《改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法.pdf》由会员分享，可在线阅读，更多相关《改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法.pdf（4页珍藏版）》请在三一文库上搜索。
1、书书书 第 34 卷 第 2 期河南师范大学学报 （自然科学版）Vol. 34 No.2 2006 年 5 月Journal of Henan Normal University（Natural Science）May. 2006 文章编号： 1000 -2367 （2006） 02 -0094 -04 改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法 张文学， 李 莉， 赵良真， 刘文玲， 徐存拴 （河南师范大学 生命科学学院， 河南 新乡 453007） 摘 要：介绍一种分离、 鉴定肝实质细胞的新方法. 采用恒流泵、 不锈钢滤网等简易灌流装置， 对成年大鼠进 行原位灌注分离肝实质细胞； 并根据肝实
2、质细胞能组成型表达 6 - 磷酸葡萄糖酶这一特性， 采用酶细胞化学技术鉴 定肝实质细胞. 经本实验改进的肝实质细胞分离方法具有简便、 快捷、 可靠的特点， 为进一步研究肝实质细胞的各种 功能奠定了基础. 关键词：大鼠；肝实质细胞； 6 - 磷酸葡萄糖酶 中图分类号：Q 291 文献标识码：A 肝实质细胞是肝脏行使其功能的主要细胞， 也与肝脏的多种疾病如肝纤维化、 肝癌等的发生具有密切关 系. 近年来研究肝脏各种疾病及肝脏损伤修复机制的实验主要是在整个肝组织水平上进行的. 而实际上， 许 多研究如肝细胞移植 1 -2、 基因治疗3 -4、 药物毒性评价及药物代谢动力学研究5 -7等的进行， 需要
3、将肝实 质细胞进行分离、 鉴定. 目前分离肝实质细胞多采用肝原位胶原酶灌注消化的方法； 细胞鉴定方法主要是在 光学显微镜下观察细胞的形态 8. 上述方法的可信度易受某些因素影响而变化. 本实验提出一种鉴定肝实 质细胞的新方法， 即用 6 - 磷酸葡萄糖酶的细胞化学技术来鉴定肝实质细胞， 可提高细胞鉴定的可信度， 为 进一步研究肝细胞的各种功能奠定基础. 1 材料与方法 1. 1 实验材料 成年健康 SD （Sprague-Dawley， SD） 大鼠， 由河南师范大学生命科学学院实验动物繁育中心提供， 雌雄各 半， 体重 200 230 g. 1. 2 主要试剂 型胶原酶、 DNase 和 6
4、 - 磷酸葡萄糖钠均为 Sigma 产品， 其他化学试剂至少为分析纯. 1. 3 肝细胞分离的方法 1. 3. 1 溶液配制 1. 3. 1. 1 GBSS 无钙液： NaCl 8 g， KCl 0. 38 g， Na2HPO412H2O 0. 3 g， KH2PO40. 025 g， NaHCO30. 25 g， EGTA 0. 19 g， Glc 1 g 加入 DDW 至 1 000 ml， pH 7. 4， 渗透压 280 mOsmol/ Kg （FM-5J 冰点渗透压计测量） . 1. 3. 1. 2 GBSS 溶酶液： NaCl 8 g， KCl 0. 38 g， Na2HPO412
5、H2O 0. 25 g， KH2PO40. 025 g， NaHCO30. 25 g， CaCl20. 13 g， Glc 1 g 加入 DDW 至 1 000 ml， pH7. 5， 渗透压 300 mOsmol/ Kg. 1. 3. 1. 3 PBS 液： NaCl 8 g， KCl 0. 2 g， Na2HPO412H2O 2. 9 g， KH2PO40. 02 g， 加入 DDW 至1 000 ml， pH7. 4， 渗透压 280 mOsmol/ Kg. 收稿日期： 2005 -06 -13 基金项目： 国家自然科学基金 （30270673） ； 河南省动物学省级重点学科基金资助 作
6、者简介： 张文学 （1957 - ） ， 男， 河南安阳人， 河南师范大学副教授， 主要从事动物学研究. 1. 3. 1. 4 混合培养液：RPMI -1640 1 包 （10. 4 g） ， DMEM 1 包 （13. 4 g） ， 丙酮酸钠0. 22 g， 谷氨酰胺0. 79 g， 碳酸氢钠 4 g， 加入 DDW 至2 000 ml， 混匀后加2 mM L 甘氨酸， 以0. 1 N HCl 调 pH7. 2 左右， 0. 22 m微孔滤 膜抽滤灭菌. 1. 3. 1. 5 混合酶液： 0. 05%胶原酶 +0. 004%DNase +5 ml 小牛血清/100 ml. 1. 3. 2 细
7、胞分离和培养 动物麻醉后常规消毒， 无菌条件下打开腹腔， 暴露门静脉. 将 150 单位的肝素注入下腔静脉 （0. 2 ml /100 g体重） . 先经门静脉插管用恒流泵以10 ml/ min 的速度灌注 GBSS 无钙液， 洗净肝内血液， 再经 门静脉体外循环以 30 ml/ min 的速度灌注 0. 05%型胶原酶和 0. 004% DNase 的混合液， 持续约 10 min. 取 下肝脏剥离肝被膜， 轻轻分离并用冷 PBS 冲洗肝组织， 用 200 目尼龙网滤过后， 得全肝细胞悬液. 以 200 r/ min的速度离心 10 min， 沉淀细胞为肝实质细胞. 用 PBS 洗 2 次，
8、 以 500 r/ min 的速度离心， 每次5 min， 然后对所得肝实质细胞进行细胞计数， 并采用台盼蓝拒染实验进行细胞活力测定. 将分离的细胞放入混合培 养液中培养 72 h. 1. 3. 3 细胞鉴定 1. 3. 3. 1 形态学鉴定法 在光学显微镜下根据肝实质细胞的形态特点来鉴定. 1. 3. 3. 2 葡萄糖 -6 - 磷酸酶鉴定法 工作液配制： 1 M 马来酸： 11. 607 g 马来酸于 100 ml DDW 中 4 保存. 1 M Tris： 12. 114 g Tris 于 100 ml DDW 中 4 保存. 0. 125%D - 葡萄糖 -6 - 磷酸钠盐： 0. 1
9、25 g 葡萄糖 -6 - 磷酸钠于 100 mlDDW 中 4 保存. 0. 2 M Tris-马来酸缓冲液 （pH6. 5） ： 1 M 马来酸 10 ml + 1 M Tris10 ml + 0. 5 N NaOH 16 ml + DDW 16 ml 于 4 保存. 孵育液： 0. 125%D - 葡萄糖 -6 - 磷酸钠盐 20 ml +0. 2 M Tris - 马来酸缓冲液 （pH6. 5） 20 ml + 3% 硝 酸铅 3 ml + DDW 7 ml 于 4 保存. 方法步骤： （1）涂片： 将分离的肝实质细胞以适当浓度滴加到经过多聚赖氨酸处理的载玻片上， 室温下自然干燥. （
10、2）固定： 用 4 冷丙酮固定 10 min. （3）孵育： 在葡萄糖 -6 - 磷酸钠盐作用液中 37 孵育 30 min. （4）冲洗： 自来水冲洗后用 DDW 冲洗. （5）显色： 0. 5%硫化铵作用 1 min， DDW 冲洗. （6）封片： 甘油明胶封片. （7）镜检. 2 结 果 对分离得到的细胞进行细胞计数， 细胞的得率为每个肝约为 3 108. 采用台盼蓝拒染实验进行细胞活 力测定， 细胞活力在 95%以上. 形态学观察可见分离得到的细胞形态完整， 体积较大， 极少见到小细胞. 培养 一段时间（约 24 h）后细胞贴壁伸展， 生长良好， 形态呈多角形， 细胞核圆形， 胞质透明
11、度高， 具有明显的肝 实质细胞特征， 如图 1、 2 所示. 用葡萄糖 -6 - 磷酸酶细胞化学法鉴定， 可见细胞内有棕黄色的硫化铅颗粒. 因为肝脏中只有肝实质细胞含有葡萄糖 -6 - 磷酸酶， 此实验结果说明分离的细胞确实是肝实质细胞. 细胞 内葡萄糖 -6 - 磷酸酶含量不同， 其颜色深浅也有一定差别， 如图 3、 4 所示. 3 讨 论 肝实质细胞的分离基本上分为用 0. 05%胶原酶原位消化 9和 0. 025%胶原酶二步消化两种方法10. 文 59第 2 期 张文学等： 改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法 献 9 将灌注液中加入少量的 EDTA， EDTA 可以和细胞外基质中的
12、 Ca2 +结合， 增加细胞的分散程度， 但在一 定程度上降低了细胞的活率； 文献 10 降低了胶原酶的浓度， 这样在一定程度上提高了细胞的活率， 但是却 降低了细胞的得率. 因此细胞活率和细胞得率在细胞分离过程中是一对相互矛盾的参数. 与文献 9 相比， 本实验有两点改进： 第一， 采用 0. 05%胶原酶原位消化， 但在灌注液中加入 EGTA， EGTA 的螯合效果比 ED- TA 的效果好， 在一定程度上可减轻对肝实质细胞的损伤； 第二， 本实验减少了手术操作和灌注所消耗的时 间， 同时相对减少酶液的作用时间. 通过上述两点改进， 在保持细胞得率的同时， 活率能达到 95% 以上. 由于
13、 肝实质细胞比较大， 许多文献中关于肝实质细胞的鉴定都是根据光学显微镜下的细胞大小来确定. 实际上细 胞的大小往往受某些因素的影响而变化， 仅仅根据细胞的大小来确定细胞的种类是不准确的. 本实验在鉴定 分离的肝实质细胞时， 不仅仅依据光学显微镜下形态学特征， 而且还根据肝实质细胞组成型的表达葡萄 糖 -6 - 磷酸酶这一特点， 首次提出应用酶细胞化学的方法来鉴定肝实质细胞. 肝脏是体内糖代谢的场所， 葡 萄糖 -6 - 磷酸酶在葡萄糖代谢过程中起重要作用， 并且只在肝实质细胞中表达. 因此， 我们利用该生化指标 来鉴定肝实质细胞更进一步提高了实验数据的准确性和鉴定结果的可信度， 为进一步研究肝
14、实质细胞的生 物学行为提供了重要的基础. 参 考 文 献 1 Hill E，Boontheekul T，Mooney DJ. Regulating activation of transplanted cells controls tissue regeneration J . PNAS， 2006， 103 （8） ： 2 494 -2 499. 2 Borozan I，Chen L，Sun J，et al. Gene expression profiling of acute liver stress during living donor liver transplantation J
15、. Am J Transplant， 2006， 6 （4） ： 806 -824. 3 Zhang HG， Xie J， Xu L， et al. Hepatic DR5 Induces Apoptosis and Limits Adenovirus Gene Therapy Product Expression in the Liver J . Journal of Virology， 2002， 76 （11） ： 5 692 -5 700. 4 Naoto Ohi，Yuji Nishikawa，Takuo Tokairin，et al. Maintenance of Bad Phosp
16、horylation Prevents Apoptosis of Rat Hepatic Si- 69河南师范大学学报 （自然科学版） 2006 年 nusoidal Endothelial Cells in Vitro and in Vivo J . Am J Pathol， 2006， 168 （4） ： 1 097 -1 106. 5 Ragini Vuppugalla， Reza Mehvar. Hepatic Disposition and Effects of Nitric Oxide Donors：Rapid and Concentration-Dependent Reducti
17、on in the Cytochrome P450-Mediated Drug Metabolism in Isolated Perfused Rat Livers J . J Pharmacol Exp Ther， 2004， 310 （2） ： 718 -727. 6 Thomas A Kocarek，Janice M Kraniak，Anita B Reddy. Regulation of Rat Hepatic Cytochrome P450 Expression by Sterol Bio- synthesis Inhibition： Inhibitors of Squalene S
18、ynthase Are Potent Inducers of CYP2B Expression in Primary Cultured Rat Hepato- cytes and Rat Liver J . Mol Pharmacol， 1998， 54 （3） ： 474 -476. 7 Pieter P. Annaert，Kim LR. Brouwer. Assessment of Drug Interactions in Hepatobiliary Transport Using Rhodamine 123 in Sandwich-cultured Rat Hepatocytes J .
19、 Drug Metab. Dispos， 2005， 33 （3） ： 388 -394. 8 张艳华， 彭仁琇， 张志善， 等. 大鼠肝实质细胞及非实质细胞分离和质量检测 J . 中国药理学通报， 2000， 16（3） ： 341 - 343. 9 郭海涛， 王英杰， 刘 俊， 等. 体外灌流装置分离肝细胞初步探索 J . 第三军医大学学报， 2003， 25 （6） ： 549 -550. 10 Seglen PO. Preparation of isolated rat liver cells J . Methods Cell Biol， 1976， 13 （1） ： 29 -83.
20、The Improved Methods of Isolating and Identifying Rat Hepatocytes ZHANG Wen-xue， LI Li， ZHAO Liang-zhen， LIU Wen-ling， XU Cun-shuan （College of Life Science，Henan Normal University，Xinxiang 453007， China） Abstact：A new method was introduced to isolate and identify rat hepatocytes in this paper. The
21、rat liver was perfused with the solution of collagenase to obtain liver cells suspension. The simple perfusing device consisted of squirmy pump and sieve and so on. The purity of rat hepatocytes were identified by the constituted expression of 6 - P - Gase using enzyme-chemistry. The method is sim- ple，convenient and reliable for isolating and identifying the hepatocytes of rat and found a basis for further research of hepatocytes. Key words：rat；hepatocyte； 6 - P - Gase 79第 2 期 张文学等： 改进的大鼠肝实质细胞的快速分离及鉴定方法