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1、书书书 文章编号： 1000-5404 （2005） 22-2209-04 论著 抗肝癌单链免疫毒素 HAb25 （scFv） -PE40 的构建及其导向作用的实验研究 胡川闽1， 郭建秀1， 李 鹏1， 陈 安1， 刘彦仿2 （ 1第三军医大学医学检验系临床生物化学教研室， 重庆 400038；2第四军 医大学病理学教研室， 西安 710032） 提 要：目的 构建单链免疫毒素 HAb25 （scFv） -PE40 并探讨其导向细胞毒作用。方法 采用亚克隆技术， 首先将 HAb25 （scFv） 与绿脓杆菌外毒素基因突变子 PE40， 在 ply5 载体上构建 HAb25 （scFv） -P
2、E40 单链免疫毒素基因； 再将其亚 克隆入 pBV220 原核表达载体中，转化 DH5 宿主菌， 温度诱导表达；SDS-PAGE 观察其表达水平并建立目的蛋白的纯化 方法；间接免疫荧光染色鉴定 HAb25 （scFv） -PE40 与肝癌细胞结合的特异性；体外导向细胞毒实验明确其是否具有选择 性靶细胞杀伤活性。结果 限制性酶切图谱和序列分析证实在 ply5 载体上成功地构建了 HAb25 （scFv） -PE40 单链免疫 毒素基因；该单链免疫毒素基因在 pBV220 载体中获得高效表达， 其表达量占菌体总蛋白的 43. 3%； 纯化后的 HAb25 （scFv） -PE40 间接免疫荧光染
3、色显示具有与亲本抗体 HAb25 相同的抗原结合特性； 导向细胞毒实验结果显示 HAb25 （scFv） -PE40 具有明确的选择性靶细胞杀伤活性。结论 已成功构建和高效表达了单链免疫毒素 HAb25 （scFv） -PE40， 该 免疫毒素有选择性地杀伤靶肝细胞的生物活性（P 0. 05） ； 亲本抗体对肝癌细胞和 胃癌细胞 （SCG-7901） 均无杀伤活性， 与 PBS 空白对照组相比 相差不显著 （P 0. 05） 。 图 4 单链免疫毒素 HAb25 （scFv） -PE40 与亲本抗体 HAb25 对肝 癌靶细胞的导向细胞毒作用的对比 Fig 4 Comparative stud
4、y on targeting cytotoxicity of HAb25 （scFv） -PE40 and HAb25 1122 3 讨论 近年来重组免疫毒素已成为导向治疗肿瘤研究的 一个热点， 部分重组免疫毒素已获准进入临床试用， 展 示出良好的应用前景。重组免疫毒素研究已证明， 其 与一般化学耦联法制备的免疫毒素相比优点明显， 主 要表现为： 分子稳定性好， 融合蛋白不易分开； 毒 副作用低， 由于已去除了毒素原有的受体结合域， 毒素 不能与抗体特异抗原以外的分子结合， 使毒素作用局 限在肿瘤局部； 效力高， 其原因是重组免疫毒素仅含 有抗体的可变区部分和毒素的生物毒性部分， 分子量 小，
5、 易穿过血管进入肿瘤中心发挥作用 3。重组免疫 毒素中应用的抗体主要是 scFv 和 Fab 等能保持抗原 结合活性的小分子抗体， 其中 scFv 应用最为广泛， 所 涉及的毒素以绿脓杆菌外毒素应用最为广泛， 取得的 成绩最大 4。绿脓杆菌外毒素 （PE） 是一含 613 个氨 基酸的单链多肽， 分子量 66 103， 该多肽链由 3 个结 构域 （domain） 组成： domain（1 252 aa） ， 为与细胞 膜受体结合的 domain； domain（253 364 aa） ， 为 PE 的转位功能 （即 PE 跨越细胞膜， 进入细胞浆） domain； domain（400 61
6、3 aa） ， 为 PE 的毒性 domain，PE 对 动物几乎所有的细胞有强大的杀伤作用， 它经细胞表 面特异受体介导进入细胞浆后， 裂解氧化型辅酶 （NAD + ） 释放 ADP-核糖， 后者使 EF-2 （延长因子-2） 失活， 抑制细胞的蛋白质合成， 杀伤细胞。利用 PE 制 备的单链免疫毒素， 就是用 ScFv 抗体基因与经过改造 去除了毒素受体结合 domain， 以及其进一步的修饰形 式的毒素基因片段， 经蛋白质工程技术偶联而构建的 双功能融合蛋白 5， 6。 本研究将已经表达证实保留肝癌抗原结合活性的 HAb25 （scFv） 单链抗体基因， 与 PE 切除第 4-252 氨
7、基 酸的突变子 （PE4-452， 因其分子量为约 40 103， 故 称 PE40） 7， 在基因水平上构建成单链免疫毒素基因， 再经亚克隆的方式， 构建成 pBHAb25 （scFv） -PE40 原 核表达载体。与美国 NIH 的 Pastan 博士领导的研究 小组用的含 T7噬菌体 RNA 聚合酶启动子的表达载体 相近 8。本研究选用了我国自己构建的含 噬菌体 PRPL启动子的原核表达载体 pBV220 9， 其表达仅受 温度控制， 更适合将来的规模生产。构建的 pBHAb25 （scFv） -PE40 表达载体， 转化 DH5 宿主菌， 经42 诱 导后， 与未诱导的同一菌株对照，
8、在 SDS-PAGE 电泳图 谱出现一条新的高表达蛋白带， 其分子量大小与预计 的单链免疫毒素融合蛋白的分子量一致， 其表达量占 细菌总蛋白的 43. 3%， 与文献 10 比较有明显的优 势。进一步分析， 高表达的 HAb25 （scFv） -PE40 单链 免疫毒素， 也主要以不溶性的包涵体形式存在于菌体 中， 不溶性的包涵体表达产物需要变性与复性处理后， 才能形成具有功能性的蛋白， 但其不溶性的特点又有 利于去除细菌中包括内毒素在内的细菌杂蛋白， 而便 于表达产物的纯化。从2 h 预处理细胞毒实验结果可 以看出， HAb25 （scFv） -PE40 在所测各浓度范围内对 靶细胞 （HC
9、C-9204 肝癌细胞） 均有明确的杀伤活性， 而亲本抗体 （HAb25） 对肝癌细胞， 以及 HAb25 （scFv） - PE40 对胃癌细胞均不表现出有细胞毒活性， 进一步分 析 HAb25 （scFv） -PE40 对肝癌细胞的杀伤活性， 具有 剂量依赖的特点。此外， 还表现出高浓度时， 其杀伤作 用有平台期的现象。据推测， 这是因为靶细胞仅存在 一定数量的 HAb25 抗体所对应的抗原， 当这些抗原全 部与 HAb25 （scFv） 结合后， 再给予更高浓度的 HAb25 （scFv） -PE40， 其也不能继续与靶细胞发生结合， 同时 也说明 HAb25 （scFv） -PE40
10、对肝癌细胞的杀伤作用， 是在 HAb25 （scFv） 单链抗体的介导下进入靶细胞， 在 靶细胞内 PE40 抑制其蛋白质合成， 最终导致 HAb25 （scFv） -PE40 的选择性细胞毒作用。 参考文献： 1Vallera D A，Burns L J，Frankel A E，et al. Laboratory preparation of a deglycosylated ricin toxin A chain containing immunotoxin directed a- gainst a CD7 T lineage differentiation antigen for pha
11、se I human clinical studies involving T cell malignancies J . J Immunol Methods，1996， 197 （1-2） ： 69 -83. 2Wels W， Biburger M， Muller T， et al. Recombinant immunotoxins and retargeted killer cells：employing engineered antibody fragments for tumor-specific targeting of cytotoxic effectors J . Cancer
12、Immunol Im- munother， 2004， 53 （3） ： 217 -226. 3Chen S Y，Marasco W A. Novel genetic immunotoxins and intracellular antibodies for cancer therapy J . Semin Oncol， 1996， 23 （1） ： 148 -153. 4FitzGerald D J，Kreitman R，Wilson W，et al. Recombinant immuno- toxins for treating cancerJ . Int J Med Microbiol，
13、 2004， 293 （7-8） ： 577 -582. 5 Kreitman R J. Chimeric fusion proteins-Pseudomonas exotoxin-based J . Curr Opin Investig Drugs， 2001， 2 （9） ： 1282 -1293. 6Nagayoshi R， Nagai T， Matsushita K， et al. Effectiveness of anti-folate receptor beta antibody conjugated with truncated Pseudomonas exotoxin in t
14、he targeting of rheumatoid arthritis synovial macrophages J . Ar- thritis Rheum， 2005， 52 （9） ： 2666 -2675. 7Posey J A， Khazaeli M B， Bookman M A， et al. A phase I trial of the sin- gle-chain immunotoxin SGN-10（BR96 sFv-PE40）in patients with ad- vanced solid tumors J . Clin Cancer Res， 2002， 8 （10）
15、： 3092 -3099. 8Pastan I ， Beers R， Bera T K. Recombinant immunotoxins in the treat- ment of cancerJ . Methods Mol Biol， 2004， 248： 503 -518. 9Piao W H，Song X G，Liu M C，et al. Cloning，expression，and puri- fication of HLA-A2-BSP and beta-2m in Escherichia coli J . Protein Expr Purif， 2004， 35 （2） ： 210 -217. 10Kim S H. Expression and purification of recombinant immunotoxina fusion protein stabilizes a single-chain Fv （scFv）in denaturing condi- tion J . Protein Expr Purif， 2003， 27 （1） ： 85 -89. （编辑 薛国文） 2122 第 三 军 医 大 学 学 报 第27 卷