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1、were studied in vitro， gastric acid secretion was meas- ured by Gastric Secretion Test. Results 4-AP （5 mg kg -1， ig）inhibited the gastrointestinal motility of mice. 4-AP （5 mmolL -1）increased the maximum contractive force and minimum relaxation force，de- creased the amplitude and frequency of the i
2、solated du- odenum peristaltic contraction. 4-AP （2. 5 mgkg -1， ip） significantly enhanced gastric acid secretion of rats. Conclusion 4-AP inhibited gastrointestinal mo- tility and enhanced gastric acid secretion in murine. Key words：4-aminopyridine； gastrointestinal func- tion；murine 大黄素对大鼠体外颅骨成骨细胞
3、的影响 刘钰瑜1， 姚卫民3， 艾春媚2， 许碧连1， 邹丽宜1， 吴 铁1， 崔 燎1 （1. 广东医学院药理学教研室， 2. 广东天然药物研究与开发重点实验室， 广东 湛江 524023； 3. 广东医学院附属医院呼吸内科， 广东 湛江 524001） 中国图书分类号： R-332； R 282. 71； R 284. 1； R 322. 71； R 329. 24； R 329. 28； R 681. 053 文献标识码： A 文章编号： 1001 -1978 （2005） 12 -1473 -05 摘要： 目的 观察大黄素对体外大鼠颅骨成骨细胞细胞周 期、 骨钙素含量、 骨结节数目和面
4、积、 型胶原 mRNA 表达 的影响。方法 在成骨细胞体系中加入不同浓度的大黄素， 应用流式细胞术、 放射免疫测定法、 茜素红染色法及 RT-PCR 的方法观察大黄素对大鼠颅骨成骨细胞的增殖、 骨钙素含 量、 骨结节数目和面积、 型胶原 mRNA 表达的影响。结果 大黄素可刺激成骨细胞分泌骨钙素。低浓度的大黄素可 上调型胶原基因的表达， 高浓度时则降低型胶原的基因 表达。结论 大黄素可以刺激成骨细胞分泌骨钙素和增加 型胶原 mRNA 的表达。 关键词： 大黄素； 成骨细胞； 细胞周期； 胶原； 骨钙素； 矿化； 骨 质疏松 大黄素 （emodin） 化学名为 1， 3， 8-三羟基-6-甲 基
5、蒽醌 （1， 3， 8-trihydroxy-6- methylan-thraquinone） 。 其作用极为广泛， 与骨代谢有关的作用有以下几方 面， 首先大黄素具有雌激素样作用， 可使去势-大鼠 迅速恢复性周期， 临床试用有卵泡激素样功效， 口服 对痛经、 子宫内膜炎等病人有类似雌激素的效用， 并 且与雌激素受体有高度的亲和力， 激动受体产生生 物效应 1， 2。其次， 大黄素有抗超氧负离子自由基 收稿日期： 2005 -07 -08， 修回日期： 2005 -09 -29 基金项目： 广东医学院青年基金资助项目 （No XQ0307） 作者简介： 刘钰瑜 （1976 - ） ， 女， 硕
6、士， 讲师， Tel： 0759-2388588， E- mail： Liuyuyu22 yahoo. com； 崔 燎 （1962 - ） ， 女， 教授， 硕士生导师， 通讯作者， 研究 方向： 防治骨质疏松药物研究， Tel： 0759-2388405， Fax： 0759-2284104， E-mail： cui-liao yahoo. com 的活性和延缓衰老的作用， 且大黄素对脂代谢的影 响和对脂肪细胞分化方面的调节作用可能也有利于 骨质疏松的治疗 3， 4。本课题组前期研究的结果显 示大黄素能促进大鼠成骨细胞碱性磷酸酶活性和增 加细胞内羟脯氨酸含量， 促进骨保护蛋白 mRNA 的
7、 表达 5。故本研究进一步观察大黄素对成骨细胞 的骨钙素含量、 骨结节数目和面积、 型胶原 mRNA 表达等的影响， 并与阳性药物前列腺素进行比较， 为 用大黄素防治骨质疏松提供体外实验依据。 1 材料和方法 1. 1 试剂和仪器 DMEM 培养基、 胶原酶 I、 透明 质酸酶购自 Gibco 公司； 胰蛋白酶、 前列腺素 E2购 自 Sigma 公司； 大黄素标准品由 DELTA 天然有机化 合物信息中心提供； Access RT-PCR 试剂盒为 In- vitrogen 公司产品； 100bp DNA Ladder 购自华美生物 工程公司； 骨钙素放射免疫测定试剂盒购自天津九 鼎医学生物
8、工程有限公司； 茜素红购自上海化学试 剂厂。9600Gen Amp PCR System 购自美国 PE 公 司； DYY-5 型稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器 厂； WD-9403C 型紫外分析仪购自北京六一仪器厂； 1470 WIZARD 型 -计数器购自芬兰 OsteoMeasure， OsteoMetrics，Inc。RT-PCR 选用 -肌动蛋白 （-ac- tin） 为内参照， 引物由上海生物工程公司合成， 序列 见 Tab 1。 1. 2 方法 1.2. 1 大鼠颅骨成骨细胞的制备及培养 参照文 献 5的方法， 无菌取大鼠颅盖骨， 消化所获得的细 胞培养， 传代， 本实验所用细胞
9、为传 1 代细胞。每项 实验重复 2 3 次。 1. 2. 2 流式细胞术分析成骨细胞的细胞周期 参 3741中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） ： 1473 7 Tab 1 Primer secquence of COLL-! and “-actin GenePrimer secquenceProducts Length/ bp COLL- 5CCTGGAAGAGAT GGTGCT 3 （sense） 122 5CCATTCTTGCCAG CAGGAC3 （antisense） -actin 5AACCCTAA
10、GGCCAAC AGTGAAAAG3 （sense） 240 5TCATGAGGTAGTCTG TGAGGT3 （antisense） 考文献 6的方法， 细胞接种后给药 3 d， 大黄素的终 浓度为 2. 5 10 -6 molL -1、 10-6 molL -1、 5 10 -7 molL -1、 2. 5 10-7 molL -1。给药结束后， 用 PBS 冲洗 3 次， 消化收集细胞， 计数细胞数约为 1 106， 收集的细胞离心后洗涤， 迅速注入体积分数 为 0. 75 的冷乙醇中， 震荡均匀， 4 固定。上机前 1 000 rmin -1离心 5 min 弃乙醇， 生理盐水再洗涤
11、1 次， 保留 0. 2 ml 重悬细胞， 加0. 5 ml PI （内含0. 05 mgL -1 Rnase） ， 室温避光染色 30 min， 充分震荡均 匀， 过筛网后上机测定。 1. 2. 3 用放射免疫测定法检测成骨细胞细胞上清 液和细胞裂解液的骨钙素含量 细胞按 2 104/ cm -2接种于 48 孔板， 加入溶剂对照和不同浓度的 药物。前列腺素的终浓度为 10 -7 molL -1， 大黄素 的终浓度为 5 10 -6、 2. 5 10-6、 1 10-6、 5 10-7、 2. 5 10 -7、 1 10-7 molL -1。细胞共培养20 d， 培 养结束前 24 h 换不
12、含血清的 DMEM （H） 培养液， 24 h 后 吸 出 上 清 液 分 装 于 Eppendoff 管 中。加 入 Triton-X100 裂解细胞， 6 h 后吸出裂解液分装于 Ep- pendoff 管中。测定时， 测定管中依次加入细胞上清 液或细胞裂解液 100 l、 标记抗原 100 l、 抗体 100 l， 充分混匀 4 温育 18 h 后加入第二抗体1 000 l， 室温静置后3 600 rmin -1离心 20 min， 弃上清， 测沉淀物放射性强度。用每个标本双管计数率 （计 数分 -1， cpm） 的平均值在标准曲线上读取浓度值 （gL -1） 。本次实验所测 NSB 管
13、 cpm 值与 T 管 cpm 值之比为 0. 0126。 1. 2. 4 茜素红染色法检测成骨细胞的矿化能力 细胞以 2 104cm -2密度加入 24 孔板， 24 h 后换矿 化诱导液 （含体积分数为 0. 1 的胎牛血清 + 1 mmol L -1-磷酸甘油 +50 mgL-1维生素 C 的 DMEM 培养液） 。加入阴性对照和不同浓度的药物， 前列 腺素的终浓度为 10 -7 molL -1， 大黄素的终浓度为 2. 5 10 -6、 1 10-6、 5 10-7 molL -1。培养 60 d 后， 将培养液吸出， 用 PBS 冲洗， 用体积分数为 0. 95 酒精固定 15 mi
14、n， 质量浓度为 10 gL -1的茜素红 （用体积分数为 0. 02 的酒精配制， pH 8. 3） 染色 5 min， 自来水冲洗后在显微镜下观察， 以橘红色结节、 边界清晰、 200 m 为标准， 用半自动图像数字化 分析仪作矿化结节计数和结节面积的测量。 1.2. 5 逆转录聚合酶链反应 （RT-PCR） 测定 COLL- mRNA 的表达 细胞按 2 104cm -2接种于 6 孔 板， 24 h 后加入不同浓度的药物， 大黄素终浓度分 别是： 2. 5 10 -7、 5 10-7、 1 10-6、 2. 5 10-6 mol L -1， 前列腺素 E 2的终浓度是 1 10 -7
15、molL -1； 阴性对照组加 NaOH 溶液 （终浓度是 3. 38 10 -4 molL -1） 。培养 7 d 后， 按照 Trizol 试剂盒说明进 行总 RNA 的抽提。RT-PCR 采用一步法： 2 Reac- tion Mix 12. 5l， RT Taq Mix 0. 5 l， 25 molL -1 的上下游引物各 0. 5 l， RNA 样品 0. 4 g， 加去离 子水使反应总体积为 25 l。COLL-的反应条件 为 50逆转录 30 min， 94预变性 2 min， 94变性 30 s， 54退火 30 s， 70延伸 45 s， 35 个循环， 最后 一个循环 72
16、延伸 8 min。空白对照用 0. 4 l 去离 子水代替 RNA 样品进行同条件的 RT-PCR。PCR 产物于 2%琼脂糖凝胶电泳， 溴化乙锭染色， 紫外灯 下观察并拍照。以 Bandscan 程序对图片行总灰度 扫描， COLL-与对应的 -actin 的电泳带总灰度的 比值为半定量结果 （相对值） 。为验证 COLL-的 RT-PCR 产物的正确性， 随机选取 RT-PCR 产物一份 送上海生物工程公司进行测序。 1. 3 统计学处理 计量资料以-x s 表示。SPSS 11. 0 软件行方差分析 （ANOVA） ， 先用 Levenes test 对数据进行方差齐性检验， 组间比较用
17、 Bonferroni （方差齐时） 和 Games-Howell （方差不齐时） 。 2 结果 2. 1 大黄素对成骨细胞细胞周期的影响 见 Fig 1。结果显示各组 （G2+ S） % 所占比例分别为： 对照 组 19. 1%、 大黄素 2. 5 10 -6 molL -1组 19. 5%、 大黄素 1 10 -6 molL -1 组 21. 2%、 大黄素 5 10 -7 molL -1组 20. 9%、 大黄素 2. 5 10-7 mol L -1组 20. 1%。表明 4 个浓度的大黄素组处于增殖 相的细胞比例与对照组没有差别。 2. 2 大黄素对大鼠成骨细胞细胞上清液和细胞裂 解液
18、骨钙素含量的影响 见 Tab 2。 结果显示大黄素可刺激成骨细胞分泌骨钙素。 1 10 -7 1 10 -6 molL -1和 1 10-5 molL -1浓 度组增加细胞上清液骨钙素含量。其中大黄素 5 10 -7molL-1浓度组细胞上清液骨钙素含量上升最 明显， 与 2. 5 10 -6 molL -1、 5 10-6 molL -1浓 度组相比， 差异有统计学意义 （P 0. 01） 。 大黄素 4741中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） Tab 2 Effects of emodin on the os
19、teocalcin （OCN） activities （!gL -1）in neonatal rat osteoblast （- x s， n =5） GroupSupernatant OCNIntracellular OCN Control0.636 0.1250.242 0.056 PGE21 10 -7 molL -1 0.624 0.0460.233 0.044# emodin 1 10 -5 molL -1 0.877 0.117*0.449 0.076*# emodin 5 10 -6molL-1 0.787 0.0790.607 0.065*# emodin 2. 5 10 -6
20、molL-1 0.715 0.5260.516 0.079*# emodin 1 10 -6molL-1 0.947 0.183*0.464 0.091*# emodin 5 10 -7molL-1 1.080 0.052*0.435 0.069*# emodin 2. 5 10 -7molL-1 0.868 0.027*0.785 0.083* emodin 1 10 -7molL-1 0.877 0.113*0.665 0.083* *P 0. 05，*P 0. 01 vs control；P 0. 05，P 0. 01 vs the Emodin 5 10 -7molL-1 group；
21、 #P 0. 05，#P 0. 01 vs the Emodin 2. 5 10 -7 molL -1 group Fig 1 Effect of emodin with different dose on cell cycle progression in osteoblast A： The negative control group； B： Treated with emodin 2. 5 10 -6 molL -1； C： Treated with emodin 1 10-6 molL -1；D： Treated with emodin 5 10 -7 molL -1；E：Treate
22、d with emodin 2. 5 10-7 mol L -1 从 1 10 -7 1 10 -5 molL -1浓度均可使细胞裂 解液骨钙素含量升高， 其中 2. 5 10 -7 molL -1浓 度组细胞裂解液骨钙素含量上升最明显， 与 5 10 -7 molL -1 1 10 -5 molL -1浓度组相比， 差 异有统计学意义。前列腺素 E2对细胞上清液和细 胞裂解液的骨钙素含量没有影响。 2. 3 大黄素对大鼠成骨细胞矿化结节形成能力的 影响 矿化结节的镜下观察见 Fig 2 和 Fig 3， 大黄 素对新生大鼠成骨细胞体外矿化能力的影响见 Tab 3。 Fig 2 Day 60
23、（magnification 10 x10） Fig 3 Bone nodule alizarin red staining （magnification 10 20） Tab 3 Effects of emodin on capacity of mineralization in neonatal rat osteoblast （-x s， n =4） Group Mineralized node number Mineralized node area/ mm2 Control21. 00 2. 947. 48 1. 13 PGE2 1 10 -7 molL -1 23. 25 4. 65
24、8. 27 1. 54 emodin 2. 5 10 -6 molL -1 17. 00 3. 166. 16 1. 04 emodin 1 10 -6 molL -1 24. 25 2. 228. 63 0. 85 emodin 5 10 -7molL-1 21. 50 4. 517. 63 1. 55 由 Fig 2、 3 的结果可见， 培养 60 d 时显微镜下 见不透光矿化结节， 用茜素红染色可见结节呈红色， 为骨结节。由 Tab 3 的结果可见， 5 10 -7 molL -1 2. 5 10 -6 molL -1 浓度范围的大黄素和 1 10 -7 molL -1前列腺素 E 2
25、对细胞矿化结节形成能 力没有影响。 2. 4 大黄素对大鼠成骨细胞 COLL-“基因表达水 平的影响 见 Fig 4 6。由 Fig 4、 5 的结果可见， 1 10 -7 molL -1前列腺素 E 2 和 2. 5 10 -7 mol L -1 和5 10 -7molL-1浓度的大黄素可促进成骨 Fig 4 RT-PCR analyses for COLL-“ mRNA expression from osteoblast detected by agrose electrophorsis Note： The first line -actin， the second line COLL-
26、. From the left row to the right row one by one （18） ： 1： bank group； 2： negative con- trol； 3： PGE210 -7 molL -1； 4： emodin 2. 5 10-7 molL -1； 5： emo- din 1 10 -6 molL -1； 6： emodin 5 10-7 molL -1； 7：emodin 2. 5 10 -6 mol L -1；8：Marker. The rows of marker from upside to bot- tom are distinguished f
27、or 1 000 bp to 100 bp. The bright degree of 500 bp is double 5741中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） Fig 5 Grey scale ratio of RT-PCR products of COLL-! mRNA to that of “-actin mRNA 1：Control group；2：PGE21 10 -7 molL -1 group；3： Emodin 2. 5 10 -7 molL -1 group；4： Emodin 1 10 -
28、6 molL -1 group；5： Emodin 5 10 -7 molL -1 group；6：Emodin 2. 5 10 -6 molL -1 group 细胞表达 COLL-。大黄素在 1 10 -6 molL -1和 2. 5 10 -6 mol L -1 浓度时抑制成骨细胞表达 COLL-。Fig 6 结果可见， 细胞 COLL-RT-PCR 产 物正向测序结果和大鼠基因库中 COLL-cDNA 链 基本一致， 说明本文中 RT-PCR 产物确为大鼠 COLL-的 cDNA。 3 讨论 3. 1 大黄素对成骨细胞增殖的影响 细胞增殖是 通过细胞周期实现的。本实验结果提示大黄素不能
29、 促进成骨细胞的增殖。有研究显示大黄素对细胞增 殖的影响与其浓度大小和细胞的种类有关， 如低浓 度时可促进 3T3-L1 前脂肪细胞的增殖， 高浓度时则 转为剂量依赖性抑制作用 4。故比本实验所用剂 量更低浓度的大黄素能否促进成骨细胞的增殖还有 待进一步的研究。型胶原蛋白是构成骨骼有机基 质的主要成分， 占骨有机基质 90% 以上， 型胶原 在成骨细胞增殖早期已经开始表达， 并随着基质成 熟而逐渐增加， 其表达与骨形成活性密切相关。在 矿化期大量形成的型胶原可作为羟基磷灰石结晶 的异质晶核， 在生物矿化中起一定作用， 从而维持骨 组织的完整和强度。本实验提示阳性药物前列腺素 E2能明显促进型胶
30、原基因表达； 大黄素对型胶 原基因表达的影响与药物的浓度有关， 低浓度时促 进基因的表达， 高浓度时则抑制基因的表达。大量 研究表明前列腺素 E2对胶原合成有促进作用 7 9， 本实验也证实了这点， 同时提示大黄素对型胶原 基因表达也有促进作用， 但比前列腺素 E2弱。大黄 素的作用可能与 IL-1 的分泌有关， 我们知道小剂量 IL-1 可促进骨 DNA、 胶原和非胶原蛋白的合成， 而 大剂量时则起抑制作用。而有研究显示大黄素对 IL-1 的分泌具有双重调节作用， 能激活单核吞噬细 胞分泌 IL-1， 同时能抑制由内毒素诱导的 IL-1 的分 泌 10。大黄素对成骨细胞胶原合成的影响是否与
31、IL-1 的分泌有关还有待进一步的探讨。 3. 2 大黄素对成骨细胞分化的作用 本实验结果 显示大黄素可刺激成骨细胞分泌骨钙素。骨钙素 （osteocalcin， OCN）亦称为骨 -羧基谷氨酸蛋白 （ Bone-carboxyglumaticAcid-containingProtein， BGP） ， 是由成骨细胞和成牙骨质细胞特异合成和分 泌的一种非胶原蛋白， 是构成骨基质的成分之一， 是 骨基质中含量最多的非胶原蛋白。骨钙素 mRNA 的转录和蛋白合成是成骨细胞进入矿化期的主要指 征之一， 是成骨细胞成熟的标志。其主要生理功能 是维持骨的正常矿化速率， 抑制异常的羟磷灰石结 晶的形成，
32、抑制生长软骨矿化的速度。大黄素增加 骨钙素的含量提示其在成骨细胞生长的矿化期可能 有促进作用， 可进一步促进成骨细胞成熟， 增加成骨 细胞分泌骨基质。 大黄素和前列腺素 E2并不能增加骨结节的数 目和面积。矿化结节的形成能力是反映成骨细胞骨 形成过程晚期的指标。骨基质矿化的过程是成骨细 胞先合成和分泌骨的有机质， 主要为骨的型胶原， 胶原纤维再形成框架区间， 为骨矿化提供结构基础。 前面的结果显示大黄素能促进胶原的合成， 增加骨 基质的分泌， 但可能矿物质的沉积受到影响， 细胞分 泌的胶原纤维没有亲和钙盐， 最后没有促进成骨细 胞矿化成骨。 综上所述： 大黄素可能是一种对成骨细胞有促 进作用的
33、药物， 能增加胶原的合成和使骨钙素的分 泌增多， 以低浓度时效果明显。 下一步需继续研究 Fig 6 Forward direction analysis of DNA sequence of osteoblast COLL-! RT-PCR products 6741中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12） 大黄素抗骨质疏松的作用机制以及在整体动物实验 中对骨质疏松模型动物的防治效果， 进一步评价大 黄素对骨质疏松的防治作用。 参考文献： 1 Matsuda H，Shimoda H，Morikawa T，Yoshik
34、awa M. Phytoestro- gen from the roots of polygonum cuspidatum （Polygonaceae） ： Struc- ture-requirement of hydroxyan- thraquinones for estro genic activity J . Bioorg Med Chem Lett， 2001， 11 （14） ： 1839 -42. 2 Usui T，Ikeda Y，Tagami T et al. The phytochemical lindleyin， islolated from Rhei rhizoma，med
35、iates hormonal effects through es- trogen receptors J . J Endocrinol， 2002， 175 （2） ： 289 -96. 3 Huang SS，Yeh SF，Hong CY. Effect of anthraquinone derivatives on lipid peroxidation in rat heart mitochondria：structure-activity relationship J . J Nat Prod， 1995， 58 （9） ： 1365 -71. 4 Zhang Cb，Teng L，Shi
36、 Y et al. Effect of emodin on proliferation and differentiation of 3T3 L1 preadipocyte and FAS activity J . Chinese Medical Journal， 2002， 115 （7） ： 1035 -8. 5 刘钰瑜， 崔燎， 吴 铁 et al. 大黄素对体外培养新生大鼠颅骨 成骨细胞的影响 J . 中国药理学通报， 2005， 21 （2） ： 235 - 40. 6 Weiss DJ. Application of flow cytometric techniques to ve
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40、h and Development of Natural Drugs， Guangdong Medical College， Zhanjian 524023， China； 3. Dept of Respiratory Medicine， the Affiliated Hospital of Guangdong Medical College，Zhanjiang 524001， China） Abstract： Aim To investigate the effects of emodin on the proliferation and differentiation of rat ost
41、eoblast in vitro. Methods To assess the effect of emodin on the osteoblasts，we isolated osteoblasts from rat calvari- a. The osteocalcin secretion and mineralization of oste- oblast were measured using radioimmunoassay and aliz- arin red stain respectively. Cell cycle was analyzed u- sing flow cytom
42、etry and the mRNA expression of Type Collagen （COLL-I）in osteoblast were detected u- sing reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） . Results Emodin enhanced supernatant osteocalcin and intracellular osteocalcin of osteoblast. Emodin up-regulated COLL-mRNA expression in os- teoblast a
43、t concentrations of 2. 5 10 -7 molL -1 and 5 10 -7 molL -1. However，emodin down-regulated COLL-mRNA expression in osteoblast at high con- centrations of emodin. Emodin had no significant effect on cell cycle at concentrations from 2. 5 10 -7 mol L -1 to 2. 5 10 -6 molL -1 and had no significant effe
44、ct on mineralization at concentrations from 5 10 -7 molL -1 to 2. 5 10 -6 molL -1. Conclusion Emodin can stimulate osteocalcin secretion and up-reg- ulate COLL-mRNA expression of osteoblast in vitro. Key words： emodin；osteoblast；cell cycle；collagen； osteocalcin；mineralization；osteoporosis 错过邮局征订者可直接汇款到本刊编辑部订购， 联系人： 吴慧、 武明静， 地址： 合肥市安徽 医科大学校内 中国药理学通报 编辑部， 邮编： 230032， 联系电话： 0551-5161111， E-mail： wuh666126. com 7741中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2005 Dec； 21 （12）