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1、海南医学 2 0 0 9 年第2 0 卷第1 2 期H A A NM E D I o 儿J O u R N A L 论著 小鼠I L 1 7 基因的克隆及其真核表达载体的构建 周艳春，方丹，许燕璇 ( 汕头大学医学院炎症与免疫性疾病研究所，广东汕头5 1 5 0 4 1 ) 【摘要】目的克隆小鼠l L 1 7 ( m I L 1 7 ) 基因编码区并构建其真核载体。方法 将1 0u gL P s 和等 体积的完全福氏乳化后免疫C 5 7 B L 6 小鼠，7d 后，取小鼠脾脏，提取脾细胞总R N A ，通过R T P c R 扩增 m I L 1 7 基因全长编码区并将其克隆至p c D N
2、A 3 1 载体。菌落P c R 筛选阳性克隆，限制性内切酶消化和序 列分析进行鉴定。结果 构建的重组载体中含有m I L 一1 7 基因编码区的全长序列，与N c B I 公布的序列一 致。结论 获得m I L 一1 7 基因并构建了其真核表达载体，为研究I L 1 7 在自身免疫性疾病中的作用奠定 了基础。 【关键词】小鼠I L 1 7 ；R T P c R ；克隆 【中图分类号】 R 一3 3 2 【文献标识码】 A 【文章编号】1 0 0 3 6 3 5 0 ( 2 0 0 9 ) 1 2 0 1 0 0 3 M o l e c l l l 盯c 1 0 n i I I g0 fm o
3、 u 靶几一1 7g e n e 蛐d 雌t m c 廿o no fi t se u 王【a r y o t i ce x p 眦s i 蚰v e c t o r 乃m ( ，l 锄一 曲l l ，l ，F A GD n ，l ，X ，玩n 一工H 绷川肋M l n f f D nd ，l dJ 册l “，l D f D g ) ，R e 5 e n r c _ f I 加硎m 把，胁d i fc D k ，S 妇，l 幻H 加f 坩糟f 秒，跏口甩幻“51 5 0 4 1 ，G “n 只g d b 甩g ，P 尺C H ，A 【A b s t r 卵t 】o b j e c t i v e
4、T oc l o n et h em o u S eI L 1 7g e n e 蛐dc o n s t n l c ti t se I l l 【a r y o d ce x p r e s s i 锄v e c t o r M e t l l o d s 皿圯c D N Ae n c o d i n g “L 1 7w 船哪p l i f i e db yR T P C Ru s i I l g I e 僦8 lR N Ae x t r 电e df r o ms p l e e n c e l l s0 fc 5 7 B I _ 6I I l i c ei m m u r I i z e
5、dw i t l IU ) si nC F A n eP c Rp r o d u c tw c l o n e di n t op c D N A 3 1v e c t o r 明dt h e n t r a I l s f o I m e di n t 0E c o hD H 5 a 1 1 l ep o s i t i v er e c 咖b i n 柚tc l 彻ew a s 锄a l y z e db yP C R ，d i 静t i 锄o f 瑚t d c f i 加朗c b n u e l e a s e 锄dD N As e q l l e n c i n g m s u l
6、t sT h eI e c o 山i n a 呲p c D N A 3 1 一m I L 1 7h a dac 鲫p l e t eo p 曲I e a 也n g 如m eo f I n I L 一1 7a n ds h a r e d1 0 0 h o m o l o g yw i 血t h es e q u e n c eo f m R N Af 研础L 一1 7i n 异e n eb 锄k C 蛐d l I s i o n 耵地c D N A “m I L 一1 7i 8c l 伽e ds u c c e 8 8 f u U y ，w l i c hw mb eh e l p 6 l l
7、f o rt h ef u n h e rr e s e a r c ho ni t sb i o l o g i c a lf u n c 在o ni n 越n 商n 强m m e 【K e yw o r d s 】m I L 一1 7 ；R T P c R ；C 1 0 舱 n 1 7 是最近发现的一个新的C D 4 + T 亚类，在 抵抗微生物，特别是胞外菌感染和真菌感染中发挥 重要的作用。一些器官特异性自身免疫性疾病， 如E A E 、C I A 、E A u 等，最初认为是由n l 细胞介导， 但最近的研究结果却提示伯1 7 在这类疾病的发病 机制中发挥主要的作用拉。4 J 。T h
8、 l 7 主要通过其分泌 的效应细胞因子I L 1 7 等发挥作用。研究显示，在 E A E ”J 、c I A 【6o 和E A u H l 诱导期和发病期给予中和 性抗I L 1 7 单克隆抗体，可以有效地阻止上述疾病 的发生或减轻疾病的严重程度，提示I L 1 7 是治疗 器官特异性自身免疫性疾病的有效靶点。本文从 L P S 免疫的小鼠脾细胞中扩增小鼠I L 1 7c D N A ，构 建了p c D N A 3 1 一I L 1 7 真核表达载体，为下一步 制备I L 1 7s i R N A 并利用R N A i 治疗自身免疫性疾 病奠定了基础。 l 材料与方法 1 1 实验动物C
9、 5 7 B L 6 ，6 8 周鼠龄，购自 汕头大学医学院实验动物中心。 1 2主要试剂嘶z o lR e a g e n t 、P l 撕n u m P C R S u p e r M i xH 曲F i d e l i t y 和随机引物购自I n v i t m g e n 公 司；D N Am a r k e rD L 2 0 0 0 、T 4D N Al i 殍鲢虻、B a m HI 和 X b aI 购自T a K a R a 公司；D N A 回收试剂盒、琼脂糖 购自上海生工；R e v e n A i d T MM M | u L VR e v e r s eT r 觚 s
10、c r i p t a s e 和R i b o n u c l e 船ei n h i b i t o r 为F e 珊e n t 踮产品； p c D N A 3 1 V 5 一H i s oT O P O T A 载体和E c o l i D H 5 d 由本室保存。 1 3 方法 1 3 1 引物设计与合成根据G e n B a n k 中小 鼠I L 一1 7 的基因序列，设计l 对引物P l ：5 一 G G G G C A T C C ( 泌C A T G A G T C C A G G G A G A ，P 2 ：5 一 G G G ! g ! 垒! 壁垒C 1 G G C T
11、 G c C T G G c G G A C A A T C ，该对弓I 物可特异性扩增编码全长m I L 1 7 的c D N A 序列， 片段长为4 7 4b p 。引物P 1 的57 端设计了B a m HI 限 制酶位点( 下划线部分) 和K 0 z a k 序列G A C ( 斜体部 作者简介：周艳春( 1 9 6 6 一) ，女，内蒙古呼和浩特市人，副主任技师，博：。主要从事炎症和免疫性疾病方面的研究。 1 0 万方数据 H A l N A NM E m c A LJ o u R N A L 2 0 0 9 年第2 0 卷第1 2 期 兰雾：R 芝霎：? c R 7 黔条譬絮：要；
12、萎：i ：憎切嚣质蔷序结果及分析序列测定证明，构建的 竺：驾：三0 ：3 7 三兰二m i l ：煮三2 篡黧要重组纛；警署：二，；妥茹蔷茹箍葱茹 三：罂磐警：要是之悠熙鬈匕裂慧篓登高豢茬茹名艺慧n k l ；主主嚣蒯姜茎写描 电泳进行鉴定。将上述P C R 产物回收，并用B a m HI ”。”。工川川“小叫”“1 ”、 I n g u 坤3s e q u e n c e 蚰a l y s i s d 呻l I 辩I L 1 7 学e 肿) 3 讨论 I L 一1 7 是由活化的C D 。+ T 细胞分泌的促炎性 细胞因子，该细胞因子可以诱导多种细胞分泌细胞 因子( I L 一6 ，I L
13、一8 ，G M C S F ，G C S F ) 、趋化因 ，R 罕1 竺：芝! ：= ，：竺：= 嚣警篡竺苎喜分霉。，二e ：) 。此钚，I L 一1 7 也参与了中性粒细胞晶募集、 子( C X C L l ，C x C L l 0 ) 和金属蛋白酶( M e t 越l o p m t e i n 一 ( 晰把1枷g e le l e c t r o p h o 嘟i 80 fR T P c R0 f 岫m I L 一1 7 删e ) 叩，o 虬I 川o 乡1ol 工7 l l 刈”o 叫万不、 l ：D 嘲D N Am 丑r k e r ，2 ：I n I L - 1 7 基因的R T
14、P | c R 产物。活化和迁移。通过对人自身免疫性疾病及其动物模 2 2 重组质粒的筛选与鉴定将上述P C R 产型的研究发现，该细胞因子在炎症和自身免疫性疾 物纯化、酶切后与p c D N A 3 1 载体连接，连接物转化病中发挥重要的作用。 D H 5 d 感受态细菌，随机挑选菌落进行菌落P C R 鉴在器官特异性自身免疫性疾病模型，如E A E ， 定，阳性菌落扩增出的片段与目的片段大小相符。c I A 和E A u 中，I L 1 7 是主要的效应分子，而L P s 重组质粒用B a m HI 和x b aI 酶切，阳性克隆可切下可以加重E A u 的严重程度，因此，本实验首先将L
15、P s 一条接近5 0 0b p 的条带( 图2 ) ，与预期结果相符。和c F A 乳化，免疫C 5 7 小鼠，诱导其体内产生1 1 1 1 7 应答，然后通过R T P C R 从L P s 和C F A 免疫的小 鼠脾脏单个核细胞总R N A 中扩增I L 一1 7 基因，测 万方数据 海南医学2 0 0 9 年第2 0 卷第1 2 期 l I A I N A NM E D I C A LJ o U l 州A L V o I 2 0N O 1 2D e m b e r 2 0 0 9 直肠癌直肠系膜转移相关因素的临床研究 彭勃，黎明，谢权，张罡 ( 中南大学湘雅医学院附属海口医院普外科，
16、海南海口5 7 0 2 0 8 ) 论著 【摘要】 目的探讨直肠癌系膜淋巴结转移的规律及与临床病理特征的关系。方法回顾性分析 2 0 0 6 年1 月至2 0 0 9 年6 月在我院以全直肠系膜切除( T o t a l m e s o r t a le x c i s i ，T M E ) 原则行直肠癌根治术的 4 7 例直肠癌临床资料，采用卡方检验、非参数秩和检验及s t i c 多因素回归分析，了解其淋巴结转移与临 床病理之间的关系。结果患者的性别、年龄，肿瘤大小、部位、侵犯肠管周径，术前c E A 表达水平与直肠系 膜淋巴结转移无明显关系( P O 0 5 ) 。肿瘤的分化程度、浸润深
17、度与直肠系膜淋巴结转移相关，低分化肿瘤 的直肠系膜转移阳性率明显高于高、中分化组( P 0 0 5 ) 。多因素回归分析显示肿瘤的分化程度与直肠系 膜的淋巴结转移相关。结论直肠癌直肠系膜淋巴结转移与肿瘤的分化程度相关。 【关键词】直肠癌；直肠系膜；淋巴结转移 【中图分类号】 R 7 3 5 3 + 7 I 文献标识码】 A 【文章编号】l 0 0 3 6 3 5 0 ( 2 0 0 9 ) 1 2 0 1 2 0 3 I t e l e v a n tf h c t o 瑙o fm 酷叫钾咖l y m p hn o d em e t a s t 舔i si nr e c l a lc 缸c i
18、 n o m P E G 肋，肘拥g ，脚Q 嘲，甜 谢Z k 阳r 觚阴t 万G P 疗P 阳l 勋r g P ，) ，龇H 口i 切“j 如印i 删 历豇口删f Dx i 口月g y 口M 删c 口fc D l 如，锄f ，脚勋“历弘 行f w 稻毋，胁渤“施n i c 枷f 王，n 印f 脚，舶积移H5 7 0 2 0 8 ， k f 加拧，P R a 删v A 【A b 髓礴n 】o b j e c 6 V e T bi n v e 8 t i g a t et h ec h a m c t e r i s d c0 fm e r e c t a l 枷p hn o d en 皓t 鹅
19、t 龉i 8a n de v a l u a l e t l l e 陀l a t i o n 8 I l i pw i t hc h I l i c o p 眦h o I o 百cc h 岫c t e r i s t i c s M e t h o d sT o 鲫_ a l y s e 咖p e c t i v e l yt b ec l i n i cd 砒a0 f4 7p a - 6 e n 协w h oh a dr e c e i v e dm d i c a ls u 弹r y0 fm c t a lc 锄o e r 锄dt o t 曩lm e r e c t a le x c i
20、 s i 伽f b mJ a n 2 0 0 6t oJ l m 2 0 0 9 T h ea s c i 鲥I o 璐b e t w e e nl y m p 戚c 眦t 够t 酗i g 姐dc l i I l i c 叩拈o L o g i cv a r i a b I w e 陀吖a l I l 曲e db yC K s q I I a r e dt e s t ， 肿一p a r a n 皓t e r 姗k8 啪t e s t 觚dl o g i s t i c 陀g 陀s 8 i 帆R 略山缸N o8 i 伊I 访c a n tc o r 佗l a t i o nw e 陀f o 岫
21、dk I t w e e nI n e 8 0 _ r e c t a lm 曲糙t 鹪i 8 蛐do t l l e r 谢枷e 8s u c h 鹊g e n d e r ，a g e ，t l l I n o r8 i 匏，t h el a t i 姐0 ft I l m o r ，t h ed i 蹦l e t e ro fa & c t e d b ( ，w e l ，t l l ek v e l0 fp r e o p e m t i 、r eC E Ae x p r e s s i m l T h e mw 鹤s i 蛳c 舭tc 仇R l h t i b e t w e e n
22、m 髓优e c t a lI n e t 鹳t a s i 8 蛐dt h ed e p t l l0 ft L l m o ri n v 嬲i ，t 啪o r 础f e r e n t i a t i n gd e 伊，蛐dt h eE 眦0 fm o D e c t a l 屺t a s t i 8i np o o r l yd 近毫r - 朗6 8 t e d 刚pw 酗h i 出e r 曲nt h ti nw e U 孤dm o d e m t e l yd i 虢r e n t i a t e dg r o u p ( P 0 0 5 ) 【嘴cr e 孵8 i 帆蛐小 y s i
23、8s h o w e dt l l a tm e 8 0 阳c t a li y m p hn o d em e t 鹊t 鹊i 8w 鹊他h t e dt ot l l m o rd i 矗e r e n t i a t i n gd e g r e e ：佃c I u s i o n1 1 他m e r e c t a ll y m p hn o d em e t t a 8 i 8i 8r e l a t e dt ot I l m o rd i 珏毛r ；e n t i 砒i n gd e g r e e 【K e y 啪r d s 】 R e c t a lc a r c i n o
24、 m ；M e s o r e c t a l ；L y m p hN 0 d eM e 恤t 鹪i s 作者简介：彭勃( 1 9 5 8 一) ，男，四川省成都市人，主任医师，学士。 序结果证实我们获得的I I l I L 1 7c D N A 与G e n B a n k 中登录的序列完全一致。 由于I L 1 7 在自身免疫性疾病中发挥关键作 用，阻断I L 一1 7 信号是治疗自身免疫性疾病的有效 的途径。I L 1 7c D N A 的克隆及真核表达载体的构 建为进一步设计针对I L 1 7 的s i R N A ，进而研究该 细胞因子在自身免疫性疾病中的动态变化及相关疾 病的治疗提
25、供了良好的实验基础。 参考文献 1 D a r d 小V ，K o m T ，K u c h T o oV K ，c t 丑I R o l e0 f n l 扑d 1 1 1 1 7 c e l l 8 i no T g 叽一s p e c i 6 ca u t o i m 埘u n i t y J J A u t o i m m u n ，2 0 0 8 ，3 l ( 3 ) ：2 5 2 2 5 6 2 K o m i y 哪Y ，N B k a es ，M H t s u k iT ，e ta I I L 1 7p l a y B 蛐i m p o r - t a I I tr o l
26、ei nt h ed e V e l I p m e n t0 f 麒p e r i m 即t 8 l 删I o i m m u 眦e n c e p l a l y e l i t i 8 J Jl m m u n o I 2 0 0 6 ，1 7 7 ( 1 ) ：5 6 6 5 7 3 1 2 【3 N a l c s ，N m b uA ，s I l d oK ，e ta 1 s u p p 尬聃i 0 f j m m u 呻i n d l l c d o 帆o fc o l l 4 9 9 蛳一i n d u da r t h r i t i si nI L 1 7 一d e f i
27、 c i 饥tm i c e J 】J I 眦n o l ，2 0 0 3 。1 7 l ( 1 1 ) ：6 1 7 3 6 1 7 7 4 】L u 学盯D ，s d 他r P ，1 舳gJ ，e t 丑I 野t h e r aT h l 7 饵aT I le 妇奄甜叫 r 嘲p 啪伽d H v e 棚t o i m m u f t i t y ：c 帅d i t i o 岫0 fd i 8 e 聃ei n l u c t i 帅 珊& td i n te 任t o rc a 魄肿 J JE 印M e d ，2 0 0 8 ，2 0 5 ( 4 ) ： 7 9 9 8 1 0 5 H o
28、f 8 t e 钍e r H H ，I b 洲ms M ，圳D ，c ta 1 n e 嗤p e I l t i c 娟雠y 0 fI L 1 7n 叫t r a l i z a t j 伽i n 咖一仳眈p e r i m 蚰t a l t o i m m u n e 鲫 c e p h a l o m y e l i H 8 J c e l lI m m u n o l ，2 0 0 5 ，2 3 7 ( 2 ) ：1 2 3 一1 3 0 6 h b b e r t 8E ，K o d M l ，O p p e m w a l 目脱nB ，e ta 1 T r 砷t W i t ha N
29、 e u f r a l i z i n gA n t i M u r i n eI n t e r l e u k i n 1 7A n t i b l yA 矗e r t h eO n 鸵t0 fC o l l a g e n l n d u c e dA n h t i 8R e d u c e 昂J o i n t I I I f l 删 H 册，c 鲥钉a g eD 瞄f n J c f j o n ，a n dB 0 n eE r o s i o n J 】A n h 耐8 R h m ，2 0 0 4 ，5 0 ( 2 ) ：6 5 0 一6 5 9 ( 收稿H 期：2 0 0 9 0 r 7 一0 3 ) 万方数据