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1、2 0 0 8 年1 0 月 第1 8 卷第l o 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E O c t o b e r 。2 0 0 8 V 0 1 1 8N o 1 0 心导管留置术后盲肠结扎穿孔术( C L P ) 脓毒症动物模型的建立 王宁1 ，周 红2 ，郭毅斌1 ，刘鑫1 ，曹红卫1 ，郑 江1 ( 1 第三军医大学西南医院综合实验研究中心；2 药学院药理学教研室，重庆4 0 0 0 3 8 ) 席、口- 口、! ，、- 、 g 研究报告$ 【翰口e 删 【摘要】目的采用
2、留置心导管采血法检测盲肠穿孔术( c L P ) 后脓毒症模型大鼠血清学指标并观察肝肺组织 病理学形态的变化。为用于治疗脓毒症药物的活性评价的动物模型的建立奠定了实验基础。方法采用改良的心 导管留置术结合盲肠结扎穿孔术( C L P ) 建立脓毒症大鼠模型，术前和术后2 、6 、1 2 、2 4 、4 8h 共6 个时相点采血，动态 浊度法鲎试验检测血浆内毒素( L P S ) 水平，E L I S A 法检测血浆T N F - a 和1 1 - 6 值，全自动血细胞分析仪检测全血白细 胞( W B C ) 及m 小板( P L T ) 值。术后4 8h 观察大鼠肝、肠、肺的病理学形态改变。结
3、果术后大鼠的血浆L P s 、T N F - a 、 I L - 6 及全血W B C 水平均于术后6h 后逐渐升高，1 2h 达到高峰，之后逐渐下降，于4 8h 达到正常水平；P L T 水平6h 闪无明显蛮化，随后逐渐下降，2 4h 达最低值，之后逐渐升高，于4 8h 接近正常水平；肝、肠、肺组织则呈现以肿胀、 炎性细胞浸润为主的病理学改变。结论通过心导管留置术采血观察C I P 模型大鼠血细胞和细胞因子、L P S 的动 态变化是一稳定可靠的实验方法。 【关键词】心导管留置术；脓毒症；盲肠结扎穿孔术 【中图分类号】R - 3 3【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 1 7 8 5 6
4、( 2 0 0 8 ) 1 0 0 0 1 2 0 3 C o m b i n a t i o no fH e a r tC a t h e t e r i z a t i o nw i t hC e c a lL i g a t i o na n d P u n c t u r ei nS e t t i n gu paS e p t i cM o d e li nA n i m a l s W A N GN i n g ，Z H O UH o n 9 2 ，G U OY i - b i n l ，L I UX i n 。C A OH o n g - w e i ，Z H E N GJ i
5、a n g ( 1 R e s e a r c hC e n t e ro fE x p e r i m e n t a lM e d i c i n e ，S o u t h w e s tH o s p i t a l ；2 D e p a r t m e n to fP h a r m a c o l o g y 。 S c h o o lo fP h a r m a c y ，T h eT h i r dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y ，C h o n g q i n g4 0 0 0 3 8 ，C h i n a ) 【
6、A b s t r a c t 】 O b j e c t i v e T od e t e c tc h a n g e so fp l a s m al e v e l so fs e r o l o g i c a li n d e x e sa n do b s e r v ep a t h o l o g i cd i f f e r e n c e si n t i s s u e so fr a t sb e f o r ea n da f t e rc e c a ll i g a t i o na n dp u n c t u r e ( C L P ) S O 船t op
7、r o v i d er e f f e r e n c es t a t i s t i c sf o rb i o a c t i v i t ya s s e s s m e n to f t h e r a p e u t i ca g e n t sf o rs e p s i s M e t h o d1 h em tm o d e lW a Se s t a b l i s h e db yc o m b i n i n gh e a r tc a t h e t e r i z a t i o nw i t hC L P B l o o ds a m p l e s m 坤o
8、b t a i n e db e f o r ea n da t2h ，6h 。1 2h ，2 4ha n d4 8ha f t e rC L P P l a s m al e v e l so fl i p o p o l y s a e c h r i d e ( L o s ) w e r ed e t e c t e db y t h el i m u l u st e s t ( d y n a m i cn e p h e l o m e t r y ) 1 1 l ep I a 咖aT N F 口a n dI L 6w 啪m 鲫u 蒯b ye r a m e - l i n k
9、e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ( E L I S A ) a n dM o o dW B Ca n dP I J Tc o u n 协w e r ee x a m i n e db ya u t o m a t i cb l o o da n a l y z e r P a t h o l o g i c a lc h a n g e so fo r g a n ss u c ha s l i v e r i n t e s t i n ea n d1 u n gw e r ea l s oo b s e r v e da t4 8ha f t e
10、 rC L P R e s u l tL e v e l so fp l a s m am 且f I 【e u sU 塔T N F - aa n dI L - 6a n dW B C c o u n t si n c r e a s e da t6ha f t e rC L P r e a c h e dp e a ka t1 2h ，t h e nd e c r e a s e da n dr e t u r n e dt on o r m a la t4 8h P L Tc o u n t ss h o w e dt i t t l e d i f f e r e n c e sw i t
11、 h i n6 ha f t e rC L P ，t h e nd e c l i n e d ，r e a c h e dt h el o w e s tl e v e la t2 4ha n dr e s t o r e dt on o r m a la t4 8h T i s s u ee d e m aa n d i n f l a m r r m t o r yc e l li n f d t r a t i o nW O r et y p i c a lp a t h o l o g i c a lc l l a I l | 酗i nt h et i s s u e so fl i
12、 v e r ，i n t e s t i n ea n dl u n gi nC L Pr a t s C o n e l u s l o a 【基金项目】国家重点基础研究发展规划资助项且资助( 项目编号：G i 9 9 9 0 5 4 2 0 3 ) 。 作者简介】王宁( 1 9 8 2 一) 女技师，主要从事感染性方面研究。电话：1 3 2 2 8 6 8 6 2 1 8 。E - m a i l ：c q m n g w a n g 1 6 3 c n 。 【通讯作者】郏江，电话：0 2 3 6 8 7 5 4 4 3 5 ，E I i l ：吐嚼 n h l i l 砸c o l a
13、 c n 。 万方数据 中国比较医学杂志2 0 0 8 年1 0 月第1 8 卷第l O 期C h i nJC o m p M e d ，O c t o b e r2 0 0 8 ，V 0 1 1 8 N o I O 1 3 C o m b i n a t i o no fh e a r tc a t h e t e r i z a t i o nw i t hC L Pp r o v i d e s8n o v e lw a yt oi m p r o v ea n i m a lm o d e l so fs e p s i si nw h i c hs t a b l ea n dr e
14、 l i a b l e o b s e r v a t i o r i b 眦e n s u r e d 【K e yw o r d s 】H e a r tc a t h e t e r i z a t i o n ；S e p s i s ；C L P 寻找拮抗脓毒症的药物一直是国内外研究的重 点和难点。稳定可靠的动物模型是对治疗脓毒症新 药临床前评价的重要手段。盲肠结扎穿孔术( c e c a l l i g a t i o na n dp u n c t u r e ，C L P ) 模型是经典的脓毒症模 型，但通常采用定点活杀动物的方法进行血清学和 病理学的研究实验数据受动物个体差
15、异影响较大， 并且无法实现同一个体的各种血清学指标的动态观 察引。 本研究通过心导管留置收集C L P 大鼠模型的 血液标本，观察术后动物血清学指标及病理学形态 的变化，以期得到更能准确反映脓毒症病理生理学 动态变化的各种实验依据。 1 材料和方法 1 1 实验动物与材料 S D 大鼠5 只，均为雄性，体重2 0 0 2 5 0g ，由第 三军医大学动物中心提供 S C X K ( 渝) 2 0 0 7 0 0 3 。心 导管为美国D o wC o m i n g 公司产品，内径0 5 1m n l ，外 径0 9 4m m 。大鼠T N F - a 和I L 6 检测试剂盒购自深 圳晶美公司
16、。鲎试剂购于湛江安度斯生物有限公 司。 1 2 动物模型 心导管留置术操作参考文献 1 制备。术后沿 腹白线中段作3c m 切口，探查取出盲肠，用四号丝 线距盲端1c m 处结扎，用1 2 号针穿刺3 孔，挤出少 许粪便于腹腔内，回纳盲肠，分层缝合腹腔。分别于 术后2 、6 、1 2 、2 4 和4 8h 经导管采血，检测血浆内毒 素( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e e n d o t o x i n ，鹏) 、细胞因子水平 及血细胞指标，4 8h 取肠、肝、肺组织做病理形态学 观察。 1 3 观察指标 ( 1 ) L P S 水平检测：采用动态浊度法
17、鲎试验，具 体操作按E D S 9 9 细菌内毒素检测系统说明书进行。 ( 2 ) 血液自细胞( W B C ) 和血小板( P L T ) 检测：采用 全自动血细胞分析仪检测。( 3 ) 病理形态学检查：动 物活杀后立即取肠、肝和肺组织标本，常规脱水、石 腊包埋、H E 染色、封固，光镜下观察组织病理变化。 1 4 统计学方法 结果以i 4 - 5 表示，采用S P S S1 0 0 统计软件包 进行单因素方差分析，P O 0 5 为差异有统计学意 义。 2 结果 2 1 动物的一般情况 术后大鼠处于嗜睡状态，不进食，刺激后可见痛 觉反应；6 1 2h 后精神萎靡，倦怠，活动少；出现程 度不
18、等的中毒症状，表现为蜷缩无力，口唇青紫，对 刺激反应性减弱。 2 2 血浆L P S 水平 血浆L P S 水平于6h 后开始上升，于1 2h 达到 高峰，此后逐渐下降，至4 8h 恢复到正常水平( 图 1 ) 。 O261 22 44 8 T n n e ( I I ) 图l 脓毒症大鼠血浆L P S 水平( n = 5 ) 隐IP I a o m aL P Sl e v e l si nt h e 曲cr a t s ( n = 5 ) 2 3 白细胞及血小板指标 W B C 在术后6h 出现缓慢升高，1 2h 达峰值，此 后缓慢下降趋于正常；P L T 变化则于6h 出现下降， 1 2
19、2 4h 降至最低，4 8h 接近正常。见图2 和图3 。 昌 i 霎 I 柚孵【h ， 圈2 脓毒症大鼠血液W B C 水平( n = 5 ) 隐2B l o o dW B Cl e v e l si nt h e p t i cr a t s ( 1 1 = 5 ) 2 4 血浆T N F - Q 、I L 6 水平 血浆T N F a 、I L - 6 水平变化趋势与L P S 相似，均 于6h 开始升高，1 2h 达高峰，4 8h 后接近正常。见 图4 。 珊 瑚 啪 啪 o I曷vd，_ 万方数据 1 4中国比较医学杂志2 0 0 8 年l O 月第1 8 卷第l O 期C h i
20、nJC o m pM e d ，O c t o b e r2 0 0 8 ，V 0 1 1 8 N o 1 0 昌 i 山 图3 脓毒症大鼠血浆P L T 水平( n = 5 ) F i g 3 P l a s m aP L Tl e v e l si nt h es e p t i cr a t s ( n = 5 ) o 暑 葡 e 8 量 差 占 图4 脓霉症大鼠血浆T N F - a 和I L - 6 水平( n = 5 ) F i g 4 P l a s m al e v e l so fT N F a a n dI L - 6i nt h es e p t i cr a t s (
21、 n = 5 ) 2 5 肠、肝、肺组织的病理改变 大鼠肠组织切片l i e 染色发现，肠黏膜绒毛肿 胀，中央乳糜管扩张，炎症细胞浸润，上皮细胞坏死 脱落，固有层中度水肿，大量炎症细胞浸润。肝组织 肝细胞混浊肿胀，边界不清，胞质疏松淡染，出现空 泡样改变。肺组织可见肺间隔增宽，广泛肺泡壁血 管充血，炎性细胞浸润( 图5 7 见彩插3 ) 。 3 讨论 在过去2 0 多年的研究中，C L P 动物模型已成为 公认的最接近临床细菌脓毒症的动物模型H 。1 ，其 中小鼠和大鼠C L P 模型由于操作较简单，动物价格 便宜而被广泛接受。通过此模型能观察到因局部外 伤感染进而引起的全身性炎症反应，因而能
22、够较理 想的模拟临床上穿孔性阑尾炎、憩室炎等腹腔感染 致脓毒症休克的病理过程M q l 。但采用该模型进行 血样品各指标检测时，常通过定点活杀动物采集样 本，存在动物消耗量大、工作量大及各时相点重复性 差等缺点，尤其无法对同一个体进行动态的观察。 在前期的研究中，我们曾观察到单纯的心导管 留置术对动物术后炎症反应的各项指标如白细胞及 器官功能的影响较小。本研究在此技术的基础 上，结合C L P 制备新的大鼠脓毒症模型。结果显 示，术后动物中血白细胞、L P S 、T N F - a 、I L 6 在C L P 后 6h 开始增高，均在1 2h 达到峰值状态，之后逐步下 降，并于4 8h 逐步恢
23、复正常。并且发现脓毒症早期 肝、肺、肠等重要器官出现病理性损伤，以上结果与 文献报道大致相似。表明该改进模型在研究脓毒症 的病理损伤机制中具有一定的可靠性。 本研究在C L P 模型的基础上加入了心导管留 置技术，通过心导管对研究个体进行多个时相点采 集血样检测各项生化指标，同时也实现了对同一个 体不同时相点的动态观察，更贴近临床研究，具有药 品用量少、动物需求量少，数据偏差小，实验结果重 复性好、节约时间等优点。此外，由于导管直至右心 房，一方面可经导管输注各种药物，另一方面还可进 行血流动力学等方面的研究。 综上，通过心导管留置术结合C L P 建立的脓毒 症模型，其炎症反应的变化规律与原
24、有的C L P 所致 脓毒症具有相似性，同时也实现了对同一个体的连 续性观察，该实验方法可用于治疗细菌脓毒症药物 的活性评价。 参考文献： 王宁，郑江郭毅斌，等心导管留置术对大鼠脏器功能影 响的实验研究 J 】第三军医大学学报。2 0 0 6 ，2 8 ( 1 4 ) ：1 4 7 3 1 4 7 5 全竹富，黎介寿腹腔感染致多器官衰竭的动物摸型 J 中 华实验外科杂志，1 9 9 1 ，8 ( 2 ) ：9 1 9 2 R e m i e kD G ，W a r dP A E v a l u a t i o no fe n d o t o x i nm o d e l sf o rt h e
25、s t u d y o fs e p s i s J S h o c k ，2 0 0 5 2 4 ( S u p p l ) 1 ：7 一“ H u b b a r dW J ，C h o n d h r yM ，S e h w a c h eM G 。e ta 1 C e c a ll i g a t i o na n d p u n c t u r e E J S h o c k 。2 0 0 5 ，2 4 ( S u p p i ) 1 ：5 2 5 7 C o n a lJ ，Y e l a n m 6J ，H e n n d e z - E s p i n o e aD ，e ta
26、 1 R o l e0 f f i p o p o l y s a e c h a r i d e a n dc e c a l l i g a t i a n a n d p u n c t u r e o nb l o o d c o a g u l a t i o na n di n f l a m m a t i o n i ns e n s i t i v ea n dr e s i s t a n tm i c em o d e l s J A mJP a t h o l ，2 0 0 5 。1 6 6 ( 4 ) ：1 0 8 9 1 0 9 8 B u m sJ A 。H o
27、l z m a n nB S i t k o v s k yM A n i m a lm o d e l so fs e p s i s ： s e t t i n g t h es t a g e J N a t lR e vD n l gD i s c o v ，2 0 0 5 ，4 ( 1 0 ) ：8 5 4 8 6 5 M a n g e rM D ，V d l m a rB R a tm o d e lo ff e m u rf r a c t u r ea n dc e c a l l i g a t i o na n dp u n c t u r e J JT r a u m
28、a ，2 0 0 5 ，5 9 ( 3 ) ：7 8 4 - 6 i e rJ G ，B a i l e yD L 。S h a r m aG R C e c a ll i g a t i a na n dp t m c t t t r ew i t h t o t a lp s r e n t e r a ln u t r i t i o n ：a c l i n i c a l l y r e l e v a n tm o d e lo ft h e m e t a b o l i c h o r m o n a l ，a n di n f l a m m a t o r yd v s f
29、 u n c t i o na s s o c i a t e dw i t h c r i t i c a li t h e s 6 J Js I l I gR e s ，2 0 0 4 ，1 2 1 ( 2 ) ：1 7 8 1 8 6 修回日期 2 0 0 8 - 0 8 - 0 1 i 1J 1 J l 2 3 4 5 6 7 8 r； rL rL 万方数据 王宁等心导管留置术后盲肠结扎穿孔术( C L P ) 脓毒症动物模型的建立( 正文见第1 2 页l W A N G N i n g ，e ta l C o m b i n a t i o no f H e a r tC a t h
30、 e t e r i z a t i o nw i t hC e c a lL i g a t i o na n dP u n c t u r ei nS e t l i n gu p aS e p t i cM o d e li nA n i m a l s ( F u l ll e x lO i lp a g e 他) 目7 R m m m 帝目( a ) 目4 8h 前m 目( b X H E l H 7N o e ls t m ( a ) a n dp a t h l o g l c a lc h g e sa t4 8h m ) o f l | J T l g t i s s u e i nas e p u e ( H E ) 万方数据