永生化的骨髓基质细胞移植对损伤脊髓的保护作用.pdf

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1、收稿日期:2 0 0 6-0 5-2 9 作者简介:钟海虹(1 9 6 3-) , 女, 实验师, 主要从事实验动物学研究。 永生化的骨髓基质细胞移植 对损伤脊髓的保护作用 钟海虹, 布 林, 陈继铭 ( 广东医学院第一临床学院外科学教研室, 广东 湛江5 2 4 0 0 1) 摘要:目的: 观察永生化的骨髓基质细胞(B o n em a r r o ws t e mc e l l s,BM S C s) 移植对损伤脊髓的保护作用。方法: 将 脊髓横断伤S D大鼠模型, 随机分为损伤对照组(A组) 、BM S C s移植组(B组) 、 神经营养因子(N e r v eg r o w t hf

2、a c - t o r,NG F) 、 脑源性神经生长因子(B r a i nD e r i v e dn e r v eg r o w t hf a c t o r,B D N F) 基因修饰后永生化的BM S C s移植组 (C组) 和正常对照组(D组) 。术后2 4h后每组8只动物取脊髓伤段标本, 测水离子含量。其余动物第6、1 2周, 每 组8只动物进行爬坡试验, 评价下肢运动功能及运动诱发电位(ME P) 检测。结果: 脊髓损伤(S C I) 后组织水肿, N a +、 C a 2+离子浓度升高, K+、 M g 2+离子浓度降低。NG F、 B D N F基因修饰后永生化的骨髓基质

3、细胞脊髓内移植后 显著改善这些变化, 且使S C I后神经功能有显著恢复。结论:NG F、B D N F基因修饰后永生化的BM S C s脊髓内移 植对S C I有保护作用。其机制可能与减少神经细胞离子失衡, 改善细胞内环境有关。 关键词:永生化的骨髓基质细胞;神经营养因子;脊髓损伤;移植 中图分类号:R-3 3 2 文献标识码:A 文章编号:1 0 0 9-8 1 9 4(2 0 0 6)0 8-0 0 0 7-0 3 P r o t e c t i v eE f f e c t so f I n t r a c o r dT r a n s p l a n t a t i o no f I

4、 mm o r t a l i z e d B o n eM a r r o wS t e mC e l l so nS p i n a lC o r dI n j u r y Z H O N GH a i - h o n g,B UL i n,C H E NJ i - m i n g (D e a p r t m e n t o fS u r g e r y, F i r s tC l i n i c a lH o s p i t a l o fG u a n g d o n gM e d i c a lC o l l e g e Z h a n j i a n g5 2 4 0 0 1,C

5、 h i n a) A b s t r a c t:O b j e c t i v e:T o i n v e s t i g a t e t h ep r o t e c t i v ee f f e c t so f i n t r a c o r dt r a n s p l a n t a t i o no f i mm o r t a l - i z e dB o n em a r r o ws t e mc e l l so ns p i n a l c o r d i n j u r y . M e t h o d s:S p i n a l c o r d i n j u r

6、e dr a t sw e r ed i v i d e d i n t o3g r o u p s . G r o u pCc o n s i s t e do ft h er a tw i t ht r e a t e dw i t ht h et r a n s p l a n t a t i o no fm o d i f i e d NG F、B D N Fg e n e sBMS C s(a f t e r i mm o r t a l i z e d) ;g r o u pBo f t h er a t sw i t ht r a n s p l a n t a t i o no

7、 fBM - S C sw i t h o u t .i mm o r t a l i z e d;A t2 4ha f t e ro p e r a t i o n,8r a t so fe a c hg r o u pw e r ek i l l e da n dt h e i n - j u e r e ds e g m e n t o f t h e s p i n a l c o r dw a s r e s e c t e d t ob e e x a m i n e dw i t ha t o m i c a b s o r p t i o ns p e c t r o p h

8、o - t o m e t r y. A t6w e e k s a n d1 2w e e k s a f t e r t r a n s p l a n t a t i o n,t h e a n o t h e r r a t sw e r e e x a m i n e dw i t hn e u - r o l o g i c a l f u n c t i o n t e s t a n dME Pm o n i t o r i n g . R e s u l t s:t h e r ew a s a s i g n i f i c a n t i n c r e a s eo f

9、w a t e r c o n - t a n ta n dN a +、 C a 2+i o n sa n dd e c r e a s e do fK+、 M g 2+i o n s i nt h e i n j u r e dc o r ds e g m e n to fg r o u pC a n das t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t r e c o v e r yw a so b s e r v e di ng r o u pC. C o n c l u s i o n:T h et r a n s p l a n t a t

10、 i o n o f i mm o r t a l i z e dBMS C s(m o d i f i e do fNG F、B D N Fg e n e s)e x e r tp r o t e c t i v ee f f e c t so ni n j u r e ds e g - m e n to f s p i n a l c o r dt h r o u g ht h e i m p r o v e m e n to f t h e i n e r n a l i o ne n v i r o m e n to f s p i n a l c o r d . K e yw o r

11、 d s:i mm o r t a l i z e db o n em a r r o ws t e mc e l l s;T N F s;s p i n a l c o r di n j u r y;t r a n s p l a n t a t i o n 本实验将NG F、B D N F基因修饰后永生化的骨 髓 基 质 细 胞 (i mm o r t a l i z e d B o n e m a r r o w s t e m c e l l s,BMS C s) 植入脊髓损伤(S C I) 灶, 观察其对损 伤脊髓的保护作用。 7 实用临床医学2 0 0 6年第7卷第8期 P r a

12、 c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e,2 0 0 6,V o l 7,N o 8 1 材料与方法 1) 骨髓基质细胞的培养:S D大鼠( 鼠龄24 个月) 过量麻醉处死, 取出股骨和胫骨, 无菌条件下 剪开骨髓腔, 用缓冲液冲洗出骨髓组织, 2. 5m L注 器反复抽吸冲出的细胞使其分离,2 0 0g离心1 0 m i n, 去上清,DMEM培养基, 培养基中含1 0%的胎 牛血清, 2m L -谷氨酰胺,1 0 0U/m L的青霉素、1 0 0 m g /m L的链霉素。细胞种植密度为80 0 0个/c m 2, 2 4h后换培液, 此时贴壁

13、细胞较少, 细胞长至融合 时传代; 用0. 2 5%的胰蛋白酶1m LE D TA3 7消 化细胞34m i n, 离心, 细胞稀释23倍传至培养 瓶中培养, 23d换半量培养液。 2) BMS C s免疫与鉴定: 经纯化培养的细胞行 胶质原纤维酸性蛋白(G F A P) 和P 7 5免疫组化双染 色。如果双染色阳性则证实为BMS C s 1。 3) 标记BMS C s: 将培养1 01 4d的BMS C s 消化成细胞悬液, 以1 0g/m L的浓度加入双苯亚 甲胺标记BMS C s细胞核。通过细胞计数, 使细胞 浓度缩到5 00 0 0个/ L。 4) 细胞永生化(NG FD NA和B D

14、 N FD NA 传染) : ( 1) 将0. 1 m L的苯亚甲胺标记的BMS C s ( 5 00 0 0个/L) 重悬于2m L完全培养液中, 转种于 3 5mm培养皿中3 7, 体积分数5%C O2培养和培 养81 2h。使细胞达到5 0%8 0%才融合。然后 在1 2mm7 5mm试管中待备用。( 2) 制备A、B 两种溶液, 4g质粒NG FD NA、B D N FD NA溶于 1 0 0L无血清DMEM培养液中为溶液A;2 0L 脂质转染酶稀释于8 0L无血清DMEM培养液 中, 为溶液B。合并A、B溶液置室温1 5m i n, 混均 后滴加备好的BMS C s, 置5 0%C

15、O 2培养箱培养2 4 h。按1:4密度传代培养1 0d。移至2 4孔板继续 培养, 用0. 2 5%胰蛋白酶消化, 并将细胞转移于多 个瓶中扩增, 制成单细胞悬液 5, 细胞密度为2. 5 1 0 4/ L备用。 5) 脊髓损伤动物模型的制备:S D大鼠1 0 0只 ( 本院实验动物中心提供) , 腹腔内注射戊巴比妥钠 4 0m g / k g 麻醉, 以大鼠T 1 2为中心, 正中切口暴露 硬脊膜, 用弯刀将左半侧的脊髓横向切断, 再用负压 吸引器吸出脊髓组织, 使形成一个2mm2mm2 mm的间隙。选9 6只大鼠。9 6只动物模型分为: 损伤对照组(A组) 、BMS C s静脉移植组(B

16、组) 、 NG F、B D N F基因修饰的BMS C s静脉 移 植 组 (C 组) 和正常对照组(D组) 。每组2 4只。将永生化的 单细胞悬液3L, 浸透在与缩主脊髓间隙大小一致 的明胶海绵上, 并将其植入在C组动物模型中, 确 认后缝合硬脊膜、 肌层、 皮肤。同样B组植入浸透 高纯化BMS C s的明胶海绵,A组仅植入明胶海绵。 6) 观察指标: (1) 术后2 4h后每组8只动物 取脊髓伤段标本, 测水离子含量。( 2) 术后4、6周分 别行 诱 发 电 位 检 查, 麻 醉 方 法 同 上。使 用 美 国 N i c o l e t公司产V i k i n g型诱发电位仪。采用经颅

17、磁 刺激, 刺激强度8 0%, 记录电极置于小腿三头肌。 参考电极及地线分别置于同侧跟腱及膝部。刺激频 率4H z, 波宽为0. 2m s, 强度4 06 0mV, 信号经前 置放大器放大1 0万倍, 计算机叠加3 0 0次。( 3) 术 后4、 6周, 每组8只动物进行爬坡实验。使用倾斜 4 5 5 0 的钢丝网, 其长3 0c m, 宽2 0c m, 动物由下 向上爬行。下肢运动功能评价: 0级, 下肢无收缩; 级, 下肢肌肉有收缩, 髋膝关节无活动;级, 髋、 膝关节有活动, 但不能承重;级, 能承重但不能主 动攀登;级, 能主动攀登。 7) 统计学处理: 经S P S S 1 0. 0

18、统计软件处 理, 采用多元方差分析, 计量资料以xs表示, 选择 P0. 0 5为差异有显著性标准。 2 结果 1) 脊髓水肿程度及离子含量: 与正常对照组 相比较,A组含水量及N a +、 C a 2+ 离子含量增加, K+、 M g 2+离子含量下降( P0. 0 5) 。C组含水量及 N a +、 C a 2+ 离子含量降低,K+、 M g 2+ 离子含量升 高。详见表1。 表1 永生化BM S C s对S C I后组织水肿及离子含量的影响 n=8,xs,m b/ (m o l k g ) 组别 H20(%)N a + C a 2+ K+M g 2+ A组7 8. 8 39. 0 13

19、2 4. 0 61 3. 9 99. 7 11. 4 38 5. 4 53 3. 1 11 3. 0 80. 0 4 B组4 3. 0 05. 4 42 1 6. 8 81 8. 0 28. 0 70. 6 21 9 2. 0 01 4. 9 71 5. 0 30. 8 9 C组1 3. 0 03. 8 02 0 8. 9 82 0. 7 97. 2 10. 7 71 9 8. 7 50. 6 61 4. 1 11. 1 3 D组6 1. 1 00. 9 81 2 9. 8 87. 0 24. 6 41. 2 12 0 2. 3 61 7. 8 21 7. 3 40. 7 2 C组与A、B、D

20、组比较:P0. 0 5;A组与B、 C、D组比较:P0. 0 5 8 实用临床医学2 0 0 6年第7卷第8期 P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e,2 0 0 6,V o l 7,N o 8 2) 诱发电位检查: 正常对照组检查S E P和 ME P, 结果是(2. 4 40. 5 1)m s和(1. 6 90. 5 1)m s。 术后2周对各组均记录不到下肢S E P和ME P, 术 后4周可记录到下肢S E P和ME P。随时间的延 长, 各组S E P和ME P潜峰时逐渐缩短。术后各组 S E P和ME P检查结果见表2、3。

21、 表2 各组ME P潜峰时间( xs,m s) 组别 n 治疗后4周治疗后6周 A组85. 7 90. 6 84. 7 10. 6 1 B组83. 9 10. 4 7&2. 6 00. 2 0& C组82. 3 10. 4 31. 5 40. 5 6 与A组比较:&P0. 0 5,P0. 0 1 与B组比较:P0. 0 5 表3 各组S E P潜峰时间( xs,m s) 组别 n 治疗后4周治疗后6周 A组84. 7 81. 5 14. 3 12. 9 1 B组83. 2 00. 5 0&2. 9 10. 7 7& C组82. 2 90. 7 42. 0 60. 0 2 与A组比较:&P0.

22、0 5,P0. 0 1 与B组比较:P0. 0 5 3) 下肢功能: 治疗2、4周时, 实验组和对照组 ( 正常对照组除外) , 动物双下肢均瘫痪, 爬坡实验为 0级。治疗6周,A组动物肌力恢复0级、B组 级、 C组级。 3 讨论 本研究通过向脊髓损伤灶内移植NG F、B D N F 基因修饰后永生化的BMS C s观察到大鼠损伤脊髓 功能得到恢复。表明移植永生化的BMS C s能抑制 S C I后的细胞凋亡及促进脊髓细胞再生作用 2 - 3。 但其机制不清楚, 为此笔者选择离子内环境的变化 进行观察。结果发现脊髓损伤后N a +、 C a 2+离子含 量增加,K+、 M g 2+离子含量下降

23、, 导致细胞水肿, 功 能紊乱, 细胞内压力增高, 从而引起内环境障碍, 组 织缺血、 缺氧加重, 最终胞溶。C a 2+细胞内超载使 线粒体氧化磷酸化脱偶联导致AT P耗竭, 激活磷 脂A和C造成组织损伤, 激活蛋白酶和核酸酶等使 蛋白和核酸分解, 导致细胞死亡。 M g 2+含量降低, 影响细胞膜的通透性, 损害N a +、 C a 2+、 K+的浓度 梯度, 脊髓继发损伤加重。 实验表明NG F、B D N F基因修饰后永生化的 BMS C s移植S C I灶后, 组织水肿减轻,N a +、 C a 2+离 子含量降低,K+、 M g 2+离子含量升高, 这提示永生 化的BMS C s对

24、S C I后的保护作用与其减少神经细 胞离子失衡, 改善细胞内环境有关。笔者认为这种 作用可能主要与BMS C s所分泌的神经营养因子 (NT F) 有关。脊髓损伤后神经元神 经 营 养 因 子 (NT F) 表达增加或重新表达, 那些得不到足够NT F 的神经元将发生死亡 3。 BMS C s是在骨髓除造血干细胞之外, 另一类具 有干细胞特点的可向多种非造血组织分化的细胞, 在体内和体外分化为神经细胞。C h e nJ等 4的研 究显示, BMS C s通过静脉移植后能够进入大鼠脑缺 血模型的脑组织中, 并使脑缺血组鼠的行为学有了 明显的改善。在脑缺血2 4h的大鼠模型, 尾静脉注 射BMS

25、 C s, 7d后E L I S A检测B D N F、NG F发现, 治疗组的B D N F、NG F较对照组明显高。表明BM - S C s能 通 过 血 脑 ( 脊 髓)屏 障,并 在 靶 点 分 泌 NT F 5。但单纯移植 BMS C s其存活时间与分泌 NT F有限。因此笔者把NG F、B D N F基因修饰永 生化后的BMS C植入脊髓损伤大鼠模型, 从而BM - S C在体内生存时间延长及分泌NT F功能增强。永 生化的BMS C对轴突提供良好的内环境及对S C I 保护作用增强。其机制可能与减少神经细胞离子失 衡, 改善细胞内环境有关。 参考文献: 1 杨立业, 刘相名, 惠

26、国桢, 等.骨髓基质细胞成年大鼠脑内移植 J.中华神经外科杂志,2 0 0 3,3(1 9) :2 1 6-2 1 9. 2 TU S Z YN S K I M H,GA B R I E L K,GAG E F H,e ta l . N e r v e G r o u t hF a c t o rD e l i v e r gb yG e n eT r a n s f e r I n d u c e sD i f f e r e n t i a l O u t g r o w t ho fS e n s o r g,M o t o ra n dN o a r a d r e n e r g i

27、 cN e u r i t i sa f - t e rA d u l tR a t sS p i n lC o r dI n j u r yJ. E x pN e u r o l,1 9 9 6,1 3 7 (1) :1 5 7-1 3 7. 3 S AN CHE ZJ,S ONGS,C A R D O Z OF,e ta l . A d u l tB o n eM a r - r o wS t r o m a cC e l l sD i f f e r e n t i a t e i nt oN e u r a lC e l l s i nV i f r oJ. E x pN e u r

28、o l,2 0 0 0,1 6 4:2 4 7. 4 CHE NJ,L IY,CHO P P M. I n t r a c e r e b r a lT r a n s p l a n t a t i o no f B o n eM a r r o ww i t hB D N Fa f t e rMC AOi nR a tJ. N e u r o p h a r - m a c o l o g y,2 0 0 0,3 9:7 1 1. 5 B RUN C L L N,R E YNO L D S M,WA R THA L L R,e ta l . I n - c r e a s e dN e r v eG r o w t hF a c t o rmRNA R a tS p i n a lC o r dJ. N e u o s c iL e t t,1 9 9 0,1 1 8(2) :2 8 8-2 9 2. 9 实用临床医学2 0 0 6年第7卷第8期 P r a c t i c a l C l i n i c a lM e d i c i n e,2 0 0 6,V o l 7,N o 8