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1、8 3 4 第 1 8 卷第9 期 2 0 0 5 年9月 医 学 研 究 生 学 报 J o u rn a l o f M e d i c a l P o s t g r a d u a t e s V o l . 1 8 N o . 9 S e p . 2 0 0 5 论著 屏障环境中实验鼠微生物质量控制 悍时锋， 胡玉红， 田小芸， 周森妹， 赵志刚， 王新柱 ( 南京军区南京总医院动物实验科， 江苏南京2 1 0 0 0 2 ) 摘要: 为了确保屏障环境中实验大、 小鼠微生物质量符合国家标准， 必须坚持加强对员工素质和技能的培训， 制 订并严格执行标准操作程序( S O P ) 和工作
2、制度， 维持性合理消毒、 灭菌屏障环境及各种物品， 定期维护保养屏障环 境内各种仪器设备， 定期自 检大、 小鼠 微生物质量等综合性方法， 才能保障屏障环境及实验大、 小鼠的微生物质量。 关键词:屏障环境;实验动物;微生物;质量控制; 国 家标准 中图分类号: R - 3 3 2文献标识码: A文章编号: 1 0 0 8 - 8 1 9 9 ( 2 0 0 5 ) 0 9 -0 8 3 4 -0 3 T h e q u a li t y c o n t r o l o n m ic r o b e o f e x p e r im e n t a l r a t s a n d mi c e
3、mb a r r i e r e n v i r o n m e n t Y U N S h i - f e n g , H U Y u - h o n g , T I A N X i a o - y u n ， Z H O U S h e n g - m e i ， Z H A O Z h i - g a n g , W A N G X i n - z h u ( D e p a r t m e n t o f A n i m a l， N a n j i n g H o s p i t a l o f N a n j i n g M i l i t a r y C o m m a n d
4、， P L A ， N a n - f a n g2 1 0 0 0 2 , J i a n g s u ， C h i n a ) A b s t r a c t ; T o e n s u r e t h e m i c r o b e q u a l i t y o f e x p e r i m e n t a l r a t s a n d m i c e a c c o r d e d w i t h t h e n a t i o n al s t a n d a r d i n b a r r i e r e n v i r o n m e n t . S y n t h e
5、t i c m e a s u r e s h o u l d b e a d o p t e d t h r o u g h t r a i n i n g o f p e r f o r m a n c e a n d t e c h n i c a l a b i l it y o n s t a f f s ， f o r m u l a t i n g a n d m a k i n g s t a n d a r d o p e r a t i n g p r o c e d u r e( S O P ) a n d r u l e s， d i s i n f e c t i n
6、 g a n d s t e r i l i z i n g r e a s o n a b l e o n a l l t h e m a t t e r c o n t i n u o u s l y ， k e e p i n g al l t h e in s t r u m e n t s i n g o o d s t a t u s r e g u l a r l y ， i n s p e c t i n g t h e m i c r o b e q u a l i t y o f l a b o r a t o ry a n i m al a n d b a r r i e
7、 r e n v i r o n m e n t r e g u l a r l y e t a l t o e n s u r e t h e m i c r o b e q u al i t y o f e x p e r i m e n t a l r a t s a n d m i c e . K e y w o r d s : B a r r i e r e n v i ro n m e n t ; L a b o r a t o ry a n i m a l ;M i c ro b e ; Q u al i t y c o n t ro l ;N a t i o n al s t
8、a n d a r d 0 引言 在生物医学研究中， 大、 小鼠是使用最广泛、 用 量也最大的实验动物， 我国实验动物国家标准中 ( G B 1 4 9 2 5 - 2 0 0 1 , G B 1 4 9 2 2 . 2 - 2 0 0 1 ) ) 规定实验用 大、 小鼠 最基础的微生物级别必须为清洁级， 生产和 使用 大、 小鼠 的 环境应为屏障环 境 ， 。 我院2 0 0 2 年在原亚屏障环境的基础上按国标标准要求改建了 屏障环境， 经过3 年的运行和管理， 生产和使用了大 量的实验用大、 小鼠， 环境及大、 小鼠微生物质量符 合国家标准， 未发生因大、 小鼠质量而影响实验结果 的情况，
9、 为生物医学研究提供了坚实的标准化技术 平台。现结合具体实践， 就如何对屏障环境中实验 大、 小鼠 微生物质量控制进行探讨。 1 实验用大、 小鼠微生物质量控制的意义 实验大、 小鼠质量包括微生物质量和遗传学质 量， 我国实验动物管理体系中设立了国家啮齿类实 验动物种子中心， 其他实验用大、 小鼠 生产单位的 种 群均引自 该中心， 遗传学质量主要由国家啮齿类实 验动物种子中心进行控制， 基层实验动物生产及使 用单位主要根据品种( 系) 特性( 近交系、 杂交群、 封 收稿日 期: 2 0 0 5 - 0 4 - 0 8 ; 修订日 期:2 0 0 5 -0 5 - 1 0 作者简介: 挥时锋
10、( 1 9 6 5 - ) ， 男， 江苏常州人， 副主任技师， 兽医博士， 从事医学实验动物学专业。 第9 期挥时锋， 等屏障环境中实验鼠 微生物质量控制 8 3 5 闭群) 进行生产和应用， 除某些特殊或引进品种 ( 系) 的大、 小鼠需要保种外， 一般不进行特殊的遗 传学控制， 要解决的主要问题是如何维持和控制实 验大、 小鼠的微生物质量。 哺乳动物从母体出生后， 如对其周围生活环境 未加控制， 即可被各种微生物污染， 影响动物生产， 干扰科学实验结果， 甚至会威胁人类自身的健康和 生命， 特别是许多微生物感染动物后， 不显任何临床 症状， 但这种隐性感染可导致动物某些生物学特性 和生理
11、参数发生改变， 影响动物实验结果的准确性 和重复性。其次， 动物在各种实验应激下， 其正常免 疫功能受到干扰而降低， 隐性感染可显性化， 使动物 发病或死亡， 实验被迫中止， 从而影响科学实验的正 常 进行 ， 。 2 屏障环境的类型 实验动物环境及设施( G B 1 4 9 2 5 - 2 0 0 1 ) 的国家 标准中规定， 屏障环境是指该环境设施适用于饲育 清洁级实验动物和无特定病原体( s p e c i f i c p a t h o g e n f r e e , S P F ) 的实验动物， 该环境严格控制人员、 物品 和 环境 空气的进出 1 ,2 。 一般而言， 屏障环境是指
12、 单走廊或双走廊型用于实验动物生产、 繁育或进行 动物实验的设施， 也就是通常所言的大屏障环境。 实验动物设施包括动物繁育、 生产设施和动物实验 设施， 前者是指用于繁育、 生产实验动物的建筑物、 设备以及运营管理在内的总和; 后者是指以研究、 试 验、 教学、 生物制品、 药品生产等为目的而饲育和进 行动物实验的建筑物、 设备以及运营管理在内的总 和。因此， 广义的屏障环境类型应包括上述所言的 大屏障环境、 S P F 级超净工作台( 实验台或手术台) 、 生物安全柜、 独立送回风净化笼具( I V C ) 、 层流柜 ( 架) 及符合 S P F级的各种运输工具( 笼盒、 车辆 等) 。由
13、于生产型屏障环境设计、 建设、 运行、 管理 最为复杂， 标准操作程序( s t a n d a r d o p e r n a t i n g p r o - c e d n r e , S O P ) 的要求最全面， 基本涵盖了其他类型 屏障环境。 3 屏障环境内大、 小鼠微生物质量控制的措施 3 . 1 建立并健全屏障环境各项S O P 屏障环境是 清洁级和S P F 级实验动物生活的环境， 由于其微生 物控制的特殊要求， 因此其工作特点有别于普通环 境， 各项S O P 均需体现“ 屏障” 特点， 因此必须借鉴 国内外的先进经验， 结合自 身的特点加以制订， 并在 实践过程中不断完善。
14、屏障环境内的S O P主要包 括工作人员的进出流程， 具体工作流程， 大、 小鼠饲 养管理制度， 卫生、 防疫、 消毒制度， 动物包装、 发放、 运输和处理， 垫料、 废物的运输和处理， 物品的洗刷 消毒和准备， 发生意外情况的应急措施等S O P , 3 . 2 屏障环境稳定运行的设备管理屏障环境稳 定运行对设备的要求较高， 因为设施运行后， 一般不 能停止运转， 特别不能停电， 否则会影响大、 小鼠的 生长、 发育、 繁殖和实验结果， 甚至危及大、 小鼠的生 命。我院动物实验科有2 个区域的供电， 但仍时有 停电情况发生， 因此最好自 备发电设备或并人医院 应急电 源管理系统， 确保屏障环
15、境的正常供电。空 调机组为2 台多压缩机中央空调， 交替使用， 定期检 修保养、 合理使用， 维持性能良好。送、 排风系统有 2 套机组， 互为备用、 定期检修和保养。通风口 过滤 膜定期清洗更换， 以免微生物滋生， 尘埃聚集， 影响 通风， 也避免电机处于长期超负荷运转状态而易损 坏。根据南京气候， 粗效过滤膜每2 周清洗更换 1 次， 中效过滤膜每季清洗更换 1 次， 高效过滤器每年 更换 1 次。其他设备如消毒锅、 压缩机、 喷枪等也要 科学而合理地使用并定期保养。 3 . 3 屏障环境的人员管理屏障环境中除通风口 外是密闭的， 由于进人的所有物品、 饮用水均经严格 消毒， 彻底灭菌，
16、空气也经粗、 中、 高效过滤除尘除 菌。而进出人员仅通过沐浴、 更衣、 风淋等措施控制 尘埃和微生物， 是主要也是最有可能携带微生物进 人设施的载体， 因此对人员的进出要严格控制， 无关 人员严禁进人， 对饲养管理人员和实验者首先要进 行体检和素质培训， 体检合格后进行素质教育， 使其 对微生物与实验动物质量的关系有深刻的认识， 明 确屏障环境“ 清洁级” 、 “ S P F ” 及“ 消毒灭菌” 的概 念， 牢固树立“ 不怕一万， 就怕万一” 的思想。并进 行技术培训， 使其熟练掌握清洁级实验动物饲养 S O P 并严格执行。经过学习和培训后， 要通过考核 才能进人屏障环境工作。另外， 大、
17、 小鼠饲育密度要 适宜， 合理按排工作人员进出的 频率， 一般以每周进 人2 一 3 次为宜。 3 . 4 屏障环境的消毒新建或改建的屏障环境经 彻底清扫、 清洗、 试运行后， 即可进行运行前的初次 消毒， 首先用适宜浓度的消毒液彻底擦洗屏障环境 内所有设施和物品， 通风运行2 4 h 后， 封闭所有送 排风口和人员进出口， 摆放好各种需进行灭菌的用 具和笼架， 根据屏障环境的 体积， 按巧m u m 3 甲 醛加 7 . 5 g 高锰酸钾计算出用药量， 对屏障环境进行多点 甲 醛熏蒸消毒4 8 h ， 然后通风运行7 2 h 以 上 ， 再 按国 标标准 用血琼脂平板进行空气细菌培养 ， 阴
18、、 性结果为检测合格， 即可使设施正常运行。 8 3 6医学研究生学报2 0 0 5 年9 月第 1 8 卷 静电的净化工作服， 清洗消毒方便， 穿着舒适、 轻便、 密封性能好， 经洗涤凉干包装后， 高温高压灭菌， 也 可用普通隔离衣、 帽、 口罩替代， 但密封性 较差。 4 屏障环境和大、 小鼠微生物质量的定期检测 对饲育的大、 小鼠、 空气及周围环境中微生物携 带情况要定期检测。空气及环境主要检测细菌的种 类和数量， 而大、 小鼠 则需根据清洁级或S P F 级的要 求进行检测相应的细菌、 病毒和寄生虫。根据检测结 果， 及时采取必要的控制措施， 定期自 检一般每季度 1 次， 方法按国标
19、标准要求进行。对饮水、 饲料及垫 料也要定期检测消毒效果， 可使用商品性的灭菌效果 化学指示卡， 也可通过采样进行细菌培养。 我院实验动物屏障环境运行以 来， 按国标标准严 格而科学地进行管理， 严格按S O P 进行操作， 屏障环 境顺利通过了全军医学实验动物管理委员会、 江苏省 科技厅、 江苏省实验动物管理委员会组织的专家验 收， 通过了江苏省实验动物检测二站的2 次检测， 并 取得了 合格的检测报告。我们生产及进行保种的大、 小鼠包括封闭群I C R小鼠， 近交系N J S 小鼠、 突变种 糖尿病小鼠( d b / 一 ) ， g t - R O S A及n E G F P 转基因小鼠，
20、 封闭群S D大鼠， 近交系L e w i s 大鼠均符合清洁级标 准 。 川。 充分保障了 我院 “ 医、 教、 研” 工作中 对实验 大、 小鼠 质量的要求， 同时也促进了江苏地区乃至全 国实验动物科学的发展。 参考文献: 1 G B 2 G B 3 魏 1 4 9 2 5 - 2 0 0 1 ， 中 华人民 共和国国家标准【 S . 1 4 9 2 2 . 2 - 2 0 0 1 ， 中 华人民共和国国家标准 S . 乱. 医学实验动物学【 M重庆: 四川科学技术出版社， . 1 7 一5 . 杭， 挥时锋， 刘年双 实验动物科学基础知识问答【 M . : 江苏科学技术出版社， 2 0
21、0 4 . 2 7 - 5 0 . 陈天培 实验动物微生物学品质监控的要求和意义仁 J . 上海 实验动物科学， 1 9 8 9 , 9 ( 2 ) : 9 2 - 9 9 . 挥时锋， 朱 虹. 在生命科学研究中影响动物实验结果的多 因素分析 J . 医学研究生学报， 2 0 0 3 , 1 6 ( 5 ) : 3 7 2 - 3 7 5 , 3 7 8 . 朱梅芬， 章凌， 王富生 等. 实验动物颗粒饲料微生物学 品质检测方法及其结果 J . 上海实验动物科学， 1 9 9 0 , 1 0 ( 2 ) : 9 5 - 9 8 . 王焕山， 岳秉飞， 李凌 等. 实验动物新型垫料的开发【 J
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23、 8 7 . 一一JF.esJFweJJleses习 41勺67， rLfLFIJLL 一一JlesesJ 讨两9 尸.ILLL ，J乃esesJ 0。1 ，1勺.五 rLrL 屏障环境运行后应进行维持性消毒， 消毒液选 择0 . 2 5 %过氧乙酸及2 %戊二醛， 但戊二醛杀灭细 菌芽胞的时间稍长。空气消毒采用压缩喷雾的方 法， 我院使用的华冠移动式空气压缩机( V -0 . 1 3 / 1 2 . 5 ) ， 工作压力为1 . 2 5 M P a ， 将适宜浓度的消毒液 装人喷枪内， 喷枪距消毒目 标5 0 c m左右， 按照由里 向外， 由 上至下的原则， 按5 0 m l / 耐的用量
24、对空气均 匀喷雾， 以每周2 一 3 次为宜。地面、 天花板、 墙壁及 动物笼架先清除粪便、 垫料等污物后再进行喷雾和 擦拭相结合的消毒方法6 。 长期频繁使用过高浓度的消毒虽可保障设施内 微生物种类和数量达标， 但对实验动物的健康、 生 长、 发育、 繁殖及动物实验结果将产生不可预计的影 响， 尤其对药物筛选安全性试验等结果有较大的影 响。按G L P 规定， 动物实验中一般禁止使用消毒剂 和 杀 虫 剂。 因 此对屏障设 施内 的 维持 性消 毒 应在药 效范围内采用低剂量低浓度的消毒液， 而且要考虑 到微生物耐药性， 轮流使用适宜浓度的消毒液较为 合适。维持性消毒主要是控制微生物的生长、
25、 繁殖， 并不能完全杀灭微生物， 因而在管理上应定期轮流 使用饲育室， 对轮空的饲育室用较高浓度的消毒液 进行消毒， 对有效地维持屏障环境及保障所饲育实 验大、 小鼠 微生物质量具有重要意义 “ 川。 3 . 5 屏障环境内 物品的消毒和灭菌 传递窗物品 的消毒一般采用喷雾和紫外线相结合的消毒方法， 一个1 5 W的紫外灯在( 0 . 2 一 0 . 5 ) 耐的传递窗中消 毒1 5 m i n ， 物体表面细菌杀灭率可达9 9 . 9 9 %以上， 为了使消毒效果更好， 可在传递窗四周安装紫外线 灯， 并与喷 雾消毒结合使用。 双层小包装经6 0 c 。 灭 菌的全价颗粒饲料可通过传递窗传人
26、; 普通饲料经 双扉预真空高压消毒锅灭菌后进入， 灭菌条件为 0 . 2 M P a ( 1 5 磅) , 1 2 1 一 1 2 5 c C , 1 5 m i n ， 能杀灭饲料中 所有的微生物， 但灭菌后的饲料中某些营养素主要 是维 生素和 蛋白 质的 含量有所下降 习 。 我国 对大、 小鼠 垫 料 研究相对较少， 开发的品 种也不多 8 ,9 ， 垫 料大多使用锯木屑或刨花， 经高压灭菌可杀灭垫料 中一切微生物， 也可使用经真空压缩包装灭菌的垫 料， 由传递窗传人。笼器具必须选用耐高温高压的 制品， 经洗刷后， 可直接经预真空高压灭菌( 塑料笼 具灭菌温度不超过1 2 5 c C ， 时间控制在 1 5 m i n 以内， 否则易变形、 老化， 影响使用寿命) 。饮水消毒可加 人适量盐酸， 使其p H值在2 . 5 一 3 . 0 之间， 然后再 经预真空高压灭菌， 酸化水可使水质软化， 也可杀灭 水中大部分微生物， 再经预真空高温高压灭菌， 杀灭 饮水瓶表面及水中残存的微生物。工作人员选用抗 ( 责任编辑: 李风华; 英文编辑: 唐文杰)