嗜酸性粒细胞提呈抗原对肺组织CD4细胞分化的影响.pdf

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1、书书书 论著文章编号： 1007 -8738 （2006） 02 -0261 -03 嗜酸性粒细胞提呈抗原对肺组织 CD4 + 细胞分化的影响 尹 琦1，施焕中2*，覃雪军2 （1柳州市第三人民医院检验科，广西 柳州 545007； 2广西医科大学附属医院呼吸和危重症监护中心，广西 南宁 530027 = ） 收稿日期： 2005 -04 -11； 修回日期： 2005 -06 -29 基金项目：国家自然科学基金资助项目 （No.30060079） 作者简介：尹 琦 （1964 - ） ，女，广西柳州人，主管技师. Tel：（0772） 3925107；*Corresponding autho

2、r 摘 要 目的：探讨嗜酸性粒细胞 （EOS） 对肺组织中的 CD4 + 细胞分化的影响。方法：以鸡卵清蛋白 （OVA） 致敏和 雾化吸入刺激 BALB/ c 小鼠以诱发气道的 EOS 在气道聚集后 将其分离纯化，然后与来源于致敏小鼠肺组织的 CD4 + 细胞 共同培养。在部分试验中加入抗 CD80 和 （或） 抗 CD86 mAb。 同时，将 EOS 注入致敏小鼠气道， 3 d 后，取出肺组织，并将 其制成细胞悬液进行培养。收集培养上清液，用 ELISA 测定 其中 IL-4、IL-5、IL-13 及 INF- 的含量。结果：在和 EOS 体 外共同培养的条件下，肺组织 CD4 + 淋巴细胞

3、产生 IL-4、IL- 5、和 IL-13 等 Th2 类因子， 但不产生 INF- 等 Th1 类因子； 抗 CD80 和 （或） 抗 CD86 mAb 可以明显抑制 Th2 类细胞因子的 产生。将 EOS 注入致敏小鼠气道后，同样在体内能激发肺组 织 CD4 + 活化，产生 Th2 细胞因子 IL-4，IL-5，IL-13，但不产 生 INF-，与体外结果相似，抗 CD80 和 （或） 抗 CD86 mAb 可 以抑制 EOS 在体内的抗原提呈过程。结论：EOS 细胞在体内 或体外均能摄取和处理抗原，激发 CD4 + 的 Th2 反应。 关键词 嗜酸性粒细胞；CD4 + 细胞分化；抗原提呈

4、细胞； 肺组织 中图分类号 R562. 2 文献标识码 A 多年来，嗜酸性粒细胞 （EOS） 细胞在过敏反应 中的作用一直是许多学者关注的焦点 1。在传统的 观念中，EOS 仅作为一个效应细胞，通过释放颗粒蛋 白和前炎症因子，在过敏性疾病及一些寄生虫感染 中发挥重要作用。然而许多研究已经证明，EOS 的 作用不仅仅如此。近年来的研究表明，EOS 细胞具 备抗原提呈细胞的基本条件，能将抗原提呈给 T 淋 巴细胞，以调控 Th 细胞的免疫反应，促进 CD4 + 细 胞的分化；研究还发现，无论在体内或体外，气道 EOS 均可作为抗原提呈细胞 （APC） ，将抗原信息提 呈给局部引流淋巴结的 CD4

5、+ 细胞，促使其增殖，向 Th2 细胞分化，产生淋巴因子 IL-4、IL-5、IL-13，不 产生 INF-，而且 EOS 的抗原提呈作用必须依赖 CD80 和 CD86 2。本研究旨在探讨气道 EOS 细胞提 呈抗原对肺组织 CD4 + 淋巴细胞分化的影响，从而进 一步证明 EOS 细胞在过敏性疾病中的重要作用。 1 材料和方法 1.1 材料 6 8 周龄雌性 BALB/ c 小鼠，购自广西医科大动 物实验中心。雾化器，DeVibiss Crop 为 Somerset. PA 公司产品。 磁性活化细胞分离系统 （MACS） 均为 Miltenyi BiotecGmbH， Bergisch G

6、Ladbach，Germany 产品；酶标仪为美国 Bio-Rad 公 司产品。OVA、Al （OH） 、Percoll、过敏原、Sephadex G-10 柱 均为 Sigma Chemical Co，St，Louis MO 公司产品。RPMI1640 培养液、重组小鼠 GM-CSF，均为 GIBCO Invitrogen Co，Carls- bad，CA 产品；抗小鼠-CD80 mAb、抗小鼠-CD86 mAb、大鼠 IgG2a 对照蛋白，购自于 PharMingen，San Diego，CA；小鼠 IL- 4、IL-5、INF- 检测试剂盒，PharMingen，SanDiego，CA

7、产品； 小鼠 IL-13 检测试剂盒，R&D System，Minneapolis，MN 产品。 1. 2 方法 1. 2. 1 EOS 的纯化 BALB/ c 小鼠气道 EOS 的准备和纯化以 及鸡卵清蛋白 （OVA） 致敏 CD4 + 细胞分离的方法详见参考文 献 3， 4 。 1. 2. 2 肺组织致敏 CD4 + 细胞的获取 用肝素盐水通过右 心，灌洗肺组织，直到将肺大静脉内的血液冲掉干净。将肺 组织从胸腔剥离，用剪刀剪碎，放入含有30 mg/ L DNAse-l 和 1. 5 105/ L 过敏原的 RPMI1640 培养液中，37 持续轻摇震 动培养 35 min。将肺组织碎片碾磨

8、并通过 SS80 筛网，用不含 钙/ 镁的 PBS 液清洗2 次，并将滤过液通过 Sephadex G-10 柱， 以剔除巨噬细胞。然后将通过 SephadexG-10 柱的肺细胞滤过 液与包被抗-CD4 mAb 的微小磁珠共同孵育。利用 Miltenyi Biotecmagnetically 的 “正向选择作用” 分离出高纯度 （ 97%） OVA 致敏的 CD4 + 细胞，成活率 98%。在显微镜下观察已 确定不含巨噬细胞。 1. 2. 3 体外 EOS 细胞对肺组织 CD4 + 分化影响的实验 将纯 化的肺组织 CD4 + 细胞与纯化的 BALF 来源的 EOS 细胞离心 取沉淀，用 R

9、PMI1640 培养液将上述细胞密度分别调整到 1 109个/ L 和 5 108个/ L，按以下实验组 （每组设 6 孔） 分别加 入到含 RPMI1640 的48 孔平底培养板上： ： 肺组织 CD4 + 细 胞；：肺组织 CD4 + 细胞 + 纯化的 EOS 共同培养；：前述 共同培养液加入 OVA （200 mg/ L） 组；：EOS 组 （对照 1） ； ：EOS + OVA 组 （对照 2） 。为观察是否需要 B7 协同信号的 参与，又设：在上述共同培养液中加入抗小鼠 CD80 mAb （16- 10AI， 10 mg/ L） 、和 （或） 抗 CD86 mAb （GI1， 10

10、mg/ L） 、或对 照大鼠 IgG2a （10 mg/ L） 共计 4 个组。所有 EOS 培养加入 5 g/ L 重组小鼠粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，用于维持 EOS 细胞的存活。以上实验均在 37、50 mL/ L CO2条件下 培养 4 d 后，收集不含细胞的上清液并冻存于 -70液氮中。 162ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2006， 22 （2） 1. 2. 4 体内 EOS 细胞影响肺组织 CD4 + 分化的实验 用 10 g OVA 加 1 mg AL （OH） 3经气道致敏小鼠。2 wk 后，在 溴乙

11、醇 （250 g/ kg） 轻度麻醉下以无菌操作暴露气管，将 1 106个来自 OVA 致敏和刺激小鼠的气道 EOS （悬于 50 L PBS） 以 1 mL 注射器缓慢注入气管。同时给部分试验组小鼠 气道注射死的 EOS 细胞。在给致敏小鼠注入细胞 1 d 和 2 d 后，按试验要求将小鼠分为注射抗 CD80 mAb （100 g） 组、抗 CD86 mAb （100 g） 组，和抗 CD80 + 抗 CD86 mAb （共200 g） 组，分别从小鼠尾部静脉注射相应的抗体；对照组注射大鼠 IgG2a （100 g） 。3 d 后，按1. 2. 2 方法制备肺组织 CD4 + 细胞 悬液。将

12、制备的肺 CD4 + 细胞 （2 109个/ L） 按以下试验组分 别置于含 RPMI1640 培养液的 48 孔细胞培养板。 （1） 气管注 入死的 EOS 细胞的小鼠肺 CD4 + ； （2） 气管注入死的 EOS 细 胞的小鼠肺 CD4 + + OVA； （3） 气管注入活的 EOS 细胞的小鼠 肺 CD4 + ； （4） 气管注入活的 EOS 细胞的小鼠肺 CD4 + + OVA； （5） 气道注入活的 EOS 细胞，静脉注射抗 CD80 mAb 组 小鼠肺 CD4 + 细胞； （6） 气道注入活的 EOS 细胞，静脉注射抗 CD86 mAb 组小鼠肺 CD4 + 细胞； （7） 气道

13、注入活的 EOS 细胞 后，静脉注射抗 CD80 mAb + 抗 CD86 mAb 组小鼠肺 CD4 + 细 胞； （8）气道注入活的 EOS 细胞，静脉注射大鼠 IgG2a （100 g）的对照组小鼠肺 CD4 + 细胞；以上各试验组在上述 条件下培养2 d，然后收集培养上清液冻存于 -70待测其中 细胞因子的含量。每个试验组设 6 个复孔。 1. 2. 5 细胞因子的 ELISA 检测 上述实验及对照各组上清 液的 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN- 的含量均采用酶联免疫吸附 法 ELISA 检测。操作按产品说明书进行。 1. 2. 6 统计学分析 运用 SPSS 软件进行分析。

14、所有数据以 x s 表示，各组间资料比较采用配对 t 检验以及方差分析和 q 检验。 2 结果 2. 1 EOS 细胞在体外对肺组织 CD4 +分化的影响 经4 d 的 体外培养后，单独培养的肺组织 CD4 + 细胞不论是否加入外 来特异抗原 （OVA） ，其上清液中均不含 IL-4、IL-5、IL-13 和 IFN-；与 OVA 致敏的 EOS 共同培养的 CD4 + 细胞产生大量 IL-4、IL-5、和 IL-13，但 IFN- 的含量很低；如再在该共同培 养体系中同时加入 OVA 后，IL-4、IL-5 和 IL-13 的含量增加 非常显著 （P 0. 05， 表1） 。单独对 EOS

15、进行培养，其培养上清液中待测淋巴因子 含量很低，而外来的 OVA 抗原刺激对其无影响。这说明只有 OVA 致敏的 EOS 细胞在体外能提呈 OVA 抗原给致敏的 CD4 + 细胞， 促使这些 T 淋巴细胞分化， 分泌 Th2 类细胞因子。 表 1 体外 EOS 影响 CD4 + 细胞分泌淋巴因子含量的 ELISA 测定（ng/ L） 细胞因子EOSEOS + OVAEOS + CD4+（EOS +CD4+）+OVA IL-45. 2 1. 25. 6 1. 190. 2 14. 2325. 3 40. 2b IL-512. 2 2. 414. 5 3. 2376. 3 74. 2895. 9

16、90. 5b IL-137. 7 1. 311. 1 1. 0157. 9 34. 4449. 5 44. 2b IFN-6. 8 0. 9 4. 9 1. 025. 3 10. 132. 5 9. 4b aP 0. 05，表 3） 。这说明 EOS 在体内能行使抗原提呈功 能，诱导肺组织中的 CD4 + 细胞产生 Th2 类细胞因子。 表 3 致死 EOS、活 EOS 对体内 CD4 + 细胞分泌淋巴因子含量 的 ELISA 测定（ng/ L） 致死 EOS致死 EOS + OVA活 EOS活 EOS + OVA IL-410. 2 2. 19. 7 2. 248. 4 9. 1123. 4

17、 20. 4b IL-512. 0 2. 913. 7 2. 3132. 6 24. 6388. 6 49. 3b IL-13L8. 8 1. 47. 2 1. 157. 6 16. 5160. 7 24. 7b INF- 9. 7 0. 96. 4 0. 812. 6 4. 313. 2 3. 4b bP 0. 01 vs 活 EOS （t 检验） . 再予注射抗 CD80 mAb，或抗 CD86 mAb，或抗 CD80 + CD86 mAb，以在体内单独阻断 CD80 或 CD86，或同时阻断 CD80 和 CD86。结果显示单独封闭 CD80 或 CD86，能抑制 Th2 类细胞因子的分

18、泌 （P 0. 05） ；而这 2 种抗体同时发挥作 用，抑制作用更加明显 （P 0. 001，表 4） 。 表 4 不同 B7 协同信号影响体内 CD4 + 细胞分泌淋巴因子含 量的 ELISA 测定（ng/ L） 对照组 （IgG2a）抗 CD80抗 CD86抗 CD80 + CD86 IL-445. 3 7. 534. 6 5. 9ab27. 8 5. 6ab9. 2 3. 3a IL-5145. 3 22. 2102. 2 21. 5ab79. 6 18. 7ab21. 8 8. 7a IL-1360. 5 9. 638. 6 8. 8ab33. 5 7. 2ab9. 2 4. 5a

19、cP 0. 05 vs Ig2a 对照组 （方差分析） ；bP 0. 01 vs 抗 CD80 + 抗 CD86. 3 讨论 在由变应原诱发的气道过敏性疾病中，是以 EOS 在气道大量聚集为主要特征的。大量出现在分 泌物中的 EOS 的作用一直是人们研究的对象。在正 常生理条件下，组织中 EOS 的数量和活性受到严格 的调控，不会引起疾病。气道基底黏膜表层也有 EOS 细胞存在，并能释放和表达一些对淋巴细胞具 262ISSN1007 -8738 细胞与分子免疫学杂志 （Chin J Cell Mol Immunol） 2006， 22 （2） 有调节作用的分子，说明这些细胞有可能具有一些 特定

20、的免疫调节功能。在 20 世纪 80 年代末就已证 明，致敏小鼠经抗原雾化吸入刺激后，气道的 EOS 和人类 EOS 一样 4，能够表达高水平的人类类主 要组织相容性复合物和 B7 协同刺激分子，包括 B7-1 （CD80） 和 B7-2 （CD86） 6。这说明 EOS 细胞具备抗 原提呈细胞的基本条件，能够摄取和处理吸入性抗 原。许多试验已证明，不论在体内或体外，EOS 细胞 一旦接触抗原，它们均能将处理过的抗原信息提呈 给 CD4 + 细胞，促使后者增殖分化 3， 4。后来的研究 扩大了上述发现，进一步将抗原接触过的 EOS 注入 OVA 致敏小鼠气道发现，气道 EOS 被募集到引流淋

21、巴结中，并刺激引流淋巴结 T 细胞分化，并且这种分 化反应具有严格的抗原特异性，依赖 CD80/ CD86 及 仅限于 CD4 + 细胞 3。但是 Rijt 的研究认为，尽管在 接触过敏原后 EOS 迁移到引流淋巴结，并将抗原提 呈给致敏 T 细胞，但它对未分化的 T 细胞不起提呈 的作用 7。 众所周知，Th2 细胞合成和释放 IL-4、IL-5、IL- 13 等细胞因子，促进变应性炎症的发生和发展，并 且能够刺激 B 细胞产生 IgE 及其他抗体。而 Th1 细 胞产生 IFN- 和 IL-2，能活化巨噬细胞和细胞毒 T 细 胞杀灭病毒及其他病原微生物。这两个辅助性 T 细 胞亚群的分化有

22、赖于不同的免疫原性刺激或淋巴因 子的作用。而且，Th1 细胞可以抑制 Th2 细胞的作 用，反之亦然。两者之间相互作用的失衡可能在哮 喘的发病机制中具有十分重要的意义 8。既然 EOS 能表达相关抗原受体分子，刺激 CD4 + T 细胞增殖， 并密集在富含 T 细胞的引流淋巴结中，因此很有必 要去探索 EOS 的提呈抗原作用在 CD4 + 细胞分化中 的效应。Machenzie 等 7认为来自于 IL-5 转基因鼠的 纯化的 EOS 细胞能诱导特异抗原致敏的 Th2 细胞分 泌 IL-4、IL-5、IL-13，但不能产生 IFN-。因此，EOS 在体内能刺激被激化的 CD4 + Th 细胞分泌

23、前炎症因 子。在后来的研究中又发现 9，从 OVA 致敏小鼠气 道分离和纯化的 EOS 细胞在体外能提呈抗原给引流 淋巴结的 CD4 + 细胞，并使其扩增分泌 Th2 类细胞因 子。这些结果与 Mackenzie 的研究相一致。此外，还 发现由气道 EOS 细胞引起的 Th2 细胞扩增必须依赖 CD80 和 CD86，因为应用抗 CD80 或/ 和抗 CD86 mAb 封闭了 B7 分子。阻断这一通路之后，IL-4、IL-5 和 IL-13 等细胞因子的产物随即受到抑制。我们还把来 自于 OVA 致敏小鼠的 EOS 细胞注入到 OVA 致敏小 鼠的气道，3 d 后，取出引流淋巴结，测定细胞因子

24、 产物。其结果与体外试验一样：淋巴结细胞的主要 产物是细胞因子 IL-4，IL-5，IL-13，而不含 IFN-。 添加外源性的抗原后，Th2 类细胞因子的产量增加， 这表明 Th2 细胞在体内也能被 EOS 细胞提呈抗原而 扩增，产生细胞因子。同理，我们在注入预先被固定 致死的 EOS 细胞，则无 Th2 类细胞因子产生 2。 本实验是在以上研究的基础上进行。探讨致敏 EOS 细胞对组织中的 CD4 + 细胞的作用。结果显示： 来自于 OVA 气道致敏小鼠的 EOS 细胞，在体外能将 抗原提呈给肺组织的 CD4 + 细胞，产生 Th2 类细胞因 子；由 EOS 细胞引起的扩增必须依赖 CD8

25、0 和 CD86，因为用抗 CD80 或/ （和） 抗 CD86 mAb 封闭了 B7/ CD28/ CLA-4 协同刺激分子。阻断这一通路后， IL-4，IL-5，IL-13 等细胞因子的产生即受到抑制。将 与 OVA 接触过的气道 EOS 细胞，注入到 OVA 致敏 小鼠的气道后，在体内同样能使肺组织中的 T 细胞 扩增，产生 Th2 类反应，而且这些反应依赖 B7/ CD28/ CTLA-4 协同刺激通路。因此，EOS 细胞在免 疫反应中不仅是作为一个终末效应细胞，而且可通 过强化 Th2 细胞 （这种 Th2 细胞不仅限于淋巴结内 的，还广泛存在于组织中） 活性，在反应性炎症的发 生过

26、程中具有放大作用。 由此可以认为，EOS 细胞具有潜在活化肺 T 细 胞释放疾病介质因子的能力。 参考文献： 1倪殿涛，朱步海，张学庸，等. 支气管哮喘气道炎症的发病机理 及其进展 J . 细胞与分子免疫学杂志， 1997， 13： 45 -48. 2施焕中，杨庆利， 莫小云， 等. 气道嗜酸性粒细胞呈递抗原对 Th1/ Th2 细胞分化的影响 J . 中华医学杂志， 2003， 24： 2162 -2165. 3Shi HZ， Humbles A， Gerard C， et al. Lymph node trafficking and an- tigen presentation by en

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