旋毛虫新生幼虫CDNA文库构建及其特异性基因的筛选与鉴定.pdf

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1、C h i n e s ej o u m a lo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e中国兽医杂志2 0 0 8 年( 第4 4 卷) 第8 期 旋毛虫新生幼虫c D N A 文库构建及其 特异性基因的筛选与鉴定 姚春雨1 2 ，汪 ( 1 中国农业大学动物医学院，北京海淀1 0 0 1 9 3 ；2 明1 ，别、国权2 内蒙古民族大学动物科技学院，内蒙古通辽0 2 8 0 4 2 ) 摘要：构建旋毛虫新生幼虫c D N A 文库并对旋毛虫新生幼虫期特异性基因进行筛选与鉴定，筛选出期特异性的基凶片 段。用x Z A P E x p r e s s 载体成功地

2、构建r 旋毛虫新生幼虫的c D N A 文库，并用放射性同位素r ”P 标记c D N A 探针对筛选 出的阳性克隆进行鉴定。所构建的c D N A 文库容量为1 9 2 1 0 6 ，重组效率为9 8 6 ，所有的克隆片段都在o 5 2 0k b 之 间，筛选获得7 个阳性克隆，其大小在1 4k b 左右；用放射性同位素口_ ”P 标记c D N A 探针后，与旋毛虫成虫、肌幼虫、新生幼 虫及成虫新生幼虫c D N A 文库质粒D N A 进行S 0 u t h e r n 印迹杂交，结果与新生幼虫和成虫、新生幼虫c D N A 文库质粒D N A 有杂交而与成虫、肌幼虫c D N A 文库

3、质粒D N A 不杂交。该基凶是新生幼虫期所特有的c D N A 片段。 关键词：旋毛虫；c D N A 文库；期特异性基因；筛选；鉴定 中图分类号：Q 7 8 9 文献标识码：A 文章编号：0 5 2 9 6 0 0 5 ( 2 0 0 8 ) 0 8 一o 0 0 5 一0 3 c D N Al i b r a r yc o n s t r u c t i o n ，s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z a t i o no fs t a g e s p e c i f i cg e n eo fn f e 庇f 珂P Z Z 口s p f

4、 ，口Z Z sn e o g e n e s i sl a r V a Y A OC h u n y u l “，W A N GM i n 9 1 ，S U NG u o q u a n 2 ( 1 C o l l e g eo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e ，C h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ，B e 巧i n g1 0 0 1 9 3 ，C h i n a ； 2 A n i m a lS c i e n c ea n dT e c h n o l o g yC o l l e

5、 g e ，1 n n e rM o n g o l i a nU n i v e r $ i t yF o rN a t i o n a l l t y ，T o n g l i a o0 2 8 0 0 0 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：C o n s t r u c t i n gc D N Al i b r a r yo f 丁I r i c i 行P Z Z 口s p i r 口Z i sn e o g e n e s i s1 a r V a ，s c r e e n i n ga n dc h a r a c t e r i z i n gt h e

6、s p e c i f i co fT r i c i 咒已Z Z 口s 户i 7 一n Z i sn e o g e n e s i sl a r v a ，s t a g es p e c i f i cg e n ef r a g m e n tw a ss e l e c t e d C o n s t r u c t i n gc D N Al i b r a r yo f 丁r i c i 咒P Z Z ns 户幻r 口Z i sn e o g e n e s i sl a r v ab y 入Z A P E x p r e s sc a r r i e r ，a n dm a r

7、 k i n g c D N Ab o u g i eb yi s o t o p ea 一3 2P ，c h a r a c t e r i z i n gt h ep o s i t i v ec l o n e s C a p a c i t yo fc D N Al i b r a r yc o n s t r u c t e di s 1 9 2 1 0 6 ，r e c o m b i n a t i o ne f f i c i e n c yi s9 8 6 ，a l lt h ec l o n e ds e q u e n c eareb e t w e e nO 5 2 O

8、k b ，g e t t i n g s e v e np o s i t i v ec l o n e su s i n gh y b r i d i z a t i o no fn u c l e i ca c i df o rc D N Al i b r a r yo n e o g e n e s i sI a r v a ，a b o u t 1 。4k b ，a f t e rm a r k i n gc D N Ap r o b e sb yi s o t o p ea 一3 2P ，S o u t h e r n b l o ta n a l y s i si n d i c

9、a t e d t h eh y b r i d i z a t i o n w i t hc D N Al i bp l a s m i dD N Ao ft r i c h i n al a r v a ，i m a g o ，n o to fi m a g o ，m y o l a r v a T h eg e n ei sc D N Al i b r a r y s p e c i “cf o rT l r i f i 咒P Z 口5 户i r 口Z i sn e o g e n e s i sl a r v a K e yw o r d s ：T r i f i 恕P Z Z ns

10、户i r n Z i 5 ；c D N Al i b r a r y ；s t a g es p e c i f i c i t yg e n e ；b o l t i n g ；c h a r a c t e r i z e a t i o n 旋毛虫病( T r i c h i n e I I o s i s ) 是一种流行广泛，危 害十分严重的人兽共患寄生虫病。全世界有1 0 0 多 种动物和6o o o 多万人感染此病，因此它不仅使畜 牧业生产遭受巨大的经济损失，而且也严重威胁着 人类的健康。目前，我国是世界旋毛虫病危害最为 严重的少数几个国家之一。 新生幼虫期和成虫期足旋毛虫3 个时

11、期中的两 个侵入期，而新生幼虫和成虫对机体的侵入除机械 收稿日期：2 0 0 7 0 9 3 0 作者撷介：姚春雨( 1 9 6 5 一) ，男( 蒙古族) 副教授。博士，主要从事 动物性食品安全方匾研究，E m a i l ：”o c h u n y u 6 5 y a h 。o c o m c “ 作用外，势必依靠一定的特有的侵袭因子，而这些侵 袭因子极有可能就是新生幼虫和成虫与肌幼虫相比 所特有的致病性因子和强保护性抗原。 本试验就是利用旋毛虫新生幼虫期特异性探 针，在旋毛虫新生幼虫c D N A 文库巾，筛选出期特 异性的基因片段，为研制新型的、高效的、强免疫原 性的旋毛虫疫苗打下基础

12、。 1 材料与方法 1 1 实验动物W i s t a r 大鼠和昆明系小鼠；虫种： 中国河南猪旋毛虫分离株( 国际编号I S S 5 3 4 ) ；试 剂及试剂盒：地高辛标记检测试剂盒购自B O E 万方数据 6 中国兽医杂志2 0 0 8 年( 第4 4 卷) 第8 期 C h i n e s eJ o u r n a lo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e H R I N G E RM A N N H E I M 公司；放射性同位素 a 一3 2 P d C T P 购自北京亚辉生物医学工程公司；旋 毛虫肌幼虫、成虫及成虫和新生幼虫混合c D N A

13、 文 库由本实验室提供；入Z A P E x p r e s s 载体包装试剂 盒和m R N A 分离纯化试剂盒购自S T R A T A G E N G 公司；c D N A 合成试剂其他试剂购白P R ( ) M E G A 公司。 1 2c D N A 文库的构建 收集旋毛虫新生幼虫， 采用异硫氰酸胍一步法抽提总R N A 利用m R N A 分离纯化试剂盒提取及纯化D N A 。按c D N A 合成 试剂盒说明操作，按顺序进行第一链合成、第二链的 合成、末端平直、连接E c c ，R 上接头、E f o R 工末端磷 酸化、X oI 消化、过柱分离将合成的c D N A 连接在 入

14、Z A P 表达载体上，然后包装。 1 3 c D N A 文库质粒D N A 的提取 切割c D N A 文库及转染扩菌，取新生幼虫c D N A 文库1 0 8P F U 噬菌体，加入X L l 一B l u e 宿主菌( O D 一1 ) ，1 0 9 辅 助噬菌体，收集p h a g e m i d 。取新生幼虫c D N A 文库 的p h a g e m i d1p L 加入2 0 0 弘LX L O R 宿主菌 ( 0 D 6 0 0 一1 ) ，3 7 孵育1 5m i n ，再加入4 0 肚L5 N Z YB r o t h ，3 7 孵育4 5m i n ，取其中的l o

15、o 弘L 均 匀涂布于9 0m mL B K a n a + ( 5 0 “g m I 。) 琼脂平板， 3 7 过夜培养。取新生幼虫c D N A 文库的p h a g e m i d3 1 0 8P F U ，加入X L ( ) R 宿主菌( O D 。一1 ) 1 5 m L ，3 7 孵育2 0m i n ，加入2 0 0m LL BB r o t h ( 含 5 0 “g m L 卡那霉素) ，3 7 振荡培养2 0h ，制备质 粒D N A ，测定D N A 浓度后一2 0 保存备用。 1 4c D N A 探针的放射性标记用放射性同位素 a 一3 2 P d C T P 标记，

16、1 c D N A 探针由本实验室提供，取 模板D N A ( c D N A 探针) 1 0 弘L ( 约1 0 0n g ) 加随机引 物2 肛L 、无菌四馏水2 肛L 混匀，置9 5 水浴3m i n 后迅速置于冰水浴5m i n 。加入1 0 的B u f f e r 、 d N T P 混合物各2 5 弘L 、a 一3 2P d C T P5 肛I 。( 1 0 弘C i 肛L ) 用无菌四馏水定容至2 4 肛L ，然后加入1p L E x o f r e eK l e n o wF r a g m e n t ，3 7 反应l Om i n 。 6 5 加热5m i n 使酶失活，

17、9 5 加热3m i n 后迅速 置于冰水浴中冷淬备用。 1 5质粒D N A 的酶切 取旋毛虫成虫c D N A 文 库质粒D N A ，肌幼虫c D N A 文库质粒D N A ，新生幼 虫c D N A 文库质粒D N A ，各加入B u f f e r 、E c o R 工、 X oI ，最后用无菌水加至5 0 “L 。3 7 酶切l Oh 。 1 6 S o u t h e r n 印迹杂交 2 1将酶切后的旋毛虫成 虫、肌幼虫、新生幼虫、成虫新生幼虫c D N A 文库 质粒D N A 样品作琼脂糖凝胶电泳，待D N A 片段 分离后，用真空抽滤转移装置将变性后的D N A 转 移

18、于尼龙膜上，干燥后交联、杂交、洗脱、放射自 显影。冲洗X 线底片后观察结果。 1 7 旋毛虫新生幼虫期特异性基因的筛选将 c D N A 探针用地高辛标记( 按地高辛标记试剂盒说 明标记) ，然后铺板、制膜、杂交、洗膜、检测、显色 观察结果。从琼脂平板上将与尼龙膜上阳性斑所 对应的噬菌斑抠下，溶解于1m LS MB u f f e r ，然后 取出1 0 “I 。作1 ：1 0 稀释，继续新一轮杂交筛选， 最后挑选出单一的、杂交信号强的阳性噬菌斑进 行P C R ，将P C R 后的样品用0 7 琼脂糖凝胶 电泳。 2 结果 2 1c D N A 文库构建结果 所构建的c D N A 文库 容

19、量为1 9 2 1 0 6 重组效率为9 8 6 ，利用辅助噬 菌体对新生幼虫文库的重组入Z A P 进行体外切 割，制备了重组噬菌体质粒p B K C M V ，并用E R I + X o _ 【对噬菌体质粒p B K C M V 进行酶切鉴定 ( 见图1 ) ，所有的克隆片段都在o 5 2 Ok b 之间， 表明所构建的c D N A 文库对m R N A 的覆盖面 很大。 2 2 期特异性基因筛选应用经过鉴定为期特异 性的c D N A 探针进行地高辛标记，以其对新生幼虫 c D N A 文库进行核酸杂交筛选，经过三轮筛选获得 7 个阳性克隆，进行P C R 后琼脂糖电泳，结果其大 小在

20、1 4k b 左右( 见图2 ) 。 图lc D N A 文库的酶切鉴定 M ：p B R 3 2 8 一B g I H i n f IM a r k e r 2 3 期特异性c D N A 探针鉴定用放射性同位素 a 一3 2 P 标记c D N A 探针后，与旋毛虫成虫、肌幼虫、新 生幼虫及成虫新生幼虫c D N A 文库质粒D N A 进 行S o u t h e r n 印迹杂交，结果与新生幼虫和成虫新 万方数据 C h i n e s eJ o u m a lo fV e t e r i n a r yM e d i c i n e 中国兽医杂志2 0 0 8 年( 第4 4 卷)

21、第8 期 7 生幼虫c D N A 文库质粒D N A 有杂交而与成虫、肌 幼虫c D N A 文库质粒D N A 不杂交，因此该探针是 新生幼虫期所特有的c D N A 片段( 见图3 ) 。 图2 阳性克隆P C R 产物电泳分析 M ：D l ，一1 50 0 0M a r k e r ；1 ，2 ，3 。4 ，5 。6 ，7 ：阳性克隆 图3 探针S o u t h e m 印迹结果 1 ：成虫c D N A 片段；2 ：成虫新乍幼虫c D N A 片段； 3 ：肌幼虫c D N A 片段；4 ：新生幼虫c D N A 片段( 1 0 肚g ) ； 5 ：新生幼虫c D N A 片段(

22、 1 5 肚g ) 3 讨论 构建于入Z A PE x p r e s s 载体的c D N A 文库可直 接用目的蛋白的抗体进行筛选，但抗体必须有效地 识别变性蛋白。使用来自高滴度多克隆抗血清的抗 体进行，既容易也敏感，但是由于动物和人血清中存 在抗大肠杆菌和噬菌体蛋白的抗体，容易产生非特 异性交叉反应，必须对其进行预处理。核酸探针杂 交是从c D N A 文库中筛选目的克隆的最常用、最可 靠的方法，它可在各种严格性不同的条件下使用，从 而最大限度地减少发生不希望出现的交叉反应机 会。核酸杂交筛选法可以同时迅速地分析数目极大 的克隆，既不要求它们是全长c D N A 克隆，也不要 求宿主细胞

23、合成具有抗原性或生物学活性的产物， 具有很大的优越性口 。 关于寄生虫c D N A 文库的构建，国内外报道较 多，在猪囊虫、血吸虫、弓形虫、利什曼原虫等都取得 了一定进展 3 ，但在旋毛虫方面，国外有肌幼虫 c D N A 文库构建的报道L 7 。1 川，从旋毛虫肌幼虫筛选到 的主要有p 4 6k D a ，p 4 9k D a ，p 5 3k D a 、H s p 7 0k D a 克隆。V a s s i l a t i s ( 1 9 9 2 ) 报道 1 2 分析了旋毛虫肌幼 虫一4 3k D a 的糖蛋白。国内学者雷莉等( 1 9 9 7 ) 1 3 3 报道构建了旋毛虫肌幼虫c

24、D N A 文库，重组子为 5 3 1 0 5 个，重组率9 0 。刘明远等( 1 9 9 8 ) 1 4 3 构建了 中国旋毛虫分离株成虫和新生幼虫基因文库，并初 步筛选到一种特异性基因。 参考文献： 1 奥斯伯F ，布伦特R ，金斯顿RE ，等精编分子生物学实验指南 M 颜子颖。手海林，译北京：科学出版社，1 9 9 8 ：5 5 7 2 2 J 萨姆布鲁克，EF 弗里奇，T 曼尼阿蒂斯分子克隆 M 金冬 雁。黎孟枫，等译北京：科学出版社，1 9 9 8 ：4 2 8 4 3 0 3 翟春生，唐雨德，顾志香猪带绦虫六钩蚴抗原基囡的克隆与表 达 J 中国兽医学报，1 9 9 7 ，1 7 (

25、 5 ) ：4 7 0 一4 7 1 4 沈定文，詹希美，刘启文日本血吸虫c D N A 文库的免疫筛选 和融合蛋白的表达 J 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1 9 9 7 ， 1 5 ( 4 ) ：2 5 1 5 夏爱娣，王克敏，赵涵芳，等弓形虫c D N A 文库的构建 J 中 国寄生虫学与寄生虫病杂志，1 9 9 6 ，1 4 ( z ) ：1 2 4 1 2 7 6 敬保迁，胡孝紊，陈建平，等杜氏利f f l 曼原虫c D N A 文库的构 建 J 中国寄生虫学与寄生虫病杂志，1 9 9 7 ，1 5 ( 6 ) ：3 7 0 一3 7 2 7 s u g a n eK ，M a t s

26、 u u r aT M o l e c u l a ra n a l y s i so ft h eg e n ee n 一 d i n ga na n t i g e n i cp 0 1 y p e p t i d eo fT r i c h i 订P Z ns p i r n Z i si n f e c t l v e l a r v a e J JH e l m i n t ，1 9 9 0 。6 4 ( 1 ) ：1 - 8 8 s uxz ，P r e s t w o o dAK ，M c G r a wRA c l o n i n ga n de x p r e s s i o

27、 no fc o m p l e m e n t a r yD N Ae n c o d i n ga na n t i g e no fT ，i 西i 竹P Z 一 如s p i r 口如 J M o lB i o c h e mP a r a s i t o l ，1 9 9 1 ，4 5 ( 2 ) ：3 3 卜3 3 6 9 Z a r l e n g aDS ，G a m b l eHR M o l e c u l a rc l o n i n ga n de x p r e s s i o n o fa ni m m u n o d o m i n a n t5 3 一k I )

28、ae x c r e t o r y _ s e c r e t o r ya n t i g e n f r o mT r i 曲i n P 如s 户i r n z 厶m u s c l el a r v a e J M o lB i o c h e mP a r a s i t o l ，1 9 9 0 ，4 2 ( 2 ) ：1 6 5 1 7 4 1 0 V a y s s i e rM ，l e G u e r h j e rF ，F a b i e nJF ，以口z T r i c h i n e U o s i s l C T 9P r o c e e d i n g so ft

29、 h eN i n t hI n t e r n a t i o n aC o n f e r e n c eo n T r i c h i n e l l o s i s J P a r a s i t o l o g y ，1 9 9 6 ，1 9 2 2 ： 1 1 V a y s s i e rM ，l eG u e r h i e rF ，F a b i e nJF ，矗n z c l o n i n ga n da n a l y s i so faT r i f i ”P Z Z nb r i t o v ig e n ee n c o d i n gac y t o p l a

30、 s m i eh e a t s h o c kp 呻t e i no f7 2k D a J P a r a s i t o l o g y ，1 9 9 9 ，1 1 9 ( P t1 ) ： 8 l 一9 3 1 2 V a s s i l a t i sDK ，D e s p o m m i e rDD ，P 0 1 v e r eRI ，以口z T ，i c i n P f Z 口户5 P “d o s p i ，诅Z i ss e c r e t e sap r o t e i nr e l a t e dt ot h eT i c i 行P Z 趾 5 声i ，4 f 如4 3k D a9 1 y c o p r o t e i n J M o lB i o c h e mP a r a s i t 0 1 ，1 9 9 6 ， 7 8 ( 1 2 ) ：2 5 3 1 1 3 雷莉，翟朝阳，田玉，等旋毛虫c D N A 文库的构建 刀实用寄 生虫病杂志，1 9 9 7 ，5 ( 1 ) ：2 1 2 3 1 4 刘明远，徐克成。黎成耀，等中国旋毛虫分离株成虫和新生幼 虫基因文库的构建及筛选 J 中国兽医学报，1 9 9 8 ，1 8 ( 2 ) ： 1 4 7 1 5 0 万方数据