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1、中国煤炭工业医学杂志2 0 0 5 年6 月第8 卷第6 期 6 4 9 文章编号 1 0 0 7 一 9 5 6 4 ( 2 0 0 5 ) 0 6 一 0 6 4 9 一 0 2 氯沙坦抑制血管成形术后内膜增殖及单核细胞聚集 0 6 3 0 0 0 河北省唐山市工人医院 马效尚小明闰 华王玉芳 关键词 氛沙坦; 血管再狭窄; 内 膜增殖; 单核细胞 中图分类号R 一 3 3 2文献标识码A 经皮冠状动脉血管成形术( P T C A ) 是目 前治疗冠心病安全 有效的方法之一， 但其术后高达3 0 %一5 0 %的再狭窄率严重 影响了 其远期疗效， 支架应用后也有2 0 %- 3 0 %患者
2、发生u l 使患者担负了昂贵的医疗费用。关于其形成的机制目 前认为 内 膜 增生 和 血 管 重 塑 是主 要原因 (2 l ， 平 滑 肌 细 胞 的 增 殖 造 成 血 管狭窄， 基质的增多及脂肪的堆积使血管舒张功能下降， 构成 血管再狭窄的基础。血管紧张素II ( A n g U ) 是肾素一 血管紧张 素( R A S ) 系统的主要活性物质， 并通过其特异性受体发挥生物 学效应。人的心脏以A T ; 为主， 目 前所知的血管紧张素n 对心 血管的作用主要由A T ， 介导， A T : 则有抗炎、 抗细胞增殖、 促 细胞凋亡、 介导血管松弛、 对抗A T ， 的缩血管等作用( 3 l
3、 。目 前 已认识到血管损伤通过激活炎症因子可诱发炎症反应， 单核细 胞渗透到血管壁是动脉硬化形成的一个关键起始步骤， 部分由 单核细胞趋化因子一 1 ( M C P 一 1 ) 调节。A T : 受体则可能通过 阻止M C P 一 1 表达而发挥抗炎症和抗动脉硬化作用。本实验 试图观察A T ; 受体阻滞剂对大鼠内皮剥脱后对内膜增殖和 M C P 一 1 表达水平的影响， 以期客观反映氯沙坦在预防血管再 狭窄过程中 所起作用和可能机制。 1 材料与方法 1 . 1 主要试剂和工具抗 M C P - 1 抗体和抗单核细胞抗体 由德国R o c h e 公司提供， 北京中山生物技术有限公司分装，
4、 采 用的显示系统为链卵白素标记的辣根过氧化物酶( H R P ) ， 显 色 底 物D A B . 病 理图 文 分 析 软 件 为 武 汉 同 济 瞩 科 大 学 清 平 公司提供的H P I A S 一1 0 0 0 系统。 1 . 2 动物模型制作动物模型制作参考改良的 F is h m a n 法 ， 雄性W is t a : 大鼠3 5 只， 体重0 . 2 3 - - 0 . 2 5 k g ， 随机分为 氯沙坦组( n = 1 7 ) 和对照组( n = 1 8 ) ， 以2 5 %的乌拉坦0 . 7 一 1 . O m l 腹腔麻醉， 待大鼠肌张力消失后， 剪除颈前毛发， 以
5、络 合碘消毒后， 用剪刀剪开颈前皮肤， 上至领下， 下至胸骨上端， 长约3 - - 4 c m ， 血管钳分离气管左侧筋膜， 游离出左侧颈总动 脉， 将近心端和远心端用血管夹夹闭， 以5 F套管针由近心端 向远心端穿刺， 成功后拔出针芯， 放出管腔内残存血液， 并于 远心端用针芯扎一小孔， 在套管针尾端接工业用氮气( 8 m 1/ m in ) , 5 m i n 后停止氮气， 拔出套管针， 撤除血管夹， 恢复血流， 同时局部压迫止血 1 O m i n ， 局部应用庆大霉素2 万U后逐层 缝合皮下组织和皮肤。术后标准饲料喂养， 其中氯沙坦组于 术后第二天开始予以氯沙坦3 m g 溶于3 m
6、1 生理盐水中灌胃， 1 次/ d 。对照组予以生理盐水3 m l 灌胃， 1 次/ d ， 于术后7 , 1 4 d 分别随机抽取8 只动物， 处死后取损伤段血管研究。 1 . 3 实验方法 1 . 3 . 1 采用病理图文分析系统进行血管分析大鼠经过量 麻醉后， 迅速剪开原颈部切口， 分离并剪下损伤段血管， 置于 4 %多聚甲醛中固定2 4 h ， 常规脱水， 浸蜡， 包埋， 用制备好的 石蜡块切成厚约5 11 m的石蜡切片， 用H E染色的切片进行分 析， 4 倍目 镜下采集血管横断面图像， 统计内膜面积。 1 . 3 . 2 免疫组化染色用制备好的石蜡块切成厚度为5 11 m 的石蜡切
7、片， 按照使用说明书步骤操作， 4 0 倍目 镜下统计着 色细胞数和未着色细胞数， 每张切片观察3 个视野， 每只动物 观察3 个切片， 求平均值。 1 . 4 统计学方法应用S T A T A 1 . 4 统计软件， 数据以三士: 表示， 不同组间差异比 较采用Z 检验。检验水准a = 0 . 0 5 0 2 结果 2 . 1 光镜下观察受损血管内膜增生情况 损伤7 d 切片可见 新生内膜形成， 管壁已有内皮细胞覆盖， 内膜部分细胞核丰 富， 呈增生像， 血管中层可见弹力纤维增多， 管腔变狭窄。损 伤后1 4 d 切片可见新生内膜进一步增厚， 内皮层已形成完全， 管腔进一步狭窄。 2 . 2
8、 利用病理图文系统对血管壁面积的测量在H E染色 下， 4 倍目 镜采集图像， 取管腔横断面测量， 7 d 氯沙坦组平均 血管内膜面积为( 1 2 9 . 7 士 3 . 0 2 ) m m 2 ， 对照组为平均血管内膜 面积( 1 6 0 . 7 1 3 . 6 1 ) m m 2 , 抓沙坦组较对照组平均血管内 膜面 P a t h o l , 1 9 9 8 , 1 5 2 ( 3 ) ; 8 2 1 - 8 2 8 1 9 章巍， 刘新民， 李海潮， 等. 博莱霉素致大鼠肺纤维化模型肺组 织 MMP 一 2 , MMP一9 , MT 1 一MMP及 T I MP一1 , T I MP一
9、 2 的表达 J ) . 北京大学学报( 医学版) , 2 0 0 2 , 3 4 ( 6 ) : 7 1 6 - 7 2 1 1 0 1 S u g a M, I y c n a g a K , O k a m o t o T , e t a l . E l e v a t io n o f m a t r ix m e t a l - l o p r o t e in a s e a c t iv it y in id io p a t h ic in t e r s t it i a l p n e u m o n i a s J . A m J R e s p i r C r i t
10、C a r e Me d , 2 0 0 0 , 1 6 2 ( 5 ) : 1 9 4 9 - 1 9 5 6 1 1 G i b b s D F , S h a n l e y T P , Wa rn e r R L , e t a l . R o l e o f m a t r ix m e t a l l o - p r o t e i n a s e s i n m o d e l s o f m a t r o p h a g e 一d e p e n d e n t a c u t e l u n g i n j u - ry. E v i d e n c e f o r a l
11、 v e o l a r m a c rop h a g e a s s o u r c e o f p r o t e i n a s e s 1 2 1 3 J ) . A m J R e s p i r C e l l Mo l B io l , 1 9 9 9 , 2 0 ( 6 ) : 1 1 4 5 - 1 1 5 4 卢韶华， 张农， 张秀荣， 等. 大鼠肺纤维化模型间质成纤维细胞 和肺泡巨噬细胞基质金属蛋白酶2 及膜型基质金属蛋白酶 m R N A的表达 J . 中华结核和呼吸杂志， 2 0 0 1 , 2 4 ( 9 ) : 5 2 7 - 5 3 0 B a r o n i
12、 T , B o d o M, D A l e s s a n d r o A , e t a l . S i l i c a a n d i t s a n t a g o - n i s t ic e f f e c t s o n t r a n s f o r m in g g ro w t h f a c t o r 一 日 in l u n g f ib r o b l a s t e x t r a c e l l u l a r m a t r i x p r o d u c t io n J . J I n v e s t in g M e d , 2 0 0 1 , 4 9
13、 ( 2 ) : 1 4 6 - 1 5 6 2 0 0 4 -1 1 -3 0 收稿 2 0 0 5 -0 3 -2 1 修回 华北煤炭医学院附属医院 6 5 0C h i n e s e J o u rna l o f C o a l I n d u s t ry Me d i c i n e J u n e 2 0 0 5 , V o l . 8 , N o . 6 积增加减少， 差异有统计学意义( P 0 . 0 5 ) 0 1 4 d 氯沙坦组平 均血管内 膜面积为( 1 7 2 . 4 1 1 . 8 7 ) m m a ， 对照组平均血管内膜 面积为( 2 3 6 . 6 土 1
14、 . 9 7 ) m 耐， 氯沙坦组较对照组平均血管内膜 面积增加减少， 差异有统计学意义( 尸0 . 0 5 ) 0 2 . 3 免疫组化染色免疫组化方法显示血管损伤后该部位 单核细胞表达情况。7 d 对照组阳性细胞数( 5 2 0 1 1 4 ) , 抓沙 坦组阳性细胞数( 2 4 9 士 6 ) , 氯沙坦组较对照组明显下降， 尸 0 . 0 5 。应用抗M C P 一 1 抗体标测损伤血管壁M C P 一 1 表达情 况， 我们发现 M C P 一1 蛋白主要存在于血管内膜和中膜， MC P 一1 染色在氯沙坦组较对照组染色更浓， 提示对照组 MC P 一 1 表达更强。 3 讨论 冠
15、状动脉硬化是一种炎症性疾病。血管损伤诱导炎症反 应成为内膜增生一个重要原因。内膜增生为术后再狭窄一个 重要原因。现在已认识到血管损伤会引起炎症反应. 单核细 胞趋化因子可能会参与再狭窄机制。血管损伤使内皮损伤， 并成为循环血中血小板、 单核细胞、 淋巴细胞粘附聚集的场 所， 并释放多种细胞因子、 趋化因子、 生长因子， 吸引血管平滑 肌( V S M C ) 迁移至内膜， 增殖、 分泌基质， 并通过激活趋化因 子而加速单核细胞的激活和沉积而促进炎症反应。单核细胞 趋化因子一 1 ( M C P - 1 ) 是对单核细胞一个有力的趋化因子， 去除M C P - 1 基因或应用M C P 一1 阻
16、滞剂已被证明可减低 高胆固 醇饮 食鼠 动 脉硬化形成1 5 1 . M C P 一 1 阻滞剂C C R 2 可 阻止狭窄形成。已观察到A T , 受体介导的M C P 一 1 表达在 应用络氨酸激酶抑制剂和丝裂原激活蛋白激酶阻滞剂后减 低， A T : 受体可激活磷酸酶如 M K P 一 1 , P P 2 A等， 它们导致 A T ， 受体失活和生长因子诱导细胞内信号转导途径激酶失 活。因此可以想象特定的磷酸酶可能阻止了A T : 受体介导 的M C P 一 1 生成途径。本实验应用抗 M C P 一 1 抗体显示损 伤血管壁上 MC P - 1 表达情况， 我们发现 MC P 一1 蛋
17、白主要 存在于血管内 膜和中 膜， 结果显示对照组在血管损伤后7 d 染 色明显强于氯沙坦组， 提示 MC P 一1 表达可能明显低于对照 组， 提示氯沙坦有可能通过阻止A T ， 受体及激活A T Z 受体发 挥阻止M C P 一 1 表达作用。同时应用抗单核细胞抗体显示损 伤血管壁上单核细胞表达情况， 7 d 对照组阳性细胞数( 5 2 0 1 1 4 ) , 氯沙坦组阳性细胞数( 2 4 9 16 ) , 氯沙坦组较对照组明显 下降( P 0 . 0 5 ) o A T , R阻滞剂氯沙坦可以通过阻断A T , R 并通过未被阻断的A T Z R发挥通过抑制M C P 一 1 表达抑制单
18、 核细胞等炎症细胞聚集浸润而抑制血管损伤后炎症反应。 抓沙坦是选择性A T ; 受体阻滞剂， 它的降压、 改善心室 重构等有益作用与它对A T , 受体的完全阻断有关， 而未被阻 断的A T Z 受体同时起到协同作用。血管紧张素II 是肾素一 血管紧张素( R A S ) 系统的主要活性物质， 并通过其特异性受 体发挥生物学效应。血管紧张素n 受体根据其药理学和生物 化学特性可分为多个亚型， 其中以A T ; 和A T Z 研究较多。血 管紧张素II 大部分作用是由A T ， 受体介导的， 如血管收缩、 醛固酮和垂体后叶素的释放、 促血管平滑肌细胞增殖等。离 体和在体研究表明血管紧张素II 通
19、过A T ; 受体促进血管平 滑肌的迁移和增殖、 肥大， 在血管内膜增生中起重要作用。其 机制可能与增加细胞内钙离子浓度、 促进平滑肌细胞分泌转 移生长因子、 在转录水平上调平滑肌细胞环氧化酶的表达、 激 活丝裂原蛋白激酶、 下调C - f o s 等基因有关。同时它还抑制 细胞凋亡。其机制可能有通过影响凋亡相关基因表达而调节 血管平滑肌凋亡， 如B c l 一 2 , B a x 等。而A T , 受体则具有拮抗 A T ， 受体的作用。其明确的作用尚不十分清楚。有研究表明 在胚胎后期应用A T Z 受体阻滞剂能减低鼠大动脉D N A合成 的下降趋势， 提示A T Z 受体介导的抗生长作用，
20、 A T Z 受体介 导的抗生长作用还可能通过抑制生长因子的生长刺激作用或 其他机制如凋亡而完成。应用转基因技术使A T , 受体在血 管平滑肌上表达， 研究发现， 血管紧张素II 明显促进对照组血 管平滑肌数量增加， 这种增加可被A T ; 受体阻止， 从而证明 A T ; 激活可促进血管平滑肌增殖。另一方面在共同表达A T Z 受体的细胞， 血管紧张素II对细胞数量的增加影响很小或没 有， 而应用A T : 阻滞剂可显示出A T ， 的促增生作用， 提示 A T , 的抗增生作用。同时发现接受球囊损伤后， 转染A T Z 鼠 内 膜增生面积明显小于对照组， 此作用为A T Z 阻滞剂阻止，
21、 提示A T Z 受体抑制内膜增生作用。在血管损伤后内膜增殖 过程中A T Z 受体通过拮抗A T ， 受体起到抗增殖和促凋亡作 用。A T : 受体引起的细胞凋亡部分由B c 卜2 蛋白家族控制。 B c l 一 2 家族的磷酸化和去磷酸化是转化其功能调节的一个机 制。在P C 1 2 W细胞神经生长因子( N G F ) 通过E R K依赖的磷 酸化而激活B c l 一 2 , A T , 受体通过阻止E R K活性而阻止B c l 一 2 磷酸化因此诱导凋亡。应用A T Z 受体另一重要作用是介 导内源性激动剂抑制D N A合成和抑制细胞增殖。本实验血 管损伤后7 d 对照组损伤血管内膜
22、面积( 1 6 0 . 7 士 3 . 6 1 ) m 耐， 抓沙坦组平均血管内膜面积为( 1 2 9 . 7 士 3 . 0 2 ) m 时， 氯沙坦组 较对照组平均血管内膜面积增加减少差异有统计学意义( 尸 0 . 0 5 ) 0 1 4 d 氯沙坦组平均血管内膜面积为( 1 7 2 . 4 士 1 . 8 7 ) m m 2 ， 对照组 平均血管内 膜面积为( 2 3 6 . 6 土 1 . 9 7 ) m m 2 , 氯沙 坦组较对照组平均血管内膜面积增加减少差异有统计学意义 ( P 0 . 0 5 ) 。提示氛沙坦有可能通过阻止A T , 受体及激活 A T , 受体发挥抑制内膜增生
23、作用。 4 参考文献 1 N o b u y o s h i M, K im u ry T , N o s a k a H , e t a . R e s t e n o s i s a f t e r s u c - c e s s f u l p e r c u t a n e o u s t r a n s l u m i n a l c o r o n a r y a n g i o p l a s t y : s e r i a l a n - g eo g r a p h i c f o l lo w一u p o f 2 2 9 p a t ie n t s J . J A m C
24、 o ll C a r d io l , 1 9 9 8 , 1 2 : 6 1 6 - 6 2 3 2 M a c l e o d D C , S t r a u s s B H , J o n g M, e t a l : P ro l i f e r a t io n a n d e x t r a - c e l l u l a r m a t r i x s y n t h e s i s o f s m o o t h m u s c l a r c e l l s c u l t u r e d f r o m h u m a n c o ro n a r y a t h e r
25、 o s c l e r o t ic a n d r e s t e n o t i c l e s io n s J . J A m C o l l C a r d i o l , 1 9 9 4 , 2 3 : 5 9 - 6 5 3 廖瑞芳， 关永源. 血管紧张素II2 型受体研究进展【 J . 中国动 脉硬化杂志， 2 0 0 1 , 9 ( 4 ) : 3 5 3 - 3 5 6 4 F is h m a n J A , R y a n G B , K a m o v s k y M J . E n d o t h e l ia l r e g e n e r a t io n i
26、 n t h e r a t c a ro t i d a rt e r y a n d t h e s ig n i f i c i a n c e o f e n d o t h e l i a l d e n u - d a t io n in t h e p a t h o g e n e s i s o f m y o i n t im a l t h i c k e n i n g J . L a b I n - v e s t , 1 9 7 5 , 3 2 : 3 3 9 - 3 5 1 5 G u L , O k a d a Y , C l in t o n S K , G
27、e r a r d C , e t a l . A b s e n c e o f m o n o - c y t e c h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n一1 r e d u c e s a t h e r o s c l e r o s i s i n l o w d e n s i t y l ip o p r o t e i n r e c e p t o r 一d e f i c in t m i c e J . Mo le c u l a r C e ll , 1 9 9 8 , 2 ; 2 7 5 - 2 8 1 2 0 0 5 -0 3 -0 3 收稿2 0 0 5 -0 3 -1 8 修回