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1、双苯氟嗪对脑缺血再灌注损伤后脑组织及 血清中 NO、 NOS、 iNOS 的影响 吕 平， 郭 芳， 张国红， 王春霖， 王永利 （河北医科大学药理学教研室， 河北 石家庄 050017） 收稿日期： 2005 -06 -01， 修回日期： 2005 -07 -06 基金项目： 国家高技术研究发展计划 （863 计划） 资助项目 （No 2002AA2z3132） 作者简介： 吕 平 （1977 - ） ， 女， 博士生， Tel： 0311-86265644-8106， E- mail： Lping 77 sohu. com； 王永利 （1947 - ） ， 男， 教授， 博士生导师， 研究
2、方向： 心脑 血管药理学， 通讯作者， Tel： 0311-86266824， Fax： 0311- 86057291， E-mail： wangyl52 heinfo. net 中国图书分类号： R-332； R 322. 81； R 329. 24； R 345. 44； R 743. 31； R 977. 3 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 11 -1340 -04 摘要： 目的 研究双苯氟嗪 （Dipfluzine， Dip） 对大鼠脑缺血 再灌注损伤模型的脑组织及血清中一氧化氮 （NO） 含量、 一 氧化氮合酶 （NOS） 及诱导型一氧化氮合酶 （i
3、NOS） 活性的影 响。方法 选用+SD 大鼠， 随机分为 7 组： 假手术组、 缺血 再灌注组、 溶剂对照组、 Dip （0. 5、 1. 0、 和 2. 0 mgkg -1） 治疗 组、 氟桂利嗪 （Flunarizine，Flu） 1. 0 mgkg -1阳性对照组。 采用改良的 Pulsinelli 四动脉结扎法制备大鼠全脑缺血 15 min 再灌注 24 h 模型， 并于再灌注开始时尾静脉注射给药。 分别观察各组大鼠脑海马 CA1区神经元形态学变化以及脑 组织和血清中 NO 含量和 NOS、 iNOS 活性的变化。结果 形 态学观察可见： 假手术组细胞排列整齐、 紧密， 胞核大而圆，
4、 透明， 核仁清晰可见， 缺血再灌组和溶剂对照组细胞排列松 散， 胞体缩小， 核不规则。双苯氟嗪和氟桂利嗪均可明显改 善这种损伤性改变。与假手术组相比， 缺血再灌注组和溶剂 对照组脑组织和血清中 NO 含量和 NOS、 iNOS 活性明显升 高； 与溶剂对照组相比， Dip 1. 0 mgkg -1组、 Dip 2. 0 mg kg -1组及 Flu 组脑组织和血清中 NO 的含量、 iNOS 活力、 以 及脑组织中 NOS 活力均明显降低。结论 双苯氟嗪可降低 NOS、 iNOS 活性， 减少 NO 含量， 减轻神经元损伤程度， 具有 脑保护作用。 关键词： 双苯氟嗪； 脑缺血再灌注损伤；
5、一氧化氮； 一氧化氮 合酶 一氧化氮 （Nitric oxide， NO） 具有复杂的生物学 效应， 参与神经系统多方面功能的调节， 在病理状况 下， 由于其产生过多引起氧化应激而具有神经毒性 作用。近年来的研究发现它可通过多种途径引起脑 组织损伤， 在缺血性脑血管病损害中起着重要作用。 双苯氟嗪是一种钙拮抗剂， 对缺血性脑损伤具有明 显的保护作用 1。本实验采用大鼠全脑缺血 15 min 再灌注 24 h 模型， 观察了应用双苯氟嗪后脑组 织和血清中 NO、 NOS 和 iNOS 的变化。进一步探讨 双苯氟嗪对缺血再灌注性脑损伤的保护作用是否有 NO 和 NOS 机制参与。 1 材料与方法
6、1. 1 材料 1.1. 1 实验动物 +健康 SD 大鼠， 体重 250 300 g， 由河北医科大学动物实验中心提供。合格证号： DK0310-0021。 1. 1. 2 主要仪器 TU-1800 紫外可见分光光度计 （北京普析通用仪器有限公司） ； 5810R 离心机 （ep- pendorf company） 。 1. 1. 3 主要试剂 双苯氟嗪 （河北医科大学） 溶于 溶剂中 （溶剂： 5 ml 二甲基乙酰胺、 2 ml 1% 酒石酸， 加入至 5%葡萄糖注射液中并稀释至 100 ml） ； 氟桂 利嗪 （河南南阳制药厂） ， 其配制方法同双苯氟嗪； NO、 NOS、 iNOS 试
7、剂盒 （南京建成生物工程研究 所） ， 其余试剂均为国产分析纯。 1. 2 方法 1. 2. 1 动 物 模 型 的 制 备 模 型 采 用 改 良 的 Pulsinelli 四动脉结扎法。术前用体积分数为 10% 水合氯醛腹腔注射麻醉。背位固定大鼠， 切开颈前 区皮肤 2 3 cm， 沿气管两侧分离颈总动脉， 在颈总 动脉下穿以直径为 0. 23 mm 丝线。丝线两端分别 穿过从颈部肌肉处向背部两侧穿入的两个硬质小 管， 并从背侧引出， 这样通过控制线的拉紧与松弛来 决定颈总动脉的夹闭与开放。腹位固定大鼠， 剪开 头部正中皮肤， 以第一颈椎棘突为标志， 分离暴露翼 小孔， 用电凝烧灼闭塞双侧
8、椎动脉。24 h 后在大鼠 清醒状态下， 夹闭双侧颈总动脉， 造成全脑缺血， 15 min 后， 松开动脉夹， 恢复颈总动脉血流， 以此为再 灌注起始点。完全阻断血管后， 大鼠出现意识消失、 呼吸加深加快， 对疼痛刺激无反应、 翻正反射和瞳孔 对光反射消失， 此为模型成功标志。 1.2. 2 动物分组与用药 大鼠随机分为假手术组、 缺血再灌注组 （I-R group） 、 溶剂对照组、 Dip （0. 5、 1. 0、 和 2. 0 mgkg -1） 治疗组、 Flu 1. 0 mgkg-1阳 性对照组。其中假手术组只行手术通路， 不电凝双 0431中国药理学通报 Chinese Pharma
9、cological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） ： 1340 3 侧椎动脉也不夹闭颈总动脉。其余各组均做模型处 理。溶剂组及各给药组均于再灌注开始时尾静脉注 射给药。给药容积为 2. 5 mlkg -1体重。 1. 2. 3 标本制备 各组大鼠在缺血再灌注 24 h 后， 均内眦取血， 置于干燥试管中， 2 500 rmin -1， 离心 10 min， 然后将上清置于干净 EP 管中，-80 保存。用于测定 NO、 NOS 和 iNOS。取血完毕后立 即将各组大鼠断头取脑。冰盘上快速取一侧大脑皮 层， 用冰冷生理盐水冲洗掉血液， 滤纸吸干水分， 于 低温环境下称重取
10、约 300 mg， 置于含有冰冷生理盐 水的玻璃匀浆器中 （匀浆器放入冰浴中） 制成质量 分数为 10%的脑组织匀浆， 然后放置于低温离心机 中， 4、 2 500 rmin -1， 离心 10 min。取上清液， 分 装于 1. 5 ml EP 管中， 置于 -80低温冰箱中保存， 用于测定各个指标。 1. 2. 4 NO 含量及 NOS、 iNOS 活力的测定 均严格 按试剂盒说明进行操作， 以每毫克脑组蛋白每分钟 生成 1 nmol NO 为一个 NOS、 iNOS 酶活力单位， 以 TU-1 800紫外可见分光光度计测定其 OD 值， 并计 算出各组 NO 含量及 NOS、 iNOS
11、活力， 用考马斯亮 蓝法测定蛋白含量。 1. 2. 5 HE 染色及组织学观察 缺血再灌注 24 h 后， 迅速将大鼠断头取脑， 沿冠状切面取视交叉后约 2 5 mm， 置4%多聚甲醛中固定24 72 h。常规梯 度乙醇脱水、 二甲苯透明、 浸蜡、 包埋。于切片机上 行 6 m 厚冠状切片。切片脱蜡至水后， 行常规 HE 染色。并在光镜下观察海马 CA1区形态学变化。 1. 3 统计学处理 实验数据均用*x s 表示， 组间 均数的比较采用单因素方差分析， 量效与时效关系 采用 spearman 相关分析。应用 SPSS 10. 0 统计软 件。 2 结果 2. 1 双苯氟嗪对脑组织中 NO、
12、 NOS 及 iNOS 的影 响 从 Tab1 可见， 与假手术组相比， 溶剂组及缺血 再灌注组脑组织中 NO 含量、 NOS 和 iNOS 活性明显 增加 （P 0. 05） 。结论 壳聚糖和其衍生物对 Hp 有普遍 的抑菌作用； 壳聚糖及其衍生物的抗 Hp 作用受多种因素 影响， 其中 pH 值对壳聚糖抗菌作用的影响最为明显， 在 pH 值 6 4 范围内， 壳聚糖的抗菌活性随着 pH 值的下降而增 强； 壳聚糖的脱乙酰度、 结构 （化学修饰） 及分子量也影响 收稿日期： 2005 -05 -28， 修回日期： 2005 -07 -04 基金项目： 国家自然科学基金资助项目 （No 300
13、60032） 作者简介： 谢 勇 （1959 - ） ， 女， 教授， 主任医师， 博士生导师， 研究 方向： 幽门螺杆菌感染的基础与临床， Tel：0791-8692507， E-mail：xieyong-med tom. com 壳聚糖的抗菌活性， 不同的细菌所要求的脱乙酰度、 修饰基 团和分子量有着明显的差异。 关键词： 壳聚糖； 幽门螺杆菌； 抗菌活性 幽门螺杆菌 （Helicobacter pylori，Hp） 感染已被 公认为慢性胃炎、 消化性溃疡和胃癌的重要致病因 子， 有效根除 Hp 对于预防 Hp 相关性疾病的发生具 有十分重要的意义。目前尚无一个简单、 有效、 经 济、 无
14、毒副作用、 病人依从性好、 耐药率低的理想治 疗药物。人们一直在试图寻找符合上述要求的更为 理想的抗 Hp 新药。壳聚糖是一种来源丰富的天然 氨基葡萄糖， 国内外的许多研究已证实壳聚糖具有 广谱的抗菌作用 1， 2。但是有关壳聚糖抗 Hp 作用 的研究未见报道， 为此本文研究了壳聚糖及其衍生 物在体外对 Hp 的抑菌作用及其影响因素， 为其体 内应用奠定理论和实验基础。 1 材料与方法 1. 1 材料 1.1. 1 试剂与菌株 空肠弯曲菌琼脂基础、 布氏肉 汤培养基础， 中国腹泻病控制上海试剂供应研究中 心产品； 70% 脱乙酰度壳聚糖 （ DD70壳 聚 糖） 、 88. 5%脱乙酰度壳聚糖
15、 （DD88. 5壳聚糖） 及羧甲基壳 聚糖， 上海其胜生物制品有限公司产品； Hp国际标 Dip（0. 5， 1. 0， 2. 0 mgkg -1）group， and Flu 1. 0 mg kg -1 group. Transient global ischemia model（15 min ischemia followed by 24 h reperfusion）was set up using Pusinellis four-vessel occlusion method. Drugs were given by caudal vein injection when startin
16、g reperfusion. The morphological changes of neuron in hippocampal CA1sector were examined under micro- scope. And the contents of NO and the activities of NOS and iNOS in each group were measured respec- tively.Results In the sham operation group，the cells ranged regularly in hippocampal CA1sector，t
17、he nuclei were big，round and pellucid and easily observ- able. In the I-R 24 h and solvent groups，the cells ranged disorderly， with shrank cell bodies， and irreglar nuclei. Dip and Flu obviously improved the injuries mentioned above in different degrees. Compared with the sham operation group，the co
18、ntents of NO and the activities of NOS and iNOS in the brain tissue and ser- um were greatly increased in the ischemia-reperfusion and solvent groups. After the treatment of Dip （1. 0， 2. 0 mgkg -1）and Flu，the contents of NO and ac- tivity of iNOS in the brain tissue and serum and the ac- tivity of
19、NOS in the brain tissues were decreased. Con- clusion Dipfluzine may play a protective role against the ischemia-reperfusion injury by decreasing the activ- ities of NOS and iNOS and the content of NO. Key words： dipfluzine；ischemia-reperfusion injury； NO；NOS 3431中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Nov； 21 （11） ： 1343 7