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1、广东医学2 0 0 5 年8 月 第2 6 卷第8 期 1 0 5 1 应用反义转化生长因子基因进行骨肉瘤 基因治疗的研究关 潘海涛刘勇 郑启新杨述华叶树楠 华中科技大学同济医学院附属协和医院骨科( 武汉4 3 0 0 2 2 ) 【 摘要】 目 的 探讨 反义转 化生长因 子(3 1 基因 治疗 骨肉 瘤的 价 值。 方法 用 转 基因 技术 将反义 转化生长因 子基因导入骨肉瘤细胞L M- 8 ， 构建转基因细胞株。用骨肉瘤细胞株 L M 8 皮下注射C 3 H雄性小鼠建立小鼠骨肉 瘤移植瘤模型。应用裸反义转化生长因子基因、 灭活的转基因骨肉瘤细胞分原位和异位进行治疗。结果两种 治疗措施都
2、可表现出 抑瘤作用， 以灭活的转基因骨肉瘤细胞治疗效果最佳， 原位治疗效果优于异位治疗。结论 反义转化生长因 子基因对小鼠移植性骨肉瘤有较好的实验治疗效果， 为人骨肉 瘤进行反义转化生长因 子基因治 疗提供了一定的依据。 【 关键词】 反义转化生长因 子骨肉 瘤 基因治疗 S t u d y o n t h e g e n e t h e r a p y f o r o s t e o s a r c o m a b y a n ti s e n s e T G F 一 脚g e n e P a n H a i t a o ， L i u Y o n g , Z h e n g Q ix in
3、 ， e t a l . D e p a r u n e n t of O rt h o p e d ic s ， A ff il i c ia t e d U n i o n H a sp “ , T o i彭 M e d ic a l C o l le g e ， H u a z h o n g U n i u e r s 妙of S c ie n c e a n d T e 山w lo g y , Wu h a n 4 3 0 0 2 2 ( A b s t r a c t ) O b j e c ti v e T o in te s v ig a t io n t h e e ff e
4、 c ts o f t re a t m e n t o ff . 一b y a n t i s e n s e T G F 一 R l g e n e i n 。 ， M e t h o d s L M 8 s w e r e t r a n s f e c te d w i t h a n t is e n s e T G F 一 印g e n e th r o u g h li p o f e c t a m in e v e c to r a n d w e re s e l e c t e d 场6 4 1 8 . N u d e a n t i s e n s e T G F 一
5、皿g e n e w a s m i x e d w it h li p o f e c t a m i n e . T h e m o d e l o f o s t e o s a r c o m a w a s e s t a b li s h e d i n C 3 h m i c e i n j e c t e d w i t h L M 8 li n e s . T h e m o d e l t u m o r w a s t r e a t e d b y in a c t iv a t e d u a n s f u t e d L M 8 a n d p c D N A 3
6、 一 a n t i 一 T G F P 1 m ix tu r e s a t o f o r i g in a l s i te a n d d iff e re n t s it e . T h e c o n t r o l g ro u p w a s t r e a te d w i t h P B S . R e s u l t s S i g n ifi c a n t t h e r a p e u t i c e ff e c ts w a s a c h i e v e d 场t h e t r e a t m e n t o f in a c t iv a t e d
7、tr a n s d u c e d L M 8 a n d p c D N A 3 一 a n t i 一 T G F P l m i x t u r e s . S t ro n g i n h i b it i o n t o tu m o r g r o w th w a s f o u n d . A b e t te r a n t i - t u m o r e ff e c t w a s a c h ie v e d a t o ri g in a l s it e t u m o r c o m p a r e d w it h t u m o r a t d iff e
8、r e n t s it e . C o n c l u s io n G e n e th e r a p y f o r o s t e o s a r c o - m a 场a n t is e n s e T G F 一 团g e n e i s f e a s i b le a n d e ff e c t iv e , p r o v id i n g th e f o u n d a ti o n o f g e n e t h e r a p y f o r h u m a n o s te o s a r c m a , 【 K e y w o r d s ) A n t i
9、s e n s e T G F 一 (3 1 g e n e O s te o s a r c o m a G e n e th e r a p y 转化生长因子R 1 是肿瘤细胞分泌的最主要的免 疫抑制因子， 在骨肉瘤中有很高的表达， 通过自分泌和 旁分泌机制促进骨肉瘤生长。体外实验表明， 阻断转 化生长因子自分泌环， 可有效抑制骨肉瘤细胞的生长。 本实验利用反义转化生长因子R 1 基因， 对小鼠移植性 骨肉 瘤进行治疗， 探讨反义转化生长因子R 1 基因的利 用。 1 材料与方法 1 . 1材料 T G F P 1 反义转化生长因 子R 1 表达载体 a nt i一由 本室构建 ; 骨肉
10、瘤细胞株L M 8 由叶树 楠博士赠送; C 3 H小鼠购自 北京维通利华实验动物有 限公司， 雄性， 4 - 5 周龄; D M E M一 高糖培养基、 新生牛 血清、 胰蛋白 酶、 G 4 1 8 , L i p o f e c t a m i n e 均购自G ib c o 公司， 丝裂霉素购自 华北制药厂， 鼠T G F (3 1 E L I S A 检测试剂 盒购自B e n d e r 公司。 1 . 2 方法 1 . 2 . 1反义转化生长因子阻基因转染按l ip o f e c - t a m i n e 说明书进行。将对数生长期的骨肉瘤细胞传至 ， 湖北省武汉市宵年科技晨光计
11、划项目( 编号: 2 0 0 2 5 0 0 1 0 2 8 ) 6 孔板， 使每孔细胞数在1 x 1 护 左右。 将2 川的质粒 ( 对照组为空载体p c D N A 3 ， 以 及未进行转染的细胞) 用 无血清培养基稀释至1 0 0 贝 ， 将6 川脂质体亦用无血清 培养 基稀释 至1 0 0 闰 ， 二者混合后室温下静置4 5 m in , 用此混合物转染细胞， 6h 后加人 2 0 %血清培养基， 1 8 h 后换1 0 %培养基培养。 1 . 2 . 2 G 4 1 8 筛选待细胞生长接近融合时按 1 : 4 传 代， 继续培养至汇合7 0 % 时 换人含4 0 0 m g / L
12、G 4 1 8 的 培 养基开始筛选， 3 一 5 d 后换人含2 0 0 m g / L G 4 1 8 的培养 基维持筛选， 1 2 d 后终止筛选， 更换含2 0 %血清培养基 扩大培养2 周。 1 . 2 . 3 骨肉瘤移植瘤模型的制备用 P B S 将对数生 长期的L M 8 细胞稀释成 5 x 1 0 / m l 浓度， 于每只小鼠 左侧腋窝皮下注射0 . 3 m l ， 第3 天注射部位可触及硬 结， 第5 天肉眼可见明显肿瘤结节， 每2d 测量一次并 作记录。 1 . 2 . 4 骨肉瘤移植瘤的基因治疗及观察于第 7天 将50只小鼠随机分组: 对照组6 只; 裸反义转化 生长因
13、子基因治疗组 1 2 只: 分原位治疗和异位治疗各 6 只， 取p c D N A 3 一 a n ti 一 T G p1 基因1 0 讨 ， 和脂质体按 1 0 5 2 1 : 3 混合， 室温放置形成混合物， 用 P B S 稀释至总量 0 . 3 m l ， 第9天开始每次注射0 . 3 m l ， 每隔 3d 注射 1 次; 连续注射5 次; 转染膏肉 瘤细胞治疗组1 2 只: 分 原位治疗和异位治疗各 6 只， 将转染骨肉瘤细胞用丝 裂霉素( 1 0 0 P I / m l ) 灭活1 h 后， 用P B S 将转染细胞稀释 成5 x 1 0 / m l 浓度， 第9 天开始每次注射
14、0 . 3 m l ， 每隔3 天注射一次; 连续注射5 次。每3 d 测量肿瘤大小并记 录1 次; 观察期间小鼠死亡时记录生存时间， 切除肿瘤 测量瘤体大小及质量; 第5 0 天将所有小鼠杀死， 切除 肿瘤并测量大小及质量。 1 . 2 . 5 转染骨肉瘤细胞和未转染骨肉瘤细胞致瘤性 的比较随机选取6只小鼠， 用 P B S 将对数生长期的 p c D N A 3 一 a n ti 一 T G P1 基因 转染的L M 8 细胞稀释成5 x 1 0 / m l 浓度， 于每只小鼠左侧腋窝皮下注射0 . 3 m l . 与上述对照组小鼠进行比较。 1 . 2 . 6 T G 邓 1 在体外、
15、体内 的表达 采用双抗体夹心 F T ,T S A法进行检测。体外培养转染细胞在4 8 h , 1 4 , 2 1 d 和3 5 d 4 个时间点分别取5 个复孔进行检测; 荷瘤鼠 G U M朗o n g M e d i c a l J o u rn a l A u g . 2 0 0 5 , v a t . 2 6 , N o . 8 死亡和杀死时取肿瘤组织( 1 0 0 m g ) 进行检测。 方法参 照说明书进行。 1 . 3 统计学方法S P S S 1 1 . 0 软件进行 t 检验和方差 分析。 2 结果 2 . 1 G 4 1 8 筛选实验组细胞在2 周左右形成团簇样 生长的抗性
16、克隆， 而对照组细胞则在3 一 5 d 左右全部 死亡。 2 . 2 反义T G F P I 抑制肿瘤的生长 反义转化生长因 子基因对肿瘤生成率无明显抑制作用， L M 8 骨肉瘤细 胞对Oh 雄性小鼠肿瘤生成率为1 0 0 %， 转基因细胞肿 瘤生成率亦为 1 0 0 %， 但后者的生存时间( 3 8 . 5 土 6 . 9 ) d 较前者( 3 4 . 0 士 6 . 1 ) d 有明显延长( P 0 . 0 5 ) ， 后者的肿 瘤生长速度也明显减缓， 后者的肿瘤体积( 1 . 3 2 4 士 0 . 3 1 9 ) c m 3 ， 肿瘤重量( 1 . 6 1 4 土 0 . 7 1 7
17、 ) g ， 较前者的( 2 . 5 2 5 土 0 . 9 8 2 ) c m 和( 2 . 7 3 0 土 1 . 0 3 9 ) g 明显减少( P 0 . 0 5 ) 0 这说明反义转化生长因子基因对骨肉瘤移植瘤的生长 有明显的抑制作用。见表 t o 表1 不同治疗对骨肉摘移植摘模型生存时间、 肿抽大小及肿022的影响 组别 生存时间( d ) 原位治疗 体积( c m 3 )瘤重( 9 )生存时间( d ) 异位治疗 体积( c m 3 )瘤重( 9 ) 裸反义T G F p 1 转基因骨肉瘤细胞 对照组( P B S ) 4 2 . 0 t 1 . 9 4 8 . 5土2 . 0
18、3 4 . 0 t 3. 1 1 . 2 3 4 t 0 . 1 6 4 0. 7 3 41 0. 1 3 8 2. 5 2 5士0. 5 0 1 1 . 3 4 1 10 . 1 7 7 0 . 7 9 6士0 . 1 5 5 2. 7 3 0士0. 5 3 0 3 9 . 0士2 . 7 4 5 . 5 t 2 . 3 1 . 4 5 6土0 . 2 5 1 1 . 0 2 9 10 . 1 6 1 1 . 5 6 1) 士0 . 2 7 3 1 . 1 1 91 0 . 1 6 7 2 . 3 原位治疗优于异位治疗两治疗组的平均生存 时间均较对照组延长， 肿瘤体积、 肿瘤重量则均低于对
19、照组， 而原位治疗又明显优于异位治疗。两种治疗组 间差异有显著性( P 0 . 0 5 ) ， 其中用灭活的转染细胞进 行原位治疗效果最好。 2 . 4 T G 邓 1 在体内外的表达体外培养骨肉瘤细胞 T G p1 的表达量为( 1 6 . 2 4 土 3 . 2 5 ) n g / m l ， 转染反义转化 生长因 子基因 后T G F (3 1 的 表达明 显下降， 4 个时间 点检 测值分别为( 9 . 7 1 土2 . 9 4 ) , ( 8 . 8 6 土3 . 5 2 ) , ( 8 . 0 7土 2 . 0 9 ) , ( 8 . 5 6 士 1 . 9 8 ) n g / m
20、 l ; 移植瘤原位治疗后T G FP 1 表达与异位治疗后表达有明显差异， 与对照组比较差 异均有显著性( P 0 . 0 5 ) ， 见表2 0 表2 移植瘤T G F o 1 含f变化 组别 ( x 士 。 ) P g / m g 含量 转基因骨肉瘤细胞治疗组 裸反义T c 邓1 治疗组 原位治疗 异位治疗 原位治疗 异位治疗 对照组( P B S ) 4 6. 7 3 t 7. 8 6 7 0. 8 3 t 9 . 2 1 6 6 . 2 9 t 6. 8 4 9 8 . 5 2 t 8. 3 4 1 3 7. 6 2士7. 5 3 2 . 5 移植痛H E 染色 色证实为恶性肿瘤组织
21、 取出的肿瘤组织经切片 】 -)E染 3 讨论 3 . 1反义转化生长因 子娜对肿瘤生长的 抑制作用 转化生长因子R 1 作为肿瘤组织分泌的最主要的免疫 抑制因子， 在骨肉瘤的生长、 转移过程中发挥着重要作 用。 转化生长因 子印不但可抑制T 细胞、 B 细胞、 L A K 细胞， 而且还可以抑制免疫细胞产生免疫刺激因子如 I F N 一 y , T IV F 一 。 等 I 。 转 化 生 长因 子印还能 抑制 肿 瘤 特异性T 细胞( CM ) 的产生和细胞毒作用， 从而使肿瘤 细胞逃避免疫杀伤图。 体外实验表明， 采用反义转化 生长因子(3 1 基因技术， 可以阻断骨肉瘤细胞自 分泌 环
22、， 明 显抑制骨肉 瘤细胞的增殖活性3 。本实验则进 一步证实反义转化生长因子(3 1 基因在体内同样可以 对骨肉瘤细胞的生长增殖产生抑制作用， 并对致瘤动 物的生存时间产生影响。在两种治疗方法中， 转染细 胞治疗要优于裸基因治疗， 可能是灭活的肿瘤细胞增 加了肿瘤组织的免疫原性。 3 . 2 骨肉 瘤的靶向治疗靶向治疗是反义转化生长 因子p i 基因发挥作用的关键。 本实验中原位治疗组 要优于异位治疗组， 这些结果提示靶向治疗是骨肉瘤 基因治疗的关键问题之一。 3 . 3 应用 反义转化生长因 子皿基因 进行骨肉 瘤基因 治疗存在的问题骨肉瘤细胞转染反义转化生长因子 广东医学2 0 0 5
23、年8 月 第2 6 卷第8 期 1 0 5 3 印基因 后肿瘤生成率仍高达1 0 0 %， 尽管后期肿瘤生 长有所减缓。在已生成的所有肿瘤中， 均表现出不同 程度的持续生长， 未观察到一例肿瘤生长明显停滞、 缩 小或消失。 其他学者也有类似报道。 本实验仅仅证 明 应用反义转化生长因子(3 1 基因进行骨肉 瘤基因治 疗存在可行性和有效性， 但对骨肉瘤患者的基因治疗 及反义转化生长因子(3 1 基因如何在人体内发挥作用 尚待进一步研究。 参考文献 1 E p s te i n F H . R o l e o f tr a n s f o m d n g g ro w th f a c t o
24、r p i n h u m a n d is e a s e . N F . n - li J M e d , 2 0 0 0 , 3 4 2 ( 3 ) : 1 3 5 0 2 V is s e r K , K a s t W M . E ff e c ts o f T G F 一 p .t h e ir m m m e s y s t e r m : i m p l i c a - t i o n f o r c a n ce r ，一 t h e ra p y . l . e u k e m i a , 1 9 9 9 , 1 3 ( 1 0 ) : 1 1 8 8 3 .刘 勇， 郑启
25、 新， 杜 靖远. 阻 断 转化生长因 子日 自 分泌 环 对骨肉 瘤细胞生物学活性和化疗药物敏感性的影响.中华实验外科杂 志， 2 0 0 3 , 2 0 ( 9 ) : 8 2 5 4 吴幼章， 王文宏， 陈华群. 肿瘤坏死因子a 基因转导人脑胶质瘤 浸润淋巴细胞的抗肿瘤活性研究. 南京医科大学学报， 1 9 9 9 , 1 9 ( 1 ) : 1 1 ( 收稿日期: 2 0 0 4 -1 2 - 2 2 编辑: 庄晓文) 雌激素对戊四哇致痛大鼠海马内7 一 氨基丁酸和 微管相关蛋白2的影响_ 曹长妹潘三强 隋鸿锦2 暨南大学医学院人体解剖学教研室( 广州5 1 0 6 3 2 ) ; 2
26、 大连医 科大学人体解剖学教研室( 辽宁大连1 1 6 6 2 2 ) 【 摘要 】目 的 分 析月 经 性 癫 痛中 ， 雌 激 素 对大 鼠 海 马内Y - 氛基丁 酸( Y - a m i山 u ty r ic a c id , G A B A ) 和 微管 相 关 蛋白2 ( m ic r o t u b u l e a s s o c i a te d p r o t e in 2 , M A 几 ) 的影响。 方法 利用去卵粱S D 大鼠， 雌激素替代疗法 后戊四吐致 痈， 对大鼠背侧海马区G A B A 和M A P 2 的免疫反应产物进行观察。结果 实验对照组与空白对照组相比及
27、实 验 给药组与实 验对照组相比， 背 侧海马门区内G A B A 免疫反应阳性神经元数目 均显著性减少。 海马C A ; 区 辐射 层: 锥体细胞的树突的M A P 2 免疫活性产物粗大， 垂直走行。实 验给药组与实 验对照组相比， 阳 性树突 伸长、 增粗、 更加密集。结论雌激素使海马门区G A B A 含量减少， 降低G A B A对痴痛发作的抑制作用， 增强痛痛发作的敏感 性; 雌激素可调节M A P 2 免疚活性的表达， 增强海马内 神经元可塑性变化， 使海马内的兴奋性增强。 【 关键词】 雌激素月经性痴痈 Y - 氛基丁酸 微管相关蛋白2 癫痈是最常见的神经系统疾病之一， 部分女性
28、癫 痛患者痛性发作的敏感性在月经期和排卵期显著性增 强， 这种癫痈发作被称为月经性癫痛。目 前， 有关月经 性癫痛发病机制的研究表明， 卵巢类固醇激素在脑部 发挥重要的短期和长期效用， 特别是雌激素诱导海马 神经元的结构和功能发生改变， 可能显著增加女性癫 痛患者在月经期和排卵期痛性发作的敏感性 。 Y 一 氨基丁酸( G A B A ) 是脑内重要的抑制性神经递 质。G A B A与癫痛发病关系十分密切: 抑制性氨基酸 G A B A含量不足被认为是癫痛发病的生化机制之一。 雌激素可调节脑内G A B A和G l u 系统的兴奋性， 影响癫 痛的 发 生 和 发 展 2 l 。 微 管 相
29、关 蛋白2 ( M A P 2 ) 是脑 组 织 中主要的微管相关蛋白， 可增进微管的组装及参与形 成微管的侧臂， 其功能上与神经元生长过程中的稳定 性、 突触的可塑性相关。本实验采用雌激素替代疗法， 戊四哇致痛， 通过观察G A B A 和M A P Z 在去卵巢大鼠 脑 内海马区的免疫反应物的变化， 为探讨雌激素促癫痛 作用的机理提供形态学依据。 材料与方法 实验动物成年一 D a w l e y ( S D ) 大鼠， 雌 性， 体重1 6 0 - 1 8 0 g ， 室温喂 养， 自 由 进食水。 1 . 2 实验方法 1 . 2 . 1 去卵粱大鼠痛痛动物模型的建立和分组大 鼠巧只，
30、 4 %水合氯醛( 4 0 0 m g / k g ) 腹腔注射麻醉后， 无菌条件下行双侧卵巢摘除术。术后第8 天将动物随 机 分 为3 组， 每组5 只。 空白 对照组、 实验对 照组术 后 第8 天开始每天晨腹腔注射生理盐水 1 m l ， 实验给药 组同一时间腹腔注射雌激素苯甲酸雌二醇( e s t r a d i a o l b e n z o a t e , 凡) ( 2 0 m g / 吨 ) 连续3 d 。 实验对照组和实验给 药组分别于 最后一次注射生理盐水、 P 2 后， 腹腔注 射戊 四哇致痛5 0 mg/kg. 1 . 2 . 2 灌流、 固定、 切脑片戊四哇1 h 后， 4 %水合 氯醛腹腔注射麻醉， 冷盐水快速冲洗， 4 %多聚甲醛磷 酸缓冲液灌流固定后取脑， 于4 %多聚甲醛液后固定。 用振荡切片机切取4 0 p m厚背侧海马冠状连续脑片。 1 . 2 . 3 免疫组织化学方法选取背侧海马最大部位 的脑片， 磷酸盐缓冲盐液( P B S ) 漂洗， 1 %B S A孵育 1 h , 加人第一抗体， 4 孵育过夜， 再与生物素标记的二抗 ig 血 清孵育1 h , P B S 冲洗， 用A B C 试剂盒孵育2 h , D A B 显色， 适时终止反应。免疫组化对照组不加第一