进而使参与糖异生的磷酸烯

21、醇式丙酮酸羧激 酶和葡萄糖一6 磷酸酶表达增加，胰岛素对肝糖异生的抑制作用 减弱，最终导致肝糖产生增加，表明小鼠体内抵抗素过度表达 对肝性胰岛素抵抗的形成有诱导作用。研究者还用脂肪细胞 培养上清提取物和抵抗素作用于H e p G ：细胞，证实可引起肝细 胞性胰岛素抵抗，特别是在加入抵抗素后可以引起强烈的胰岛 素抵抗，同时发现曲格列酮干预能够对此进行预防，而脂联素 干预没有预防作用，研究者认为这表明抵抗素对人肝源性胰岛 素抵抗的形成有着特异性的诱导作用。另有在小鼠瞬时转 染抵抗素表达载体的实验中也显示H J ：抵抗素在小鼠体内的表 达，诱导了胰岛B 细胞的胰岛素抵抗，使其对葡萄糖刺激的胰 岛素分

22、泌反应降低及受损，导致血糖升高。 肝源性胰岛素抵抗在糖尿病的发病中起着重要的作用。 肝脏通过控制糖原合成和分解，控制糖原异生等途径，维持血 糖稳定。最初关于抵抗素的研究表明，重组抵抗素在体内可引 起正常小鼠的葡萄糖耐量下降，血糖升高。在体外可以阻碍胰 岛素刺激的细胞对葡萄糖摄取，去除抵抗素后可使由饮食诱导 的肥胖小鼠血糖下降2 0 ，胰岛素的敏感性增强，抗抵抗素的 I g G 也可以增加胰岛素刺激的细胞对葡萄糖摄取。抵抗素水平 升高引起胰岛索抵抗和葡萄糖耐量下降，其机制可能是增加了 肝脏的葡萄糖输出，。 本研究采用基因转染技术，完成了抵抗素基因真核表达载 体在H e p G ：细胞的稳定转染，

23、用R T P C R 方法和免疫细胞化学 方法鉴定证实转染成功，抵抗素基因和蛋白质在细胞中表达； 细胞摄取葡萄糖实验结果表明抵抗素基因转染导致细胞对葡 萄糖的摄取下降，这表明抵抗素过度表达的胰岛素抵抗肝细胞 模型建立成功，为进一步研究抵抗素诱导肝源性胰岛素的作用 机制提供了科学的工具和研究手段。 4 参考文献 ： 1 S t e p p a nC M ，B a i U e yS T ，B h a tS 。盯a T h eh o r m o n er e s i s t i nf i n k so b e s i t y t od i a b e t e s ( J N a t u r e ，2

24、 0 0 1 ；4 0 9 ( 1 8 ) ：3 0 7 1 2 2S a t o h LN g u y e nA M i l e sP D e ta A d e n o v i r u sm e d i a t e dc h r o n i c “h y p e r - r e s i s t i n e m i a ”l e a d st o i nv i v oi n s u l i nr e s i s t a n c ei nn o r m a lr a t s J JC l i n I n v e s t ，2 0 0 4 ；1 1 4 ( 2 ) ：2 2 4 - 3 1 3R

25、a n g w a l aS M ，R i c hA S ，R h o a d e sB 。d 以A b n o r m a lg l u c o h o m e o s t a s i s d u et oc h r o n i ch y p e r r e s i s t i n e m i a J ： D i a b e t e s ，2 0 0 4 ；5 3 ( 1 0 ) ：1 9 3 7 - 4 1 4N a k a t aM ，O k a d aT ，O z a w aK ，e ta R e s i s t i ni n d u c e si n s u l i nr e s i

26、 s t a n c ei n p a n c r e a t i ci s l e t st oi n I p a i rS l u e o 一i n d u c e d i n s u l i nr e l e a s e 【J ) B i o c h e m B i o p h y sR e sC o m m u n 。2 0 0 7 ；3 5 3 ( 4 ) ：1 0 4 6 - 5 1 51 , i uY ，W a n gQ ，P a nY B ，e t 以E f f e c t 8o fo v e r - e x p r e s s i n gr e s i s t i nO 1g h - ea n dl i p i dm c t a b o l i a mi nm i c e ( J JZ h e j i a n gU n i vS c iB ，2 0 0 8 ；9 ( 1 ) ：4 4 - 5 0 1 2 0 0 8 - 1 1 - 1 1 收稿2 0 0 9 - 0 5 - 0 3 修回 ( 编辑张铭) 更正：由于作者笔误本刊2 0 0 9 年第2 9 卷第1 6 期发表的“解郁丸联合盐酸氟西汀对老年2 型糖尿病痛性神经病变合并抑郁症的疗 效”一文，第二、三作者姓名有误，现更正为刘宏、田冬霞，特此更正。 万方数据