急性碘过量时FRTL细胞钠碘转运体表达的变化.pdf

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1、中 华内 分泌代谢杂志2 0 0 6 年8 月第2 2 卷第4 期 C h i n J E n d o c r i n o l M e t a b , A u g u s t 2 0 0 6 , V o l 2 2 , N o . 4 .基 础 研 究 . 急性碘过量时F R T L 细胞钠碘转运体表达的变化 聂秀玲孙云李兰英陈祖培 提要】 F R T L 细胞分别在含有 1 0 - “ 一 1 0 - m o l/ L 碘化钾的培养基中培养2 4 , 4 8 和7 2 h ， 采用R T - P C R 和W e s t e rn印 迹， 检测钠碘转运体( N I S ) m R N A 和

2、蛋白 水平的 变化。 F R T L 细 胞在1 0 - 6 一 1 0 - m o l / L 高 碘培养基中 培 养2 4 , 4 8 I t , N I S m R N A 水平与对照组相比， 差异无统计学意 义。而F R T L 细 胞在1 0 - 6 一 1 0 - 1 m o l/ L 高碘培养基中培养4 8 , 7 2 h , N I S 蛋白 呈逐渐下降趋势， 碘浓度越高， N I S 蛋白 下降越明显。本研究显 示急性碘过量不影响N I S m R N A的表达， 但可下调N I S 蛋白， 碘过量通过转录后水平调节N I S 的基因 表达。 【 关键词】 F R T L 细

3、胞; 碘过量: 钠碘转运体 C h a n g e s o f s o d i u m i o d i d e s y m p o r t e r e x p re s s i o n i n F R T L c e l l s d u r i n g a c u t e i o d i n e e x c e s s N I E X i u - l i n g , S U N Y u n , L I I a n - y i n g , C H E N Z u - p e i . I n s t i t u t e o f E n d o c r i n o l o g y , T i a n

4、 j i n M e d i c a l U n i v e r s i t y , T i a n j i n 3 0 0 0 7 0 E m a i l : a u g u s t n i e S u m m a r y j e y o u . c o 爪 F R T L c e ll s w e re i n c u b a t e d i n t h e c u l t u r e m e d i u m c o n t a i n i n g 1 0 - 6 - 1 0 - m o l/ L K I f o r 2 4 ， 4 8 a n d 7 2 h , a n d t h e

5、l e v e l s o f s o d i u m i o d i d e s y m p o rt e r ( N I S ) m R N A a n d p r o t e i n w e re m e a s u re d u s i n g R T - P C R a n d We s t e rn b l o t . T h e l e v e l s o f N I S mR N A i n F R T L c e l l s i n c u b a t e d w i t h d i ff e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f i

6、 o d i d e f o r 2 4 a n d 4 8 h s h o w e d n o s ig n i f i c a n t d i ff e re n c e a s c o m p a r e d w it h t h e c o n t r o l g r o u p , h o w e v e r , N I S p r o t e i n w a s re d u c e d g r a d u a l l y i n F R T L c e ll s i n c u b a t e d w i t h d i ff e r e n t c o n c e n t r

7、a t i o n s o f i o d i d e f o r 4 8 a n d 7 2 h a s c o m p a re d w i t h t h a t i n c o n t r o l g ro u p . T h e h i g h e r t h e i o d i d e c o n c e n t r a t i o n , t h e l o w e r t h e l e v e l s o f N I S p r o t e i n . T h e r e s u l t s s h o w t h a t a c u t e i o d i n e e x

8、c e s s d o e s n o t a f f e c t t h e e x p r e s s i o n o f N I S m R N A , b u t d o w n - r e g u l a t e s N I S p r o t e i n e x p re s s i o n . I o d i n e e x c e s s m a y r e g u l a t e t h e e x p r e s s i o n o f N I S t h r o u g h p o s t - t r a n s c r i p t i o n . ( K e y w o

9、 r d s F R T L c e l l s ; I o d i n e e x c e s s ; S o d i u m i o d i d e s y m p o rt e r ( C h i n J E n d o c r i n o l M e t a b , 2 0 0 6 , 2 2 : 3 8 6 - 3 8 7 ) 碘不仅是合成甲状腺激素的主要底物， 也直接影响甲状腺 的功能和甲状腺细胞的增殖。急性碘过量可损害碘的有机化 ( W o l f f C h a i k 效 应) 。 然 而由 于 碘的 转 运系 统被抑制， 参与抑 制作用的碘复合物的减少， 甲状腺从W o l

10、 ff - C h a i k o ff 效应中脱逸 出来， 这种脱逸可防止正常人或动物甲 状腺摄人过量碘时发生 甲 减。 E n g 等 认 为 急性W o l ff - C h a i k o ff 效 应后的 脱逸现 象与 甲 状腺钠碘转运体( N I S ) tn R N A和蛋白表达下降有关。D a l 等2 于1 9 %年克隆 纯化了N I S c D N A ， 并确定为甲 状腺细胞固 有膜蛋白， 由1 2 个跨膜区段组成。F R T L 细胞是T S H依赖性 F i s h e : 大鼠甲 状腺细胞系， 可用于体外研究甲状腺细胞碘转运。 目 前， 关于碘过量对N I S m

11、R N A 及蛋白 表达的影响尚 有不同的 看法和实验 结果 3 .4 ， 本实验以F R T L 细胞研究碘过量对体外 培养的甲状腺细胞的N I S m R N A和蛋白的影响。 一、 材料与方法 1 . F R T L 细胞的培养: F R T L 细胞购于A C TT， 在C o o n s F 1 2 培 养 基中， 加 人5 %小牛 血清、 1 0 ji g / M l 胰岛素、 5 岁 m l 转铁 蛋白、 5 V g / m l 氢化考的松、1 m U / m l T S H , 0 . 2 5 %青霉素和 0 . 2 5 %链霉素， 细胞置于3 7 T , 5 % C O Z

12、和9 5 %空气的C O : 培养 箱中， 3 一 4 d 换液一次， 7 d 传代一次。 2 . N I S m R N A的R T - P C R : 待细胞长至1 . 5 x 1 0 6 时向培养基 基金项目: 国 家自 然科学基金重点资助项目( 3 0 2 3 0 3 3 0 ) 作者 单位: 3 0 0 0 7 0 天津医 科大学内 分泌研究所 E m a i l : a u g u s t n i e e y o u . c o m 中 加人不同浓度的碘化钾， 使碘离子的终浓度分别为1 0 - 6 , 1 0 - 5 , 1 0 - 4 , 1 0 一 m o l/ L 。 继续培

13、养2 4 , 4 8 h ， 收 集细胞， 采 用R T - P C R 方法， 提取F R T L 细胞总R N A ， 逆转录合成c D N A 第一链， 加N I S 及p - a c tin P C R 引 物 ( 引 物 设 计 参 照 文 献 ) ， 在T a q 酶 作用下， 进行P C R , 1 0闪的产物进行琼脂糖凝胶电泳， 紫外透 射仪观察并摄取图像， 应用M I A S - 2 0 0 0 图像分析系统进行灰度 测量， 基因表达水平用N I S / (3 - a c t i n 灰度比 表示。N I S 上游引 物: 5 - A A G TTC C T G T G G

14、A T G T G C G - 3 ， 下游引物: 5 - T C A C A C C G - T A C A T G G A G A G C - 3 ， 退火温度6 1 O C ， 扩增片段5 2 9 b p , (3 - a c t i n 上游引物: 5 - C T A T C G G C A A T G A G C G G TTC - 3 ， 下游引物5 - C T - T A T G A G TTG G G G G T G G C T - 3 ， 退火温度6 1 9 0 ， 扩增片段7 6 2 b p o 3 . N I S 蛋白的W e s t e r n 印迹分析: F R T

15、L 细胞转移到6 孔板 培 养7 d 至8 0 %一 8 5 %的融合状态， 加人不同 浓度的 碘化钾， 使 碘 离 子的 终浓 度 分别为1 0 - 6 , 1 0 一 ， , 1 0 一 , 1 0 一 ， m o l/ L 。 继 续 培养4 8 , 7 2 h 后， 用细胞裂解液裂解细胞， 提取总蛋白， 进行 1 0 % S D S 聚丙烯酞胺凝胶电 泳， 每 泳道上样量为总蛋白4 0 ji g , 电 泳结束后， 转到硝酸纤维膜上， 加人一抗( 兔抗大鼠N I S 多克 隆抗体I g G 1 ; 5 0 0 , S a n A n t o n i o ) ， 室温孵育1 . 5 h

16、, 1 x T B S T 洗两 次， 加二抗溶液( 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔I g G 1 ; 5 0 0 , T B D ) ， 室温孵育1 h , 1 x T B S T 在室温摇洗膜3 次， 二氨基联苯 胺( D A B ) 显色。 应用M I A S - 2 0 0 0 图像分析系统对特异性条带 进行灰度测量。 4 . 统计学分析: 应用S P S S 统计软件进行数据统计与 分析， 各组结果以 牙 士 : 表示， 组间比 较采用方差分析进一步多重比较 万方数据 些幽l 丛 “ I 叠J 查 2 0 0 6 年多 月 第2 2 卷 第4 期 C h in J E n d o c r

17、i n o l M e ta b 采用S t u d e n t - N e w m a n - K e u ls 分析。 二、 结果 1 . 不同 碘浓度下F R T L 细胞N I S m R N A表达水平( 表 1 ) : F R T L 细胞在含有不同浓度碘培养基中培养2 4 , 4 8 h , N I S m R N A表达水平与对照组比 较， 差异无统计学意义( P 0 . 0 5 ) 0 2 . 不同 浓度的 碘对F R T L 细胞 N I S 蛋白的影响( 表2 ) : 高 浓度的碘明 显抑制F R T L 细胞N I S 蛋白的含量, F R T L 细胞在含 有不同浓度

18、碘的培养基中 孵育4 8 h , N I S 蛋白水平呈下降趋势， 且呈剂量依赖关系， 孵育7 2 h ， 下降更为明显。 表1 F R T L 细胞培养不同时间钠碘转运体m R N A水平的变化 ( x士 ) A u g u s t 2 0 0 6 , V o l 2 2 , N o . 4 组别样本数2 4 h 4 8 h 2 . 1 2士0 . 3 1 2 . 2 5土0 . 4 3 2 . 2 5士 0 . 3 6 2 . 2 0 t 0 . 1 6 2 . 2 3士0 . 0 7 1 . 0 7土0 . 0 4 1 . 0 4士0 . 1 4 1 . 0 7土0 . 0 8 1 .

19、1 3士0 . 1 7 1 . 1 8土0 . 1 1 沼马44)侍月， 对照组 1 0 - 6 m o l / L K I 1 0 - 5 m o l / L K I 1 0 一 4 m o l / L K I 1 0 - 3 m o l / L K I 注: K I 碘化钾 T S H可促进飞蛋白的合成及水解， 而过量碘可抑制T S H的这 种 促进作用。虽然碘可以抑制T S H刺激总R N A含量的增加， 但N o rt h e rn分析未发现碘可抑制T S H刺激的介m R N A转录的 增加， 他们认为， 碘过量对F R T L - 5 细胞T S H刺激的飞的合成 有 抑 制 作

20、用。 E n g 等4 l 研究 亦发现 过量 碘 对N I S 的m R N A 的 表达无明显的影响， 而通过W e s t e rn印 迹方法， 证实N I S 蛋白含 量下降， 及蛋白的转换率加快。 这些结果提示， 碘过量对F R T L 细胞N I S 基因的调节可能主要通过转录后调节而起作用。 本组观察到， F R T L 细胞分别在不同浓度高碘培养基中孵 育4 8 , 7 2 h 后， N I S 蛋白含量呈明显的下降趋势， 且有剂量依赖 性， 培 养 基中 的 碘 浓度 越高， N I S 量 越 少。 E n g 等 4 l 研 究 发 现， F R T L 细胞在1 0 一

21、 m o l/ L 碘培养基中孵育， N I S 明显下降， 2 4 h 下降5 0 %, 4 8 h 下降7 0 %， 进一步用P u l s e - c h a s e 实验证实， 高 碘不影响N I S 新生蛋白的合成， 但N I S 蛋白 转换率加快。有碘 时比 无碘时蛋白降解加速2 7 %。 碘诱导的N I S 蛋白 水平下降 与G r o ll m a n 等6 l 报 道的 时间 依 赖性 碘 摄取 率 下降 相 一 致。 因 此， 可以 推测在F R T L 细胞中， 碘所致的N I S 蛋白 水平下降可能 是转录后水平调节， 不同于体内 实验的转录水平调节。 表2 F R T

22、 L细胞培养不同时间钠碘转运体蛋白 水平的变化 ( x1 s ) 参考文献 组别样本数4 8 h 7 2 h 对照组 1 0 - 6 m o l / L K I 1 0 - 5 m o / L K I 1 0 一 4 m o l / L K I 1 0 - 3 m o l / L K I 1 4 3 . 3 2士1 . 8 4 1 4 0 . 9 6 t 0 . 5 3 1 3 7 . 5 1 12 . 6 8 1 3 5 . 0 6士5 . 6 9 1 3 0 . 6 8土5 . 6 9 1 4 4 . 7 5 t 4 . 3 6 1 4 2 . 8 7土 4 . 9 6 1 3 7 . 6

23、 4 11 . 7 6 1 3 2 . 2 2士 0 . 5 0 1 2 9 . 3 6 11 . 5 2 注: 略 语同 表1 ; 与 对 照组比 较， P 0 . 0 1 三、 讨论 T S H和碘是影响体外培养 F R T L 细胞功能的主要因素。 T S H可促进此细 胞系对碘的摄取和转运 。碘过量可以抑制 F R T L 一细胞的碘摄人、 毛的合成以及N a + 依赖性的氨基酸的 积聚， 且这些抑制作用呈剂量依赖性 6 1 o B e c k s 等 7 1 用羊甲 状 腺进行原代培养， 发现1 0 - 5 m o V L 或更高浓度的碘可降低碘的 转运， 这种抑制作用与碘浓度亦呈剂

24、量依赖性关系。尽管细 胞/ 培养基中的碘比 值下降， 但细胞内的碘浓度继续升高， 1 0 - 4 m o l/ L 或更高浓度的碘可抑制碘化甲 腺原氨酸的合成与甲 状腺 激素的分泌。国内 有学者对不同浓度的碘对体外培养人甲状 腺细胞合成D N A , 蛋白质和甲状腺激素分泌的影响进行了研 究， 他们发现D N A和蛋白 质合成的最佳碘浓度分别为4 x 1 0 - 6 m o l/ L 和1 x 1 0 一 ， m o l/ L ; T 3 、 甲 状 腺 球 蛋白 ( 飞) 、 毛 分 泌 的 最 适 碘浓度分别为7 x 1 0 - 6 , 7 X 1 0 - 6 9 x 1 0 - 6 m

25、o l/ L ， 超过或低于这 个 浓 度 都会影响甲 状腺细 胞的 生长、 增殖和分泌 8 1 o U y tt e r - s p r o t 等 9 1 发现中 等剂量 碘可抑制甲 状腺功能低下的狗甲 状腺 过氧化物酶( T P O ) , N I S m R N A的表达， 而对T S H受体、 T g m R - N A的表达无明 显的影响。 本 结果显示， F R T L 细胞分别在含有1 0 - 6 一 1 0 一 ， m o l/ L 不 同高浓度碘的培养基中 孵育2 4 h 和4 8 h , N I S m R N A表达水平 与 对 照 组 相比 ， 差 异 无 统 计 学

26、 意 义。 P re 沙 a s c 。 等 to ) 研 究 发 现， 1 E n g P H, C a r d o n a G R , F a n g S L . E s c a p e fr o m t h e a c u t e W o l f - C h a i k o ff e ff e c t i s a s s o c i a t e d w i t h a d e c re a s e i n t h y ro i d s o d i u m / io d i d e s y m p o rt e r m e s s e n g e r r i b o n u c l e i

27、 c a n d p ro t e i n . E n d o c r i n o l o g y , 1 9 9 9 , 1 4 0 : 3 4 0 4 - 3 4 1 0 . 2 D a l G , L e v y 0 , C a n -a s c o N . C l o n i n g a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h y r o i d io - d i d e t r a n s p o rt e r . N a t u re, 1 9 9 6 , 3 7 9 : 4 5 8 4 6 0 . 3 S p i t z w e g

28、 C , J o b a W, M o m s J C , e t a l . R e g u la t io n o f s o d i u m i o d i d e s y m p o rt e r g e n e e x p re s s i o n i n F R T L - 5 r a t t h y ro i d c e l l s . T h y r o i d , 1 9 9 9 , 9 ; 8 2 1 名 3 0 . 4 E n g P H , C a r d o n a G R , P r e v i t i M C , e t a l . R e g u l a t i

29、 o n o f t h e s o d i u m io - d i d e s y m p o rt e r b y i o d i d e i n F R T L 一c e ll s . E u r J E n d o c r i n o l , 2 0 0 1 ， 1 4 4: 1 3 9 - 1 4 4 . 5 K o g a j T , E n d o T , S a i t o T , e t a l . R e g u l a t i o n 场t h y ro i d - s ti m u l a t i n g h o r - m o n e o f s o d i u m

30、 i o d i d e s y m p o r t e r g e n e e x p r e s s i o n a n d p ro t e i n l e v e l s i n F R T L 一c e ll s . E n d o c r i n o l o g y , 1 9 9 7 , 1 3 8 : 2 2 2 7 - 2 2 3 2 . 6 G ro l l m a n E F , S m o l a r A , O m m a y a A , e t a l . I o d i n e s u p p r e s s i o n o f i o - d i n e u p

31、 t a k e i n F R T L - 5 t h y ro i d c e ll s . E n d o c r i n o l o g y , 1 9 8 6 , 1 1 8 : 2 4 7 7 - 2 4 8 2 . 7 B e c k s G P , E g g o M C , B u r r o w G N . R e g u l a ti o n o f d i ff e re n t i a t e d t h y ro i d f u n c ti o n b y i o d i d e : p r e f e r e n t i a l i n h i b i t o

32、ry e ff e c t o f e x c e s s io d id e o n t h y - r o i d h o r m o n e s e c re ti o n i n s h e e p t h y r o i d c e ll c u l t u re s . E n d o c r in o l o g y , 1 9 8 7 , 1 2 0 : 2 5 6 9 - 2 5 7 5 . 8 王威， 尹桂山， 朱惠民 . 碘对体外培养人甲 状腺细胞合成D N A蛋 白 质 和甲 状 腺 激 素 分 泌的 影 响 . 中 国 地 方 病 杂 志， 1 9 9 9 ,2 :

33、9 7 - 1 0 0 . 9 U y t h e r s p ro t N , P r i g r i m s N , C a r r a s c o N， e t a l . M o d e r a t e d o s e s o f i o d i d e i n v i v o i n h a b it s c e l l p ro l i f e r a t i o n a n d e x p re s s i o n o f t h y ro p e ro x i d a s e a n d N a 十 / I - - s y m p o rt e r m R N A s i n

34、d o g t h y r o i d . M o l c e l l E n d o c r in o l , 1 9 9 7 ， 1 3 1 : 1 9 5 - 2 0 3 . 1 0 P re g l i a s c o L , B o c a n e r a L , K r a w ie e L , e t a l . E ff e c t o f i o d i d e o n t h y ro - g l o b u l i n b i o s y n t h e s i s i n F R T L - 5 c e l l s . T h y ro i d , 1 9 9 6 , 6 : 1 9 - 2 3 . ( 收稿: 2 0 0 5 - 0 6 - 0 7 ) 万方数据