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1、作者单位： !“#$% 长春市， 吉林省疾病预防控制中心毒理所 （吴 晓刚） ； 吉林大学医学部公共卫生学院 （孙志伟） 实验研究 氯化镉致心肌细胞线粒体的损伤 吴晓刚3， 美国 5?* 公 司） ，:0（ 美 国 1A2B9 公 司 ） ，罗 丹 明 !%“ （CD609BAEF!%“， 美国 1A2B9 公司） ， 碘化丙啶 （)=， 美 国 1A2B9 公司） ， () 酶和乳酸脱氢酶 （*+,） 生化试 剂盒 （南京建成生物工程公司） 。 %-原 代 心 肌 细 胞 培 养：参 照 1ABG76E 和 19HA6E !的经典心肌细胞培养方法。断头处死出生 ! ./ 0后的 1+ 大鼠，
2、 取心脏放于冷 +I,9EJ 液中， 剪取心尖部组织， 放于另外的 +I,9EJ7 液中清洗， 将 心肌组织剪碎至 ! . % BB“体积， 除去血迹、 清洗， 后加入 #- KL的胰蛋白酶， 体积大概为心肌组织的 !# 倍左右， 摇匀， “M N 水浴中消化至酶液浑浊， 取 出， 吸弃上清液， 填加酶溶液， 继续水浴消化， 待第二 次消化后， 将上清液保留， 加含有血清的 +3;3 培 养液终止消化， 混匀， 以 !# :O BAE 离心 / .M BAE， 弃上清， 保留沉淀， 加含血清的 +3;3 培养液， 混 匀， 放置。如此消化数次， 将各次保留的沉淀悬液收 集到一起， 混匀， 再次
3、离心 （!# :O BAE） ， 弃上清， 沉 淀依然用 +3;3 培养液混匀制成细胞悬液， 过 %# 目尼龙网， 成单细胞悬液， 细胞记数， 加培养液调细 胞数至 P Q !#PO BR， “M N、 PL 5?%培养 S# . !%# BAE， 进行差速离心 %。后将各瓶细胞集中， 混匀， 记数细胞密度， 调至 （%- P . /）Q !#PO BR 加 #- #! BB6RO * 的 :0， 接种至培养瓶中继续培养。 “T 实验分组与处理： 细胞培养 M% .!%# D 后， 对 各组分别加入不同浓度的 505R%溶液 （以 +3;3 培 养液配制， 对照组加去离子水） ， 至各组终浓度
4、为 #、 P、 !#、 %#、 “#、 P# !B6RO *， “M N、 PL5?%培养S# BAE。 /T 心肌细胞的鉴定：（!） 细胞形态学观察： 心肌 细胞培养 %/ D 后， 以倒置高倍显微镜观察其形态学 变化。 （%） 免疫组化鉴定方法： 根据心肌细胞中所 含有的各种蛋白特性，将其特有的横纹肌肌动蛋白 （“I79U6BF:AU9U8AE） 作为检测鉴定指标 %， 采用鼠抗 兔 “I79U6BF:AU9U8AE9E8AV60W 及 15 免疫组化染色 试剂盒对心肌细胞中的特有的横纹肌肌动蛋白进行 定位， 对心肌细胞鉴定，确定心肌细胞的纯度。 PT 3( 法测定细胞存活率： 将心肌细胞
5、接种于 S$ 孔培养板上培养， %/ D 后换液， 除去 :0， 继续 培养 M% D 后， 对各孔施加 505R%， 换用无血清的 +3;3 培养液继续培养 S# BAE， 以 3( 法测定细胞 存活率， 分析细胞存活情况。 $T () 酶和 *+, 活性测定： 以购自南京建成公 司的生化试剂盒和分光光度计测定结果。 M- 线粒体膜电位 （33)） 检测：（!） 平均荧光强 度 （34=） 检测法： 细胞染毒并消化， 得到细胞沉淀 后， 制成单细胞悬液， 加等体积的 %# !2O BR 的 CD609BAEF!%“ （+3;3 培养液配制） ， “M N避光孵育 “# BAE， 以磷酸盐缓冲
6、液清洗脱色， !P# :O BAE 离心 !# BAE， 重复 ! 次， 后用微量 )1 混匀细胞， 以流式 细胞仪检测平均荧光强度 （激发波长 P%P EB， 发射 波长 /KK EB） 。 （%） CD609BAEF!%“ 和 )= 共同比色 法： 细胞染毒、 消化和混匀， 加等体积的 %# !2O BR 的 CD609BAEF!%“， “M N 避光孵育 %# BAE， 以 )1 清洗 脱色， !P# :O BAE 离心 !# BAE， 重复 ! 次， 再加入等 体积 !# !2O BR 的 )=， “M N避光染色 !P BAE， 用流式 细胞仪检测， 分析细胞损伤、 死亡和凋亡的百分
7、率 （波长同上） 。 KT 线粒体膜通透性 （33)(） 变化检测：（!） 线粒 体的提取： 参照糖梯度差速离心法 “， 配制线粒体 $%!中华预防医学杂志 %#$ 年 “ 月第 /# 卷第 % 期% -*?-*）# 值 $ 值 56、 /=;% -*?-*）# 值 $ 值 4A 活力值 （B1(! 21$+2$()，7621+21742710，+): 491()(21($14 ?， A： “A“!“B- ?#491(0:6 CD， E+12F066 ;K， “L： K?B!KK?- KM+8+)( E，NO+:+ - S1$/$29 TJ-G$2(49():1$+!+1:$(,+4 ， L： KA!KQ- “AG+12$) ;- U90 %$2(49():1$+6 9$) J *10, G0:， G+149 ?AAB，(6 QA，C(- ?