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1、2 0 0 9 年1 月 第1 9 卷第1 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E J a n u a r y ，2 0 0 9 V 0 1 1 9N o 1 应用氧化酶法对高糖高脂动物模型 肝糖原含量的测定 柳占彪，张少卓，李玉红，王茜 ( 天津中医药大学中医药研究院，天津3 0 0 1 9 3 ) 庐e 口s 畸) $ 研究报告$ Q m 、e # 、盼e R 、出 【摘要】目的建立氧化酶法检测肝糖原的方法。方法采用碱中和与缓冲液相配合调节水解液p H 至中 性，然后用氧化酶法
2、检测肝糖原含量。结果用1 0t t L6m o l ，LN a O H 加入等量肝糖原水解液后，再加入4m Lp H 7 2 磷酸盐缓冲液，可使糖原水解液p H 值调为7 2 ，用于氧化酶法测定糖含量。结论该法操作简便易行，结果稳定、 重复性好。 【关键词】肝糖原；氧化酶法；模型，动物 【中图分类号】R 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6 ( 2 0 0 9 ) 0 1 0 0 3 4 - 0 3 C o n t e n tD e t e r m i n a t i o no nH e p a t i cG l y c o g e no fA n i m a lM
3、 o d e l o nH i g hG l u c o s ea n dF a tb yO x i d a s eM e t h o d L I UZ h a n - b i a o ，Z H A N GS h a o - z h u o ，L IY u - m n g ，W A N GX i ( R e s e a r c hI n s t i t u t eo fT r a d i t i o n a lC h i n e s eM e d i c i n e ，T i 明j i nU n i v e r s i t yo fT r a d i t i o n a lC h i n e
4、s eM e d i c i n e ，T i a n j i n3 0 0 1 9 3 ，C h i n a ) 【A b s t r a c t 】O b j e c t i v e T oe s t a b l i s ho x i d a s em e t h o do nd e t e r m i n a t i o no fh e p a t i cg l y c o g e n M e t h o d s E m p l o ya l k a l i n e u t r a l i z a t i o na n db u f f e rs o l u t i o nt or e
5、s u l a t et h ep Ho fd i g e s ta n dc a u f ei tb en e u t r a l ，d e t e r m i n et h ec o n t e n to fh e p a t i cg l y c o g e nb y o x i d n s em e t h o d R e s u l t sA d d1 0t , Lo f6m o l LN a O Ht ot a l e sd o s e so fh e p a t i cg l y c o g e nd i g e s t ，t h e na d d4m Lo fb u f f e
6、 r p h o s p h a t e ( p H 7 2 ) t ol e tt h ep Ho fh e p a t i cg l y c o g e nd i g e s tb e7 2 ，i ti se m p l o y e dt od e t e r m i n et h ec o n t e n to fh e p a t i cg l y c o g e nb y o x i d a s em e t h o d C o n c l u s i o n sT h i sm e t h o di se a s yt oo p e r a t ea n ds t a b l e
7、，i t sr e p r o d u c i b i l i t yi sg o o d 【K e yw o r d s 】H e p a t i cg l y c o g e n ；Q x i d a s em e t h o d ；M o d e l ，a n i m a l 肝糖原是糖尿病、高脂血症等疾病的重要观测 指标之一。目前检测肝糖原的常用方法为蒽酮 法。然而应用此方法进行检测时，因受试剂、温 度、标准曲线回归系数低、方法稳定性差等因素的影 响，结果重现性不好，而且使用试剂多，溶液配制和 操作过程复杂。为此，本文采用碱中和与缓冲液相 配合调节水解液p H 至中性，然后用氧化酶法检
8、测 糖尿病大鼠和高脂血症家兔肝糖原含量，现将结果 报道如下。 l 材料和方法 1 1 试验材料 1 1 1 动物：W i s t a r 大鼠，体重1 5 0g 左右，雌性，购 自天津市医学放射研究所，动物许可证号：S C X K ( 津) 2 0 0 5 0 0 0 1 ；大耳自家兔，体重2 5k g 左右，雄 性，购自中国医学科学院实验动物研究所，动物合格 证号：S C X K ( 京) 2 0 0 5 0 0 1 3 。 1 1 2 药品及试剂：四氧嘧啶：英国B D H 有限公司 进口( 批号：8 2 0 1 7 ) 。葡萄糖试剂盒：中生北控生物 科技股份有限公司产品( 批号0 7 1
9、0 4 1 ) 。甘油三酯试 剂盒：中生北控生物科技股份有限公司产品( 批号 0 7 1 2 1 1 ) 。3 0 K O H ；6m o l LH C I ；6m o l LN a O H ；p H 7 2 磷酸盐缓冲溶液；无水乙醇；精密p H ( 5 9 ) 试 【通讯作者】柳占彪( 1 9 6 0 一) ，副研究员硕士，主要从事新药开发研究。E - m a i l ：6 3 4 2 5 6 7 4 7 q q m 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 月第1 9 卷第1 期C h i nJC o m pM e d ，J a n u a r y2 0 0 9 ，V 0 1 1 9
10、 N o I 3 5 纸等。 1 1 3 仪器设备：M i c r o l a b 3 0 0 型半自动生化分析 仪；水浴锅；天平；加样器等。 1 2 方法 1 2 1四氧嘧啶性高血糖模型：选择4 5 只雌性 W i s t a r 大鼠，体重1 8 0 2 0 0g ，参考徐叔云糖尿病造 模方法睢】，用四氧嘧啶1 7 0m g k g 剂量，腹腔注射，每 日一次，连续2 日注射，在第3 日测定血糖值，以空 腹血糖 1 1m m o l L 为成功模型。选该标准的成功 模型鼠3 0 只纳入实验。另选择雌性大鼠3 0 只作为 正常对照。分别在造模后第4 天、第7 天、第1 4 天 剖杀1 1 3
11、 动物，测定血糖和肝糖原含量。 1 2 2 高脂饲料造模：选择1 5 只雄性家兔，体重 2 5k g 左右，参考徐叔云高脂造模方法怛1 ，用高脂饲 料( 含1 胆固醇、1 0 猪油、基础饲料8 9 ) 喂养， 连续8 周，以血清T C 1 0n m M L 为成功模型。选 该标准的成功模型家兔1 0 只纳入实验。另选雄性 家兔1 0 只作为正常对照，喂养普通饲料。分别测定 血清T C 和肝糖原含量。 1 2 3 肝糖原制备方法：将动物处死，立即取0 5g 肝组织( 同一位置) ，在冰浴中用生理盐水冲洗血液， 滤纸吸干，放入预先加好2 5m L3 0 K O H 试管，沸 水浴加热完全溶解( 约
12、3 0m i n ) ，趁热加入无水乙醇3 m L ，混匀，冷却后糖原沉淀，弃上清液。在沉淀中加 2 5m L6m m o l LH C I ，沸水浴中水解2h ，取出冷却， 备用。 1 2 4 调节水解液p H 值及测定肝糖原含量方法： 取2 3 制备的水解液1 0 皿，加入1 0 “L6m m o l L N a O H ，然后加4m Lp H 7 2 磷酸盐缓冲液，用精密p H ( 5 9 ) 试纸测定水解液p H 值，再加入1 5m L 葡萄 糖氧化酶工作液( 来自葡萄糖试剂盒) ，同时设空白 管、校准管和缓冲液对照管。具体步骤见表1 。 混匀，在3 7 下作用1 5m i n ，以空
13、白管为零点， 在5 0 5n m 处比色，记录光密度。 表1 调节水解液p H 值及测定肝糖原含量操作步骤 T a b 1T or e g u l a t et h ep Ho fd i g e s ta n dm e t h o do fd e t e r m i n i n gt h ec o n t e n to fh e p a t i cg l y c o g e n 1 2 5 肝糖原含量计算：肝糖原含量= 5 ( 样品 管光密度校准管光密度) 葡萄糖标准浓度；单位： m g g ( 肝湿重) 。 2 结果 从表2 、表3 结果可知，采用碱中和与缓冲液相 配合调节水解液p H ，均
14、能使所有样品的p H 值调整 为7 2 ，成功率达1 0 0 ，调整p H 值后的水解液均适 用于氧化酶法的测定。从测定结果看其符合四氧嘧 啶性高血糖大鼠模型肝糖原和高脂模型家兔肝糖原 的变化规律。若用1 0 t L6m m o l LN a O H 直接中和 水解液，不加p H 7 2 磷酸盐缓冲液，则水解液的p H 值很难调整至中性，不是偏酸就是偏碱，不适宜用氧 化酶法测定。结果表明，采用碱中和与缓冲液相配 合调节水解液p H 至中性的方法，操作简便易行、结 果稳定、重复性好，适用于氧化酶法测定动物的肝糖 原含量。 3 讨论 在血糖检测中由于蒽酮法受试剂、温度、方法稳 定性差等因素的影响，
15、结果重现性不好，而且使用试 剂多，溶液配制和操作过程复杂而早已淘汰，取而代 之的是氧化酶法。用氧化酶法检测葡萄糖是目前公 认和普遍使用的方法，其优于葸酮法怛1 ，但在肝糖原 的检测中目前仍然采用蒽酮法而不用氧化酶法b 4 1 ， 其原因在于肝糖原水解为葡萄糖的水解液呈酸性， 不适用氧化酶法测定。因此，如何调整肝糖原水解 液的p H 值至中性，是能否采用氧化酶法检测肝糖 原的关键，一但将水解液的p H 值调至中性，水解液 就会象血清样品一样适宜于氧化酶法的检测。 万方数据 3 6 中国比较医学杂志2 0 0 9 年1 月第1 9 卷第l 期c I I i nJc o 呷M e d ，J u a
16、r y2 0 0 9 ，V d 1 9 N o 1 对照组血糖 c o n t r o Ig l u ( m m o l L “) 对照肝糖原 C o n h o iH e p a d cO y c o s e n ( m g ，g ) p H 模型组血糖 E x p e r i m td u c e ( m m o l L “) 模型组肝糖原 E x p e f i n tH e p a t i cg l y o o 妒n ( m g ，g ) p H 缓冲液对照组 B u h 曲dg r o u p p H 5 5 6 O 2 7 ( 1 0 )5 3 2 0 6 2 ( 1 0 ) 5
17、O 5 1 ( 1 0 ) ”1 3 6 4 2 ( 1 0 ) 7 2 3 8 1 6 5 2 9 ( 1 0 ) 3 6 3 4 6 4 1 ( 1 0 ) 7 2 7 2 2 9 4 6 4 3 2 “( 1 0 )3 1 2 7 O 8 2 ”( 1 0 )3 3 4 6 2 1 6 ”( 1 0 ) 勰2 6 3 4 5 ”( 1 0 ) 7 2 0 ( 无反应d i dn o tm 呻D d ) ( 1 0 ) 偏酸或偏碱 m e t a - i do rm e t 丑a l k a l i 2 2 4 3 4 5 7 ”( 1 0 )1 2 6 3 士3 “”( 1 0 ) 7
18、2 0 ( 无反应d i dn o tm p o n d ) ( 1 0 ) 偏酸或偏碱 m e t 8 d c i dO rm e m - 8 l l 【a l i 7 2 0 ( 无反应d i dn o tr p o n d ) ( 1 0 ) 偏酸或偏碱 m e t a a c j dO Fm e t a a l k a l i 注：“表示差异极显著( P 0 0 1 ) 。与对照组比较。 N o t e ：P O 0 1 ，m 五no f t l l eg l u c o v d u 髑“H e p 血cg I y c 噼nv 丑l u 酋b e t w n t l I e t w o
19、 F 叫p 裹3 正常家兔与高脂家兔肝糖原含量测定 T a b 3 H e p a t i cO y c o g e nv a l H e 8i nr a b b i t so ft l I ec o n 咖la n de x p e r i m e n t a lg r o u p 8 注：“表示差异极显著( P ( O 0 1 ) 。与对照组比较。 N o t c ：P O O l ，m p a r i B 帅dd 忙T Cv a l u 鹊m dH e p a t i cg I y c o g e nv a l u b e t w nt h et w og m u p 8 本试验采用碱中
20、和与缓冲液相配合调节水解液 p H 至中性，然后用氧化酶法检测肝糖原含量的方 法，操作简便易行，结果稳定、重复性好，适合不同动 物模型肝糖原含量的检测。这里需要指出的是若不 用缓冲液调整水解液的p H 值，直接用碱中和则往 往会出现中和不足或过量的问题，很难掌握好中和 点，采用缓冲液则可缓冲中和不足或过量的问题，使 调整水解液的p H 值变得容易和稳定。 参考文献： 【1 张均田现代药理实验方法( 上、下) M 北京：北京医科大 2 3 4 学、协和医科大学联合出版社，1 9 9 7 ：9 8 4 9 8 5 徐叔云，卞如濂，陈修药理实验方法学( 第3 版) M 北京： 人民卫生出版社。2 0 0 2 ：1 5 2 3 一1 5 2 5 刘阳，于男，范文今，等刘索清保力康养生液免疫调节和抗 疲劳作用的试验研究 J 中国比较医学杂志，2 0 0 3 ，1 3 ( 1 ) ：4 9 阴文娅，曾果，张彩云，等小鼠肝糖原测定影响因素分析 J 现代预防医学，2 0 0 4 ，3 1 ( 3 ) ：3 5 9 3 6 0 修回日期) 2 0 0 5 2 7 万方数据