抗霍乱弧菌O139群单克隆抗体的制备及初步鉴定.pdf

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1、3 9 0 抗霍乱弧菌0 1 3 9 群单克隆抗体的制备及初步鉴定 杨璇1 ，轩小燕1 ，臧文巧1 ，杨书豪2 ，李倩茹1 ( 1 郑州大学基础医学院微生物学与免疫学教研室，郑州4 5 0 0 0 1 ；2 郑州兰森生物工程有限公司，河南郑州4 5 0 0 0 0 ) 摘要：制备抗霍乱弧菌( V c h o l e r a e ) 0 1 3 9 群特异性单克隆抗体( M A b s ) ，进而制备检测霍乱弧菌0 1 3 9 群的胶体 金免疫层析试纸条。福尔马林灭活的霍乱弧菌0 1 3 9 群免疫B A L B c 小鼠，应用细胞融合技术建立分泌抗霍乱 弧菌0 1 3 9 群M A b s 的

2、杂交瘤细胞株。对配对较好的4 株M A b s 用E L I S A 法测定M A b s 免疫球蛋白类及亚类，用 E L I S A 法和凝集法鉴定M A b s 的特异性。结果表明4 株M A b s 免疫球蛋白均为小鼠l g M ；这些M A b s 均与霍乱弧 菌0 1 3 9 群菌株发生凝集反应，与霍乱弧菌0 l 群、大肠杆菌、出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 、副溶血弧菌、麦氏弧菌、 河弧菌、结肠炎耶尔森氏菌、普通变形杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌及甲型、乙型、丙型副伤寒杆菌不发生凝集反应。 4 株M A b s 具有较高的特异性，有可能用于制备检测霍乱弧菌0 1 3 9 群的检测

3、试剂。 关键词：霍乱弧菌；0 1 3 9 群；单克隆抗体 中图分类号：R 3 7 8 3文献标识码：A文章编号：1 0 0 6 1 7 0 3 ( 2 0 0 8 ) 0 6 - 0 3 9 0 - 0 3 P r e p a r a t i o na n dC h a r a c t e r i z a t i o no ft h eM o n o c l o n a lA n t i b o d i e s A g a i n s t0 1 3 9G r o u po fV i b r i oC h o l e r a e Y A N GX u a n ，X U A NX i a o y

4、a n ，Z A N GW e n q i a o ，Y A N GS h u h a o ，L IQ i a n 一1 3 1 ( T h eM i c r o b i o l o g ya n dI m m u n o l o g yl a b o r a t o r y ，Z h e n g z h O UU n i v e r s i t y ，Z h e n g z h o n ，4 5 0 0 0 1 ，C h i n a ) A b s t r a c t ：T op r e p a r em o n o c l o n a la n t i b o d i e sa g a i

5、 n s t0 1 3 9g r o u po fv i b r i oc h o l e r a e ( V c h o l e r a e ) i no r - d e rt od e v e l o pad e t e c t i o nb o xu s i n gt h e s em o n o e l o n a la n t i b o d i e sf o rV c h o l e r a e H y b r i d o m ac e l ll i n e s w e r eo b t a i n e db yf u s i n gS P 2 Ow i t hs p l e e

6、nc e i l sf r o mB A L B cm o u s ei m m u n i z e dw i t hk i l l e d0 1 3 9 G r o u po fV C h o l e r a e T h ei s o t y p ea n dt h es p e c i f i c i t yo fm o n o c l o n a la n t i b o d i e s ( M A b s ) w e r ed e t e r - m i n e da n di d e n t i f i e db yE L I S A ，a g g l u t i n a t i o

7、 na s s a y ，a n dg o l di m m u n o c h r o m a t o g r a p h ya s s a y ( G I C A ) T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei s o t y p e so f4M A b sb e l o n g e dt om o u s eI g Ma n dt h e s em o n o c l o n a la n t i b o d i e s c o u l dr e a c tw i t h0 1 3 9G r o u po fV c h o l e r a e

8、，b u tn oa g g l u t i n a t i o nW a sf o u n da m o n ge n t e r i cb a c t e r i a ， i n c l u d i n gO lg r o u po fV c h o l e r a ，V i b r i op a r a h e m o l y t i c u s ，V i b r i om e t c h n i k o v i i ，E s c h e r i c h i ac o l i ，e n - t e r o h e m a h a g i cE c o l i 0 1 5 7 ：H 7 ，

9、V i b r i om e t s c h n iK o v l i ，V i b r i of l u v i a l i s ，Y e r s i n i a ，P r o t e u s ，S h O y s - e n t e r i a e 。S a l T y p h i ，a n dp a r a t y p h iA ，P a r a t y p h iB ，P a r a t y p h iC T h em o n o e l o n a la n t i b o d i e sp r e p a r e d i nt h i ss t u d yp o s s eah i

10、 s hs p e c i f i c i t ya n dc o u l db eu s e da sar e a g e n tt od e v e l o pad e t e c t i o na g e n tf o r V c h o l e r a e K e yw o r d s ：V i b r i oc h o l e r a ； 0 1 3 9g r o u p ；M o n o c l o n a la n t i b o d y 霍乱病原菌包括O l 群和0 1 3 9 群。人类历史上已有的七次霍乱大流行，均由O l 群霍乱弧菌弓 收稿日期：2 0 0 8 - 0 4

11、- 2 8 ；修回日期：2 0 0 8 - 0 6 - 1 0 作者简介：杨璇( 1 9 7 l 一) ，女，硕士，讲师，主要从事免疫学及相关疾病研究。E - m a i l ：y a n g x u a n Z Z U e d u c n ：T e l ： 1 3 9 3 7 1 9 5 0 5 9 通讯作者：杨书豪( 1 9 6 2 一) ，男，研究员，主要从事免疫学及其相关诊断技术研究。E - m a i l ：y s h y y h o t m a i l c o m ：T e l ： 1 3 8 3 8 0 0 6 1 1 0 万方数据 拯圮鱼壅筮堑皇! 毡压塑! 生! 兰旦苤! i

12、 鲞筮! 翅 起。自1 9 9 2 年起，印度和孟加拉国先后发生0 1 3 9 霍乱，并造成广泛传播，我国也有0 1 3 9 霍乱的爆 发或输人性病例 。尽早快速诊断该病原体，对于 迅速控制传染源、减少病死率具有重要意义。采用 霍乱弧菌0 1 3 9 群的特异性单克隆抗体开发的胶 体金试纸条，可快速、简便、准确地检测霍乱弧 菌旧J 。为了建立霍乱弧菌0 1 3 9 群快速检测方法， 本文利用细胞融合技术，制备了抗霍乱弧菌0 1 3 9 群的单克隆抗体，并对这些单克隆抗体进行了相关 方面的鉴定。用本研究制备的单克隆抗体研制的 霍乱弧菌0 1 3 9 群快速诊断试纸条，经与培养法对 比和临床试用，

13、特异性和灵敏度均较好。 材料与方法 1 材料 ( 1 ) 所有菌株均为中国医学细菌保藏管理中 心和中国疾病预防控制中心传染病预防控制所卫 生部医学分子细菌学重点实验室提供的标准株。 ( 2 ) 小鼠骨髓瘤细胞S P 2 0 从中国预防医学 科学院病毒学研究所引进。 ( 3 ) B A L B c 小鼠从中国医学科学院实验动物 研究所引进，雌性，8 周龄，体重2 0 9 左右。 ( 4 ) R P M I 1 6 4 0 培养基及鼠I g 类及亚类鉴定 试剂盒为G I B C O 公司产品；辣根过氧化物酶标记 的兔抗鼠I g 抗体为郑州兰森生物技术有限公司制 备；新生牛血清购白兰州民海生物工程有

14、限公司； 添加剂H A T 、融合剂P E G ( 平均分子量20 0 0 ) 为 S i g m a 公司产品。 2 方法 2 1 动物免疫及细胞融合福尔马林灭活的 霍乱弧菌0 1 3 9 群用生理盐水稀释至1 0 9 个m L ， 每只小鼠腹腔注射0 5 m L ，每间隔1 周用同样剂量 加强注射一次，共5 次。融合前3 d 尾静脉注射同 样量细菌加强免疫。取免疫小鼠脾脏细胞与S P 2 0 骨髓瘤细胞在5 0 P E G 作用下常规融合旧J ，分别 接种于9 6 孔培养板，置于5 C O ：、3 7 培养箱培 养。 2 2 杂交瘤细胞筛选将免疫用霍乱弧菌 0 1 3 9 群置于一8 0

15、冰箱反复冻融，然后用包被缓 冲液l ：1 0 0 倍稀释后包被酶标板，每孔1 0 0 p L ，室 温过夜，次日用封闭缓冲液封闭残余位点。同样方 法制备霍乱弧菌0 2 2 群、霍乱弧菌0 1 5 5 群、大肠 杆菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌、伤寒及各型副伤寒杆 菌、粪链球菌、河弧菌、耶尔森氏菌、痢疾杆菌、变形 3 9 1 杆菌、出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 、金黄色葡萄球菌 等的包被板。筛选检测时，将1 0 0 斗L 杂交瘤细胞 培养上清加于0 1 3 9 霍乱弧菌包被微孔中，3 7 水 浴中放置4 0 r a i n ，洗涤3 次，加人辣根过氧化物酶 标记的兔抗鼠I g 抗体，反应4

16、0 m i n ，洗涤后加入底 物显色。将强阳性孔的杂交瘤细胞转移至2 4 孔培 养板，待细胞生长至铺满孔底1 1 0 时用其它细菌 包被板检测。 2 3 克隆培养及抗体制备将霍乱弧菌 0 1 3 9 群细菌包被板检测为阳性而其他细菌包被板 检测为阴性的杂交瘤细胞，用有限稀释法进行克隆 化培养。当细胞生长至铺满孔底1 1 0 时，再用同 样方法检测，将强阳性孔再克隆，如此反复3 4 次，直至阳性率达到1 0 0 。将杂交瘤细胞扩大培 养，注射于经石蜡油预处理的B A L B c 小鼠腹腔， 每只2 1 0 5 个，7 1 0 天小鼠腹部隆起，活体穿刺 抽取腹水。用辛酸一硫酸铵法从小鼠腹水中纯化

17、 抗体。 2 4 单克隆抗体鉴定腹水效价测定：将 腹水从l ：1 0 0 0 起作倍比稀释，然后在霍乱弧菌 0 1 3 9 群包被酶标板上用E L I S A 法测定其效价，具 体方法同杂交瘤细胞筛选。免疫球蛋白类及亚 类测定：用S I G M A 公司生产的检测小鼠I g 亚类酶 联免疫分析试剂盒检测杂交瘤细胞培养上清，按说 明书操作，稍作改进。抗体亲和常数测定：选用 间接E L I S A 方法测定，参照B e a t t y 等H 1 的方法。 用灭活的霍乱弧菌菌0 1 3 9 群液作倍比稀释包被 9 6 孔酶标板，加入倍比稀释的M A b ，再加入H R P 标记羊抗鼠I g G 抗体

18、，T M B 显色，于4 5 0 n m 测O D 值，以抗体浓度的对数为横座标，以O D 值为纵座 标，以每条曲线上部平坦段的O D 值作为1 0 0 ，在 曲线上查出5 0 O D 值时相对应的抗体稀释度，按 B e a t t ) r 推导公式：K 。= ( n 1 ) 2 ( n A b t A b t ) ，计算亲和常数。凝集试验：M A b s 腹水用 P B S 缓冲液1 ：1 0 稀释，分别与霍乱弧菌0 1 3 9 群、 霍乱弧菌0 1 群、霍乱弧菌0 2 2 群、霍乱弧菌0 1 5 5 群、大肠杆菌、副溶血弧菌、麦氏弧菌、伤寒及各型 副伤寒杆菌、粪链球菌、河弧菌、耶尔森氏菌、

19、痢疾 杆菌、变形杆菌、出血性大肠杆菌0 1 5 7 ：H 7 、金黄色 葡萄球菌标准株菌液作玻片凝集试验，观察M A b s 与这些细菌菌株的反应情况。胶体金配对试验： 将所获得的2 2 株纯化M A b s 分别包被硝酸纤维膜 和标记胶体金粒子1 ，然后两两组合检测0 1 3 9 群 霍乱弧菌菌液。将显色较好的配对再检测肠道正 万方数据 3 9 2 常菌群和常见的肠道致病菌群，以进一步观察 M A b s 的特异性和应用于检测试剂盒的可能性，对 均无交叉者进行重点鉴定和保存。 2 5 稳定性试验筛选出的杂交瘤细胞一部 分在培养箱中连续培养1 5 周，然后注射于B A L B c 小鼠腹腔制备

20、腹水；一部分在液氮中保存1 2 个月 后复苏，扩增培养后注射于B A L B c 小鼠腹腔制备 腹水，两批腹水与最初制备的腹水同时用E L I S A 法 检测滴度，观察杂交瘤细胞分泌抗体的稳定性。 2 6 临床考核用配对较好的单克隆抗体制 备的胶体金免疫层析试纸条，与细菌培养法对比检 测临床标本1 8 4 例，以考核检测试纸条法与细菌培 养法的符合率。 结果 1 细胞融合及配对试验 两次融合共获得分泌抗体的杂交瘤细胞株2 2 株，配对试验筛选出特异性较强的4 株M A b s 细胞 株：1 G 3 、2 E 8 、4 D 9 和4 1 4 。 2 单克隆抗体的特性 包括腹水效价、I g 类及

21、亚类、抗体亲和常数，见 表1 。 表14 株单克隆抗体的特性 3 特异性鉴定 配对试验筛选出的4 株M A b s 只能与霍乱弧 菌0 1 3 9 群标准株菌液发生凝集反应，与其它试验 菌株均不发生凝集反应，说明本研究获得的M A b s 具有较强的特异性。用筛选出的M A b s 生产的快 速检测霍乱弧菌0 1 3 9 群的胶体金免疫层析检测 条，与细菌培养法在临床标本的对比试验中，特异 性和灵敏度均达到1 0 0 。具体数据见表2 。 表2 胶体金试纸条与细菌培养法对比 以上进一步表明，所制备的M A b s 具有良好的 特异性。 4 稳定性 这些杂交瘤细胞株连续培养1 5 周、经液氮冻

22、存1 2 个月后复苏，仍能稳定地分泌抗体。所得腹 水效价如表3 。 表34 株细胞株所制备腹水的稳定性 讨论 细菌成分较为复杂，针对某种细菌的抗体往往 与同一属或相近属的细菌有交叉反应。为了获得 特异性好的M A b s ，在杂交瘤细胞的筛选过程中，我 们设计了交叉反应试验，以便淘汰不需要的细胞， 这一设计使细胞株的筛选工作量大为减少。 霍乱弧菌0 1 3 9 群的培养及形态特性与0 1 群 相同，但是与0 1 群的诊断血清不发生凝集。0 1 3 9 群与0 2 2 群和0 1 5 5 群有共同的“0 ”抗原因子，所 以在鉴定时，我们特别使用0 2 2 群和0 1 5 5 群霍乱 弧菌包被的酶

23、标板同时检测杂交瘤细胞培养上清， 以便排除与之起反应的抗体，为以后生产高特异性 的霍乱弧菌0 1 3 9 群检测试剂奠定了基础。 参考文献： 【1 闻玉梅现代医学微生物学 M 第l 版上海：上海医科大学 出版社，1 9 9 9 ：3 3 1 - 3 4 9 2 L eR o u xWJ ，M a s o a b iD ，D eW e tCM ，e ts 1 E v a l u a t i o no far a p - i dp o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nb a s e di d e n t i f i c a t i o nt e c h

24、 n i q u ef o rV i b r i oe h o l e r a ei s o l a t e s J W a t e rS c iT e e h n o l ，2 0 0 4 5 0 ( 1 ) ：2 2 9 - 2 3 2 3 C a m p b e l lAM M o n o c l o n a la n t i b o d ya n di m m u n e s e n s o rt e c h n o l o 盱 M E l s e v i e rS c i e n c eP u b l i s h e r sB V ，1 9 9 1 ：1 8 9 - 2 0 3 4

25、B e a t t yJD ，B e a t t yBG ，V l a h e sW G M e w e m e mo fm o n o c l o n a l a n t i b o d ya f f i n i t yb yn o n - c o m p e t i t i v ee n z y m ei m m u n o a s s a y J J I m m u n o lM e t h o d s ，1 9 8 7 ，1 0 0 ( 1 - 2 ) ：1 7 3 1 7 9 【5 杨书豪，张云汉。王玉金，等血清甲胎蛋白胶体金免疫层析快 速检测法的建立及应用 J 实用肿瘤杂志，2 0 0 4 ，1 9 ( 1 ) ：4 8 5 1 ( 张增武编辑) 万方数据