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1、 群体遗传学研究 湖北土家族人群 HLA-A、 B 等位基因及 单倍型多态性的分布 邱小萍谭云左泽华魏芸伍欣星 【摘要】 目的研究湖北五峰县土家族 190 名无亲缘关系健康个体 HLA-A、B 等位基因及单倍型频 率的分布， 为进一步研究 HLA 基因多态性与疾病的关联奠定基础。方法采用序列分型 （sequence-based typing ， SBT） 法对最具多态性的 HLA-A、B 基因 2、 3 外显子进行了基因型分析， 采用 Arlequin 软件对群体基 因、 单倍型频率进行最大估计值的计算。结果HLA-A、 B 等位基因符合 Hardy-Weinberg 平衡定律 （ P 0.0
2、5） ， 无显著的连锁不平衡现象， 共检测出 26 个 HLA-A 等位基因及 41 个 HLA- B 等位基因， 其中频率最高 的为 A*0201 （0. 16053） ， A*110101 （0. 14737） ， A*24020101 （0. 14211） ， B* 4001 （0. 14737） ， B*4601 （0.13947） ， 其次为 A*0207 （0.08947） ， A*0206 （0.08158） ， B*1301 （0.07632） ， B*5801 （0.08947） ， B*1501 （0.09737） ， 而大于 0.05%的为 A*330301 （0.055
3、26） ，B*1502（0.05526） ， B*3501 （0.05263） ， 单倍型分布较 普遍的为 A*0202-B*4001 （0.04196） ， A*0201-B*4601 （0.03625） 。结论 采用高分辨测序分型法对土家 族人群 HLA-A、 B 等位基因进行分型的实验结果可做为湖北土家族人 HLA-A、B 等位基因、 单倍型频率的群 体资料， 对进一步开展群体遗传学、 临床器官移植、 疾病关联、 HLA 遗传学特征、 法医学、 人类学等研究具有 重要意义。 【关键词】 土家族； 人白细胞抗原； 单倍型； 遗传多态性 Distribution of HLA-A， -B a
4、llele and haplotype polymorphism in the Tu nationality of Hubei province in China* QIU Xiao-ping，TAN Yun，ZUO Zhe-hua，WEI Yun，WU Xin-xing .（Department of Molecular Virology，Research Institute of Virology，School of Medicine，Wuhan University，Wuhan，Hubei，430071 P . R . China . Email： qiuxp8488 sohu . co
5、m） Corresponding author：WU Xin-xing，Email： wuxinxing975sohu . com 【Abstract】 ObjectiveTo investigate the genetic diversity in Chinese populations. And HLA-A， -B alleles and haplotypes of 190 unrelated healthy individuals of Tu nationality from Wufeng county Hubei province were identified for the ass
6、ociated studies of HLA gene polymorphism and disease. MethodsThe high-resolution typing methods sequence-based typing（SBT）was used to define the most polymorphism of exons 2 and 3 of the HLA-A， -B locus alleles. The allele and haplotype frequencies were calculated by maximum likelihood estimation wi
7、th Arlequin software. ResultsHLA-A， -B alleles were found to be in Hardy-Weinberg equilibrium（P 0.05） . A total of 26 HLA-A and 41 HLA-B alleles were detected. The most frequent alleles were A*0201 （0. 16053） ，A*110101 （0. 14737） ，A* 24020101 （0.14211） ，B*4001 （0. 14737） ，B*4601 （0. 13947） ，followed
8、 by A*0207 （0. 08947） ，A*0206 （0.08158） ， B*1301 （0.07632） ，B*5801 （0.08947） ，B*1501 （0.09737） . The frequencies of following alleles to be A*330301 （0.05526） ，B*1502（0.05526） ，B*3501（0.05263）were all higher than 0.05. The extensive HLA-A-B haplotypes were observed，and the most common haplotypes wer
9、e A*0202-B*4001 （0.04196） ，A*0201-B*4601 （0.03625） . ConclusionsIn the present study，we first analyzed the HLA-A， B gene typing with SBT，all of these re- sults will be the basic and reference data for Tu race，and also will have the applications available to trace the population migration，clinical or
10、gan transplantation，disease-asssociated study，HLA genetic feature and forensic identification. 【Key words】 Tu nationality； human leukocyte antigen； haplotype； genetic polymorphism *Project No. 30171042，supported by the National Natural Science Foundation of China HLA 复合体是位于第 6 号染色体短臂 6p21.3 一组紧密连 锁的
11、基因群， 包括类、类和类基因， 是迄今已知人体最复 基金项目： 国家自然科学基金 （30171042） 作者单位： 430071 武汉大学医学院病毒研究所分子病毒室 通信作者： 伍欣星， Email：wuxinxing975 杂的基因复合体， 具有高度的多态性， 由于分子生物学技术的 应用， 近年来 HLA 多态性的数目已增加了 8 9 倍，类和类 基因大约有 1904 个等位基因被检测。类基因区位于着丝点 的远端， 包括 3 种经典的类基因 HLA-A、 B、 C 和 非 经 典 的 HLA-E、 F、 G 1-3。到 2005 年 1 月已确认的 HLA-A、 B、 C、 E、 F 和
12、G 等位基因数分别为 349、 626、 182、 5、 2 和 15 （http： / / www. ihwg. 912中华医学遗传学杂志 2006 年 4 月第 23 卷第 2 期Chin J Med Genet，April 2006，Vol. 23，No. 2 org） 。HLA 的高度多态性显示了遗传背景的多样性， 不同民族 和地区的人群其 HLA 基因型和频率分布有很大差异， 我们对湖 北五峰县土家族 190 名无血缘关系健康个体的 HLA-A、 B 等位 基因及单倍型频率进行研究， 为进一步研究 HLA 基因多态与疾 病关联奠定基础。 1对象与方法 1.1研究人群及基因组 DNA
13、的提取190 份血样品均来自湖 北省五峰县土家族无血缘关系的健康个体， 居住地、 民族及健 康状况采用问卷形式获得。抽取各研究对象外周血 2 mL 加 EDTA - 20储存， 基因组 DNA 可通过外周血白细胞 DNA 的制 备方法获得 4。 1.2HLA-A、 B 位点扩增用特异性引物分别扩增 HLA-A、 B 位 点第 1 3 内含子， 包含了最具多态性的第 2、 3 外显子。位点 A 的扩增 引 物 设 计为 3 个正向引物， 即 3端分别为 A、 T 或 G （AIN1-A， AIN1-T， AIN1-G） 分别与保守的反向引物 （AIN3-62） 结 合对样品进行扩增， 等位基因的
14、不同是由第 1 内含子第 75 个 核苷酸决定的， 见表 1。HLA-A、 B 位点的 SBT 分型方法及相应 的引物序列及测序引物序列均获自 http： / / www. ihwg. org 的第 13 次国际组织相容性组织测序分型方案。 表 1 位点 A 不同引物扩增的等位基因 AIN-AAIN-TAIN-G A*02A*29A*01 A*23A*31A*03 A*24A*32A*11 A*25A*33A*30 A*26A*36 A*34A*3204 A*66 A*68 A*69 A*80 1.3PCR 扩增体系总体积 50L， 含模板 DNA 20g， 10 PCR 缓冲液 5L， dN
15、TPs 各 0.2 mmol/ L，Mg 2 + 1.5 mmol/ L， 引物各 10 pmol， Taq DNA 聚合酶 1.5 U。循环参数： 96预变性 300 s； 96 变性 60 s， 65退火 90 s， 72延伸 90 s， 20 个循环； 96变性 60 s， 60退火 90 s， 72延伸 90 s， 10 个循环； 72延伸 600 s。取 5 L PCR 产物于 1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定， 产物大小约为 1 kb， 于 - 20保存备用。 1.4SBT 基因分型方法纯化上述 1 kb PCR 产物， 使用 ABI 377 或 3739XL 测序仪分别对 HLA-A、
16、 B PCR 产物的第 2、 3 外显 子区进行测序， 并使用 HLA 序列分析软件 Assign-SBTTM3.0 对 其进行分型，确定其等位基因型别。 1.5等位基因和单倍型的分析等位基因频率可通过直接计 数的方法获得， 单倍型的频率可通过 Arlequin 软件按最大可能 估计值 （maximum likelihood estimation， MLE） 计算 5， Hardy-Wein- berg 平衡可用 Markov chain Monte Carlo 精确检测法计算 6， 配对 连锁不平衡的显著性可通过 permutation 检测计算 7， 即对最大 估计实际单倍型频率和在平衡条
17、件下单倍型频率的期望值进 行比较。= h - pq， h 为实际单倍型频率， p 为位点 1 等位基因 的频率， q 为位点 2 等位基因的频率，rel=obs/max，max= p （1 - q） ， p 0.05。 通过对此人群 HLA-A、 B 位点的等位基因进行计算， 共检 出 26 个 HLA-A 等位基因及 41 个 HLA-B 等位基因， 其中频率最 高的为 A*0201、 A*110101、 A*24020101、 B*4001、 B*4601 （ 10%） ， 其次为 A*0207、 A*0206、 A*330301、 B*1301、 B*1502、 B*3501、 B*58
18、01、 B*1501 （ 5%） ， 见表 2。尽管目前 HLA-A、 B 位点的等位基因数已多达 975， 但其等位基因在不同人群的 分布是不同的 12-14， 说明人类 HLA 多态性的分布有显著的人 种、 民族和地理差异， 某些基因的频率在不同种族之间差异很 大， 少数 HLA 特异性只见于某些种族， 我国不同民族 HLA-A、 B 基因频率也有明显差异 15， 16。据 Yan 等17报道中国北方汉族 人群 HLA-A 等 位 基 因 分 布 频 率 最 高 的 为 A*110101、 A* 2402010、 A*020101， 此分布与 湖北 土 家 族 具 有 相 似 性， Sho
19、w 等 18使用算术平均的不加权的成对分组方法证实北方汉族与 南方汉族具有不同的遗传背景， 第 11 次国际主要组织相容性 工作组公布了中国南方及北方汉族 HLA-A、 B 等位基因的主要 分布， 并证实北方汉族与中部汉族 （来自长江中游） 具有相同的 起源。土家族目前主要分布在湖南西北部、 湖北恩施、 四川东 部， 是否与中部汉族及北方汉族具有相同的祖先， 还需进一步 探讨。 此外， 利用 Arlequin 软件采用最大估计值对 HLA-A、 B 单倍 型进行计算， 将 1%的单倍型列于表 3， 配对连锁不平衡的显 著性可通过 permutation 检测来计算 P = 0.5。人群中单倍型
20、分 布较普遍 的 为 A*0202-B*4001、 A*0201-B*4601 占 3% 4%， 单倍体多态性分布对临床器官移植的应用具有重要价值， 通过配对连锁不平衡检测未发现强连锁不平衡现象，rel值较 高 的 为 A*0201-B*1501 （0. 513349） 、 A*110101-B*4001 （0.482459） ， 结果见表 3。 五峰县是土家族自治县， 地处偏远山区， 人群相对比较稳 定， 因迁移而产生群体结构的变化不大， 研究该地区少数民族 人群 HLA类等位基因型的分布规律具有重要意义， 并为 HLA 相关研究提供实验基础。 志谢软件 Assign-SBTTM MM3.0
21、 由 Western Australia Damian Goodridge 友好提供， 特致谢意 参考文献 1Jin P，Wang E. Polymorphism in clinical immunology-from HLA typing to immunogenetic profiling. J Transl Med， 2003， 1:1-11. 2Petersdorf EW， Mickelson EM， Anasettic C，et al . Effect of HLA mis- matches on the outcome of hematopoietic transplants. C
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