模型动物斑马鱼及其特定病原净化.pdf

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1、2 0 0 9 年1 2 月 第1 9 卷第1 2 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A l l V EM E D I C I N E D e c e m b e r ，2 0 0 9 V 0 1 1 9 N o 1 2 模型动物斑马鱼及其特定病原净化 孙德明，穆苑，高昌，王天奇，张长勇，祝梅香 ( 国家人口计生委科学技术研究所，北京1 0 0 0 8 1 ) 序目e ； $ 综述与专论$ 唔 e 、! 目、口盼e ；、缈 【摘要】虽然斑马鱼等实验用鱼已经成为生命科学研究的一类重要模型动物，但对于在集约化人工养殖过程 中实验

2、鱼的疾病却研究很少。实验用斑马鱼严重的健康问题使其在研究中常出现大面积甚至毁灭性的死亡。常 见的感染也可以危及很多实验室的鱼群。因此，培育健康的实验用鱼群，建立必要的质量控制标准已经势在必行。 本文收集和分析了大量相关的资料，为我国实验用鱼疾病的控制以及标准化研究和培育S P F 斑马鱼提供帮助。 【关键词】斑马鱼；标准化；疾病；模型，动物 【中图分类号】R 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 2 0 0 9 ) 1 2 0 0 5 2 0 9 D i s e a s e si nL a b o r a t o r yZ e b r a f i s hM o d

3、e l sa n dT h e i rS p e c i a lP a t h o g e nP u r i f i c a t i o n S U ND e r u i n g ，M UY u a n ，G A OC h a n g ，W A N GT i a n - q i ，Z H A N GC h a n g y o n g ，Z H UM e i - x i a n g ( N a t i o n a lR e s e a r c hI n s t i t u t ef o rP o p u l a t i o na n dF a m i l yP l a n n i n g ，B

4、e i j i n g1 0 0 0 8 1 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v eA l t h o u g hz e b r a f i s hh a sb e c o m eam o s ti m p o r t a n tr e s e a r c hm o d e l ，r e l a t i v e l yl i t d ei sk n o w na b o u t t h ed i s e a s e st h a t a f f e c t t h i ss p e c i e sw h e nh e l di n c

5、a p t i v i t y S e v e r eh e a l t hp r o b l e m sc o u l ds e r i o u s l yj e o p a r d i z em a n yr e l * a r e h f a c i l i t i e sb yd e v a s t a t i n ge v e n te v e na c u t em o r t a l i t yi nt h e i rz e b r a f i s hc o l o n i e s A sw i t ho u rl a b o r a t o r ya n i m a l su

6、s e di nr e s e a r c h ，i t i si m p e r a t i v et Oc o n d u c ts t u d i e sw i t hd i s e a s e f r e e ，S P Fz e h r a f i s hb ys e t t i n gl o c a lt e c h n i c a ls t a n d a r d s T oa i di n t h i se n d e a v o r ，w e a r ed e v e l o p i n gs e n s i t i v ed i a g n o s t i ct e s t

7、sf o rs e r i o u sp a t h o g e n st op r o v i d ea no v e r v i e wo fc o m m o nd i s e a s e si nz e b r a f i s h F o re a c h d i s e a s e ，w ea l ec o l l e c t i n gi n f o r m a t i o no nt h ec h a r a c t e r i s t i c s ( e g ，p a t h o l o g i c a lp r e s e n t a t i o n ) ，m e t h o

8、 d sf o rd i a g n o s i s ，a n d s u g g e s t i o n sf o rc o n t r o la n dt r e a t m e n t I na d d i t i o n ，m e t h o d sf o rc o n d u c t i n gd i s e a s ei n v e s t i g a t i o n sa n dad i a g n o s t i c l a b o r a t o r yf o r f l L r t h e ra n a l y s i sf i r ei n c l u d e d 【K

9、e yw o r d s 】Z e b r a f i s h ；D i s e a s e s ；S t a n d a r d s ；A n i m a lm o d e l 1 鱼类模型动物 模型动物是指在实验室中经过长期驯化并可以 模拟或代表其它有相同的或类似的生命活动过程的 动物。鱼类作为模型动物是从上世纪6 0 年代末7 0 年代初G S t r e i s i n g e r 建立斑马鱼纯系开始的。J 。 鱼类是脊椎动物系统发育较原始的类群，其性别分 化、免疫体系、胚胎发育以及各系统的发育等均表现 出脊椎动物从低等到高等的某些进化特征，如怀卵 量大、体外受精、体外发育、胚胎易于观

10、察分析等。 鱼类的数量和种类比哺乳类、鸟类等其他脊椎动物 更加繁多，作为实验材料具有取之不尽的资源。作 为低等脊椎动物的代表，鱼类还有终生生活在水中、 材料易得、养殖便利等特点，是生理学、生态学、毒性 试验、环境监测、遗传学、发育生物学以及分子生物 学等研究常用的实验材料，在生物和医学等各个领 域得到广泛应用。 现有常用模型鱼类都具有以下一些独特的生物 基金项目】北京市应用基础与战略高技术主题项目课题( 1 3 0 7 0 8 0 2 0 0 7 2 0 7 0 2 ) ；国家人口计生委科研所基本科研业务费重点项日 ( 2 0 0 9 G J S S J K B 0 3 ) 。 通讯作者】孙德

11、明( 1 9 5 8 一) ，男，研究员，博士，研究方向：实验动物。E m a i l ：s u n d e m i n g n e t 1 6 3 t o m 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o m p M e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 2 5 3 学性质： ( 1 ) 小型鱼类，体长短、体重小，易于在实验室繁 育饲养： ( 2 ) 卵粒大、卵壳透明，显微操作过程可实时监 测，容易观察到发育的胚胎并进行操作，尤其易于进 行外源基因的表达调控研究； ( 3 ) 皮肤透明

12、或半透明，肉眼可识别血管、大脑 以及其它内脏器官，易于从体外进行显微操作； ( 4 ) 具有许多独特、易于鉴别且由基因调控的表 型( 如体色、眼色、胡须、鱼鳍等) ，可形成不同品系； ( 5 ) 生活周期短、发育成熟期短，易用于同时研 究亲本和子代的遗传与发育2 J 引。 目前，鱼类实验用动物还没有象啮齿类实验动 物那样实现了实验动物的标准化，甚至还没有国家 或地方统一的质量控制标准。大多数作为实验模型 和材料的鱼类动物只能称为“实验用动物”，对照国 家和地方有关实验动物严格的管理规定和标准要 求，鱼类实验动物可以说还没建立。虽然一些有应 用价值的小型鱼类进行了纯化培育工作，如斑马鱼 ( D

13、a n i or e r i o ) 、虹鲔( P o e c i l i ar e t i c u l a t u s ) 、青鲔( O r y z i a s l a t i p e s ) 、新月鱼( 却卸幻Mm a c u l a t u s ) 、剑尾鱼 ( 挪如p 扔船h e U e r i ) 都有近交超过2 0 代的品系，这 些品系已经有较高的遗传均一性，可是在疾病控制、 微生物净化和饲养与应用条件方面和法规标准概念 上的实验动物还有很大的差距。 作为鱼类模型动物的代表斑马鱼的应用最为广 泛，其实验动物化的相关研究受到较多的关注。 2 模型动物斑马鱼及其应用和研究现状 斑马鱼属

14、脊椎动物门，硬骨鱼纲，鲤形目，鲤科， 短担尼鱼属，原产于印度，为小型热带野生鱼类， 成体长3 5c m ，3 个月性成熟，每隔1 周可产卵几 百粒。 斑马鱼由于具有色彩美丽的条纹，而且容易繁 育和饲养，饲养成本低，是人们最喜欢饲养的热带观 赏鱼之一，也是最早被用于实验的鱼类。1 9 8 1 年， 著名的遗传学家G e o r g eS t r e i s i n g e r 关于斑马鱼人工 雌核发育的研究在( N a t u r e ) 上发表后，立即吸引了 众多研究者。与此同时，S t r e i s i n g e r 的合作者C h a r l e s K i m m e l 发现了斑马

15、鱼另一个对胚胎发育生物学研 究极为有利的优点胚体透明且发育速度快。从 此将斑马鱼引入了发育生物学和分子生物学的研 究副。 斑马鱼体型小、生长快、繁殖力强、胚体和幼鱼 身体透明，可以透视鱼体内部、观察原肠期的细胞运 动、脑区形成和心跳等胚胎发育事件，还可跟踪细胞 的发育命运、进行细胞的谱系分析，应用于组织器官 的起源研究等。斑马鱼的细胞标记技术、组织移植 技术、突变技术、单倍体育种技术等已经成熟，且有 数以千计的斑马鱼胚胎突变体。 近1 0 年来，由于斑马鱼应用的迅速增加，积累 了丰富的实验数据和资料n 0 引，也促进了斑马鱼的 应用的扩展：对于脊椎动物发育研究的突破性进展、 转基因技术、基因活

16、性抑制技术和基因缺失技术的 应用为疾病模型的建立提供新思路。通过构建表达 小鼠原癌基因M y c 的斑马鱼品系，得到了T 细胞的 白血病模型；转入荧光蛋白基因的斑马鱼已开始出 现于观赏鱼市场；心脏可以发出强绿荧光的转基因 斑马鱼，能用来追踪心脏细胞的变化，找出与心脏发 育相关的新基因和功能。哈佛医学院和儿童医院的 霍华休斯医学研究院M a r kT K e a t i n g 等人发现斑马 鱼的心脏受损后仍能重新复原，这是首次发现脊椎 动物的心脏再生现象，给治疗人类心脏病带来新希 望。此外，由于鱼类动物在毒性试验上的应用优势， 国际标准化组织在上世纪8 0 年代推荐斑马鱼为毒 性试验标准材料；

17、1 9 9 1 年，我国颁布了水质物质对 淡水鱼( 斑马鱼) 急性毒性测定方法( G B T1 3 2 6 7 - 9 1 ) ，首次把斑马鱼规定为饮用水水质检测的动物。 此外，斑马鱼还在性染色体、运动神经回路和生物钟 的研究中有突出贡献。 斑马鱼的基因组仅为人类的一半。2 0 0 1 年，德 国已经绘制出斑马鱼的基因组草图，并开始对斑马 鱼的基因组草图做进一步的精确测定。目前，基因 组测序已完成，并有望借此发现各种不同基因的有 效机制和功能。国际上现在已有约2 0 个斑马鱼品 系，斑马鱼基因数据库里有相关的资料可供查询和 下载，网址为：h t t p ：z f i n o r 9 4 c g

18、 i b i n w e b d r i v e r ? M l v a l = 髓Z D B h o m e a p g 。在N C B I 网站上，研究斑马鱼 基因的文献达到近5 万个。 目前，虽然斑马鱼已经成为了一种极其重要的 模型动物，但人们对于斑马鱼由野生的自然繁育到 在实验室集约化人工养殖过程中环境的改变及其会 影响斑马鱼健康的各类疾病却了解甚微。实际上， 实验用斑马鱼其严重的健康问题的确耗费了巨大的 科研经费，有些研究机构的斑马鱼群还发生过毁灭 性的鱼群死亡。更多的是持续性的各类感染危及着 万方数据 5 4 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期 C

19、 h i nJC o m pM e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 2 许多研究室的鱼群。因此，建立无疾病的标准化实 验斑马鱼群已经势在必行陋 。 水生动物的生物净化不同于啮齿类实验动物， 存在很多较难以解决的技术问题。不同于啮齿类动 物生活的空气环境，热带鱼生存的水环境通常是各 类水生微生物和寄生虫繁殖的最佳环境，实验鱼及 其适合的水环境常常成为事实上的“培养基”。因 此，实验鱼的生物净化较难，净化后实验鱼和水环境 维持的技术目前还没有得到很好地解决。国际上 S P F 级斑马鱼的培育才刚刚开始；国际斑马鱼资源 中心( Z e b r a

20、 f i s hI n t e r n a t i o n a lR e s o u r c eC e n t r e ) 建立了部 分病原体的诊断试剂；美国华盛顿大学医学院于 2 0 0 4 年培育出无菌斑马鱼，这是人类第一次获得的 鱼类无菌动物。无菌斑马鱼是继1 9 5 9 年成功繁殖 无菌大鼠之后的另一项重要的生物学成就。这一成 果也为今后培育悉生实验鱼和实验用鱼类的标准化 提供了技术支持。 国际上，相对于实验用鱼的应用研究，实验用鱼 的标准化研究目前明显落后。在我国，近十年来随 着实验用鱼使用的快速增加，实验用鱼的培育研究 和实验用鱼的标准化研究得到了实验动物领域专家 的重视，也得到政

21、府实验动物主管部门的资助。其 中，斑马鱼、剑尾鱼的研究较为深入，已经开始制定 实验动物技术标准的研究。实验用鱼类的实验动物 标准化研究将推动鱼类实验动物应用快速发展。 此外，由于鱼类动物属于较低等的脊椎动物，其 在科研实验上推广使用也适应了国际上实验动物替 代理念要求，与哺乳类实验动物不同，很少受到动物 保护主义的干扰和阻挠。目前，以斑马鱼为代表的 实验用鱼在国内外的使用数量和应用领域均呈现加 速增长的趋势。 3 实验用斑马鱼的疾病 3 1 疾病的检测与诊断 相对于食用鱼，人们对于实验用斑马鱼的疾病 及其疾病谱了解很有限，多数资料也限于观赏用斑 马鱼饲养中的寻常问题。就像其他鱼类一样，科研 人

22、员对于鱼类特殊疾病的关注和研究往往是在其经 济重要性被发现并大量集约化饲养之后开始 的2 ，矧。 病毒性疾病对于水产业通常是毁灭性的。但 是，由于很多病毒都是宿主特异性的，经常是在某种 鱼被大量的集约化养殖后才发现并被鉴定出来。鱼 类新型病毒的鉴定通常需要在综合流行性调研后建 立起新的细胞系和特异性检测方法。目前，病毒不 是斑马鱼疾病的主要致病原因，因此斑马鱼尚没有 开展病毒检测。2J 。 同样，细菌性感染，除了最重要的分支杆菌外， 通常会出现革兰氏阴性菌感染的偶发病例。由于上 述原因，人们对于诊断的主要手段尚为细菌学和组 织病理学，病理变化的诠释也还停滞于组织学和细 胞水平。 要开展斑马鱼疾

23、病的准确诊断，至少须掌握鱼 群以下信息： ( 1 ) 来源( 品系，株) ； ( 2 ) 在感染鱼群中显现的疾病和流行病学资料； ( 3 ) 饲养环境( 如水体硬度、食物、医疗、用药史、 死亡率、水环境系统设计等) ( 4 ) 行为学改变：鱼的行为改变对于突发性疾病 的诊断是非常有意义的，某些行为变化对于推断性 诊断有帮助。若鱼在缸的一侧摩擦，这可提示它们 感染了体外寄生虫。异常呼吸方式可提示鱼腮的损 伤，旋转或螺旋式游水通常预示神经性损伤。其他 的疾病常见的征候包括停止进食、精神沉郁和异常 水体位置( 如在水面或水底) 。 3 2 剖检鱼的选择 检查需要在病鱼死亡前( 包括垂死时) 进行，这

24、 对确定导致病鱼死亡的第一因素和区分第二因素或 者机会性病原尤为重要。必要时应随时检测若干只 受感染的鱼。此外，检测表象正常或无症状的鱼对 于早期的病原和潜在致死原因的确定都有重要意 义。 3 3 外观检查 斑马鱼体型小，病理解剖尸检应十分细致，配合 立体解剖镜的使用会使病理确诊更为准确。体表的 检查应注意表面的主要异常改变( 比如鳍损伤，皮肤 变色、病变，寄生虫和肿瘤等) 。用盖玻片刮取鱼体 表面并放置于一张载玻片上，制备皮肤粘液的湿片。 在制备之前应滴加一些水，这样盖玻片和载玻片之 间就会以液体全部填充，不留空隙。用复式显微镜 检查此标本，从低倍镜开始。减弱灯光，减低电容可 以增强对比度，

25、这样使得寄生虫和其他病原更易显 现。 3 4 腮的检查 移除鳃盖，记录鳃的颜色( 如苍白鳃通常提示贫 血) 。检查寄生虫，包囊，过多的粘液，并用解剖镜检 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 , E l 第1 9 卷第1 2 期c h i nJC o m pM e d D e c e m i m r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 25 5 查出血情况。用解剖剪剪下少许鳃丝制作湿片，将 鳃丝浸于载玻片上的一滴水中，盖上一片盖玻片。 复式显微镜检查寄生虫、真菌和细菌。 3 5 体内检查 打开体腔，检查是否有腹水、出血或其他异常出 现并全面记录。移开鱼鳔暴露出肾脏并记

26、录其有无 异常。很多疾病导致肾脏的肥大或变色，但由于其 体型的微小，在斑马鱼比较难以观察。检查心脏有 无任何异常。内脏器官上多样的发白包囊说明分支 杆菌的感染。复式显微镜检器官压片判断有无包囊 寄生虫、真菌或肉芽肿。解剖镜或复式显微镜检查 的压片的制作方法：取一小片组织，轻轻将其放置于 盖玻片和载玻片之间并压碎组织。 3 6 染色 采用L e i s h m a n SG i e m s a 或D i f f - Q u i k ( D a d eB e h r i n g A G ，N e w a r k ，D E ) 染色，使肾脏或者其他器官的原生 动物和细菌感染的特征更为明显。检测方法：

27、取一 片组织并在干净的纸巾上蘸去血液，轻轻将切开的 组织表面平铺在一张干净的载玻片上，风干约1 1 2 h 。1 0 0 甲醇中浸泡5 1 0m i n 后进行G i e n l 8 a 染色 或者浸于D i f f - Q u i k 试剂盒提供的固定液中。压片 可以以G i e m s a 或者D i f f - Q u i k r a n s e 染色，或者直接进 行实验室检测。对于分支杆菌，染色和组织涂片应 该应用抗酸染色法。 3 7 组织学检查 鱼类的组织学检查应在动物宰杀后马上进行以 避免宰后尸体及器官组织的改变。在可能的情况 下，尽量不使用死亡鱼类进行本项检查。因为在死 后1 5

28、 2 0m i n 组织就可发生明显的自溶。样本鱼应 保存在以甲醛为主的固定液中，如D a v i d s o n S 或 D i e t r i c h s ，做组织学检查处理。切除一小部分腹 壁暴露腹腔，之后将鱼以组织与液体为1 ：2 0 ( v v ) 的 比例整体置于固定液中。D i e t r i c h S 或D a v i d s o n S 液 对于斑马鱼整体组织学检查的固定功效最佳。可以 进行整体切片( 通常于矢状方向切开) ，也可以进行 各主要器官的多角度切片。 3 8 电镜 在特殊情况下需要借助电镜进行检查诊断。组 织学检查重要的一项是为电镜收集制备标本，采集 到固定液中

29、组织的新鲜度和组织的适度浸透的要求 甚为严格。小组织块需要冷藏在戊二醛液为主要成 分的固定液中，切碎成约2m m 3 修块儿后的组织置 此液体中过夜，然后转移至适当的b u f f e r 中，样品均 应冷藏固定。固定液的选择：现有很多种E M 固定 液和b u r r 。A p p e n d i x 公司提供了一种M i l l o n i g S b u f f e r 和固定液的配方。固定于中性甲醛液b u f f e r 中的组织通过透射电镜的成功率很有限，但是使用 酸性固定液的成功率更低，如D a v i d s o n S 或D i e t r i c h S 液。 3 9 细菌

30、学 有些细菌感染，如表面滑行细菌和分支杆菌，可 以用简单的革兰氏或抗酸染色法染色( 如Z i e h l N e e l s e n ) 确定。然而，对于其他细菌疾病的诊断需要 细菌培养的处理。因此活体鱼需要转移至实验室， 但是这在某种条件下可能难以实现。由于这个原 因，我们在下面提供了进行初代培养的方法。细菌 培养之后可以送至实验室进行全面检测。 细菌检测样品应采自新鲜的鱼，从实验鱼缸中 捞起的死鱼没有意义。也可用7 0 乙醇作鱼体表 消毒，采样针、接种环、解剖钳的头部应用火焰消毒。 肾脏接种物的采集有两种方法：一是在腹壁上切口 打开腹腔，确保不切割到胃肠道。然后用经火焰消 毒的解剖钳将鱼鳔

31、推至一边，向肾脏内插入一支无 菌拭子或接种环；二是鱼体背部的方法，在肾脏背部 切开一道侧线进入肾脏( 如靠近侧线) 。将接种物接 种于胰蛋白酶大豆肉汤或血液肉汤细菌平板培养皿 上，封闭接种板，将接种板送至微生物实验室进行进 一步诊断。 对于滑液细菌( 如嗜细胞菌，屈挠杆菌和黄杆 菌) ，推荐嗜细胞菌培养基。虽然损伤可能指示大量 的滑液细菌，但是其他细菌( 如气单胞菌) 可能会生 长更迅速。因此，获得滑液细菌纯培养的方法是在 灭菌水中均质化受感染的组织( 如鳃，皮肤和肌肉) ， 并且将以对数增长率为基准调配的不同稀释度接种 物接种在相应的培养皿里。当细菌大量感染组织 时，革兰氏染色会揭示一些细菌

32、的存在。在载玻片 上薄层涂片风干并且在火焰上稍稍加热3 。5s 固 定，染色观察记录疑似受感染的组织。 3 1 0 病毒学 病毒学诊断需要对病毒进行纯化培养，培养物 最好来自新鲜宰杀的鱼体。如果不能实现，鱼体在 检测前冷冻也不可超过2 4h ，在此之前标本应送到 鱼类病毒实验室。由于斑马鱼病毒病的专门研究较 少，目前还没有报道已知的斑马鱼群病毒性疾病。 但是，随着斑马鱼使用的增加和相关研究的深入，斑 马鱼新型病毒性疾病将会鉴定出来。 万方数据 5 6中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o m p M e d ，D e c e m b e r2

33、 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 2 3 1 1 分子生物学 目前，以D N A 检测为基础的诊断方法，如利用 P C R 在鱼类疾病诊断上应用1 3 益广泛，由于该类方 法的敏感性和特异性，将会得到快速发展。目前已 研发的有：如P C R 方法来检测神经小孢子虫 ( P s e u d o l o m an e u r o p h i l i a ，A s t r o f s k y 等2 0 0 0 ) 、利用P C R 诊断确诊并区分不同类型的分支杆菌。由于P C R 的高度敏感性，应该特别注意避免样品之间的交叉 污染。所采集的样品应立刻冷冻或者在乙醇中保 存。当使用1 0

34、 甲醛液保存组织进行基因型分析 时可能会得到混合的结果。M o o r e 等( 2 0 0 1 ) 发现脱 钙的过程( 在对斑马鱼进行组织学研究时常规进行 的操作) 会对于分子学分析造成很大影响。 3 1 2 标本的运输 有效的保存标本并尽快送到诊断实验室对于准 确诊断至关重要，标本装箱和运输应在2 4h 内完 成，不应耽搁。活鱼标本运输所用的水也应在装箱 前和鱼同时准备好。可以在运输用水中以2p p t 的 比率加入氯化钠( 每升水中2 0gN a C I ) 来帮助维持 渗透压。向运输袋中加入1 3 的洁净水并把其轻轻 放入运输包中。运输包封口后应该保证1 3 水，2 1 3 空气。运输

35、包按照传统方法封口，之后放置于另一 个包中，同样传统方法封口。将运输包放置于一个 隔热的运输容器中。 运输中保证活鱼标本的鲜活较困难，不得已只 能提供鱼类尸体时，则必须保证死后马上冷藏且2 4 h 内运送到实验室检查。如果鱼不能在2 4h 内送达 实验室，鱼的组织标本需要在固定液中保存。 固定液中组织的运输：对于保存鱼体的运输，以 7 0 乙醇取代固定液并浸泡过夜。排去多余的液 体，将组织用乙醇浸泡过的纸巾包裹，之后封存于防 漏容器中“。 冷冻鱼体的运输：将鱼冷冻在一个塑料袋中之 后放置在有冰袋的消毒容器中运输。 冷藏鱼体运输：将鱼放置在一个塑料袋中然后 在袋子周围铺满冰或冰袋。在消毒过的防漏

36、容器中 运输。 3 1 3 鱼标本的采集及保存方法对鱼病诊断检查的 影响 现有标本的现场采集及其保存的主要方法对于 鱼病诊断的利弊如表1 所示。 表1 保存鱼体组织的方法及其对鱼病诊断检查的影响 T a b 1P r e s e r v a t i o nm e t I l o d so ff i s ht i s s u e sa n dt h e i ri m p a c t o nt h ed i a g n o s i so ff i s hd i s e a s e s + + + ：最佳；+ + ：在大多数情况下满意；+ ：未达到最佳标准，在 没有其他方案的情况下可以使用；0 ：无

37、作用。 * 在1 0 甲醛液为主要成分的固定液中保存( 如D i e t f i c h s 固定液) 以备组织学检查，在戊二醇为主要成分的固定液中以备电镜检查， 在9 5 乙醇中以备进行P C R 。 N o 她 + + + = o p t i m a l ；+ + = s a t i s f a c t o r yi nm o s tc B s e e ： += s u b o p t i m a l ，c a nb eu s e di fn oo t h e rt i s s u ea v a i l a b l e ；0 = u s e l e s s * P r e s e r v

38、e di nf o r m a l i n - b a s e df i x a t i v e ( e g D i e 忙i c h Sf i x a t i v e ) f h h i s t o l o g y ；g l u t a r a l d e h y d e b a s e df i x a t i v ef o re l e c t r o nm i c r e s c o p y 9 5 e t h a n o l f o rP C Rt e s t i n g 4 鲤科鱼类常见疾病 由于斑马鱼属于鲤科鱼类，因此本文总结了一 些鲤科动物常见的感染性疾病 5 - 7 , 9

39、, 2 9 , 3 0 ，以期对斑 马鱼疫病净化有所帮助( 表2 7 ) 。 表2 鲤科动物病毒性疾病 T a b 2V i r a ld i s e a s e so fc y p r i n i d a ea n i m a l s 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o m pM e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 2 5 7 1 淡水鱼类细菌性败血症A 嗜水气单胞菌、 B 温和气单胞菌 C 鲁氏耶尔森菌 D 河弧菌生物变种 E 产碱假单胞菌 F 豚鼠气单胞菌 2 细菌性烂

40、鳃病 3 细菌性肠炎病 A 柱状屈桡杆菌 B 柱状嗜纤维菌 A 肠型点状气单胞菌 B 豚鼠气单胞菌 体表及内脏充血，出血，突眼腹部膨大，1 免疫预防 有淡黄色或红色腹水，肝、脾、肾肿大，花2 杀灭体外寄生虫 肝，脾紫黑色，严重贫血等3 外泼消毒药 4 内服鱼泰8 号或鱼服康药饲 鳃上黏液增多，腮丝肿胀，腐烂，鳃丝软 骨外霹 肠壁充血发炎，弹性差，有很多淡黄色粘 液，肛门红肿 4 赤皮病荧光假单胞菌体表的皮肤出血发炎，鳞片脱落 5 白头白嘴病类似细菌性烂鳃病的病原 自吻端至眼球处发白 6 溃烂病 7 白云病 8 竖鳞病 l O 疖疮病 嗜水气单胞菌 B 温和气单胞菌 C 豚鼠气单胞菌 A 恶臭假

41、单胞菌 B 洋葱假单胞菌 C 荧光假单胞菌 A 豚鼠气单胞菌 B 水型点状假单胞菌 1 免疫预防 2 外泼消毒药 3 外婆五倍子，或乌桕叶，或大黄 4 内服复方新诺明，或肠炎灵，或磺胺6 - 甲 氧嘧啶药饲 1 内服大蒜或地锦草、马齿苋、铁苋菜、辣 蓼、火炭木、马鞭草、凤尾草、穿心莲预防 2 治疗为内服肠炎灵或磺胺击甲氧嘧啶 3 病较严重时须同时外泼消毒药 1 外泼消毒药 2 疾病较重时内服药饲，同细菌性烂鳃病 3 亲鱼患病严重时可以肌肉注射磺酸链霉 素或治鳖灵号 1 外婆水产保护神，或进行药浴 2 同细菌性烂鳃病 体表病灶部位充血、发炎、溃烂，严重时1 免疫预防 可烂及骨骼、内脏2 外泼消毒

42、药 3 内服鱼泰8 号或鱼服康药饲 4 亲鱼病重肌注硫酸链霉素 最初体表有点状白色黏液物，严重时好1 外泼高锰酸钾或水产保护神 似全身布满一片白云 2 内服复方新诺明药饲 体表粗糙，鳞囊内积水，鳞片竖起 A 疖疮型点状气单胞菌背部有1 个或几个隆起，鳞片、皮肤完 B 豚鼠气单胞菌好，肌肉失去弹性，软化，严重时可烂破 1 外泼消毒药 2 内服磺胺6 一甲氧嘧啶、复方新诺明药饲 3 亲鱼病重，肌注硫酸链霉素 同竖鳞病 表4 鲤科动物真菌病 T a b 4 M y c o s i so fc y p f i n i d a ea n i m a l s 病名 1 ) i 8 e a ” 病原 P a

43、 t h o g e n s 主要症状 M a i ns y m p t o m s 主要防治方法 C o n t r o la n dt r e a t m e n t 水霉病 A 水霉、严重时呈灰白色棉毛状，卵呈“太阳耔” B 绵霉等 1 提高受精率，鱼体不受伤 2 外泼盐和小苏打，或亚甲基蓝 3 内服克霉唑 万方数据 5 8 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o “p M e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 V 0 1 1 9 N o 1 2 表5 鲤科动物原虫病 T a b 5 P r o t o z o o s

44、 i so fc y p f i n i d a ea n i m a l s 病名病原 主要症状 主要防治方法 D i s e a s e s P a t h o g e n s M a i ns y m p t o m sC o n t r o la n dt r e a t m e n t 表6 鲤科动物蠕虫病 T a b 6H e l m i n t h i a s i so fc y p r i n i d a ea n i m a l s 1 指环虫病指环虫极度不安，呼吸困难，腮丝肿胀，粘液 多，贫血 2 锚首虫病锚首虫 腮丝肿胀，粘液多，呼吸困难，贫血 3 三代虫病 4 双身虫病

45、 三代虫 双身虫 1 高锰酸钾或晶体敌百虫药浴 2 外泼强效杀虫灵或晶体敌百虫、克虫威 3 内服鱼虫清或克虫威( 内服型) 1 外泼克虫威或灭蠕灵 2 内服鱼虫清或克虫威( 内服型) 腮丝肿胀，粘液多，呼吸困难同指环虫病 腮丝肿胀，粘液多，呼吸困难，虫体大、同指环虫病 肉眼可见 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o m pM e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 25 9 表7 其他 T a b 7O t h e rd i s e a s e so fe y p r i n i

46、d a ea n i m a l s 参考文献： 【2 3 4 龙华，汪登强几种实验用鱼的研究现状 J 实验动物与比 较医学，2 0 0 5 ，2 5 ( 3 ) ：1 7 5 一1 8 1 K e n tM L ，J M S p i t o b e r g e nJ M 。e la 1 H e a l t hS e r v i c e sZ e b r a t l s h 5 D i s e a s e M a n u a l M Z I R C ，2 0 0 2 ：1 5 1 6 高昌，齐晓伟，孙德明，等斑马鱼干扰素的克隆表达研究 J 现代生物医学进展，2 0 0 9 ，9 ( 1 3 )

47、 ：2 4 2 1 2 4 2 3 P a w l s J F ，B u c kS S a m u e lb S ，e la 1 G n o t o b i o t i cz e b r a f i s hr e v e a l e v o l u t i o n a r i l yc o n s e r v e dr e s p o n s e st ot h eg u tm i c r o b i o t a J P N A s ， 2 0 0 4 1 0 1 ( 1 3 ) ：4 5 9 6 4 6 0 1 周平鱼种消毒技术 J 渔业致富指南2 0 0 7 ，3 ：4 5 谢岗，海波鱼体

48、消毒液的配制与使用 J 新农村，2 0 0 7 ， 1 0 ：2 4 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 2 月第1 9 卷第1 2 期C h i nJC o m pM e d ，D e c e m b e r2 0 0 9 ，V 0 1 1 9 N o 1 2 7 8 9 1 0 1 2 1 3 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 黄琪琰江育林，张奇亚，等淡水鱼病防治实用技术大全 M 北京：中国农业出版社2 0 0 5 ：5 4 1 5 5 6 陈晓倩，殷浩文斑马鱼饲养循环装置中的水生环境微生物 群落代谢 J 中国比较医学杂志，2 0 0 7 ，1 7 ( 2 ) ：1 1 0 1 1 4 陈毕华水产动物常见病害防治与用药手册 M 广州：广东 科技出版社。2 0 0 3 ：7 6 1 5 2 王集热带鱼养殖品种介绍一( 二十) 斑马鱼 J 内陆水产， 2 0 0 1 ，4 ：4 4 江千秋，刘东娥鱼类实验动物的生物学特性及研究 J 湖 南环境生物职业技术学院学报，2 0 0 6 ，1 2 ( 2 ) ：1 2 9 1 3 2 D r u b i nD A ，w a yJ C ，e ta 1 D e s i g n i n gb i o l o g i c a ls y s t e m s J G e n e D