牛乳β酪蛋白检测的间接ELISA方法.pdf

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1、食品安宝- - = 5 楦测 牛乳1 3 一酪蛋白检测的 间接E L I S A 方法 宋宏新。韩燕。孟静 ( 陕西科技大学生命科学与工程学院，西安7 1 0 0 2 1 ) 摘要：将从干酪素中提取的牛B 一酪蛋白对新西兰白兔进行多次皮下免疫注射。采集血清并用硫酸铵 沉淀法进行抗体纯化，以制备兔抗牛B 一酪蛋白的多克隆抗体。最后将纯化的抗体用于间接E L I S A 法 检测牛乳B 一酪蛋白的含量。 关键词：B 一酪蛋白；多克隆抗体；E L I S A 中图分类号：T S2 5 2 7文献标志码：A 文章编号：1 0 0 5 9 9 8 9 ( 2 0 0 8 ) 0 8 0 2 1 3 0

2、3 E s t a b l i s h m e n to fi n d i r e c tE L I S Ao fb o v i n e1 3 一c a s e i n S O N GH o n g - x i n , B A NY a n , M E N GJ i n g ( C o l l e g eo fL i f eS c i e n c ea n dE n g i n e e r i n g ，S h a a n x iU n i v e r s i t yo fS c i e n c ea n dT e c h n o l o g y ， X i a n7 0 11 2 1 1 A

3、 b s t r a c t ：T h ep o l y c l o n a la n t i b o d yw a sp r e p a r e db yi m m u n i z i n gN e wZ e a l a n dr a b b i tw i t hb o v i n e1 3 - c a s e i n w h i c hw a se x t r a c t e df r o mc a s e i n T h ec o l l e c t e ds e r aw a st h e np u r i f i e dt h r o u g hp r e c i p i t a t

4、 i n gu s i n ga m i n e s u l p h a t ei no r d e rt op r e p a r et h ep o l y c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tb o v i n eB - - c a s e i nw h i c hc o u l db eu s e dt od e t e c t i o n o fb o v i n e 阳a s e i na c c o r d i n gt ot h ei n d i r e c tE L I S A K e yw o r d s ：即a s e i n ；

5、p o l y c l o n a la n t i b o d y ；E L I S A 牛乳是一种营养价值很高的食品。近些年来， 随着乳制品的产量逐步上升，乳品掺假现象也时有 发生，威胁消费者健康。2 0 0 4 年我国安徽阜阳假( 毒1 奶粉事件引发了人们对乳制品质量安全的全新认识， 食品不但要无毒无害，更要保障所含的营养品质成 分。因此，建立快速准确的检测方法以确保乳与乳 制品的质量安全。 牛乳蛋白质中大约8 0 是酪蛋白，酪蛋白是由 o t s l 一，a s 2 一，3 - 及K 一酪蛋白组成，其含量比例分别 为3 6 、1 0 、3 4 、1 2 t q 。3 - 酪蛋白在酪蛋白

6、中 比例恒定，结构相对稳定。干酪素中含有足量的1 3 一 酪蛋白，因此，可以从干酪素中获得，通过建立间 接E L I S A ，检测B 一酪蛋白含量，以应用于测定乳品 中B 一酪蛋白含量判断乳品是否掺假。 1 材料与方法 1 1 实验动物 3 只3 月龄体质量2 0 。2 5k g ，雄性健康新西兰 白兔，购自第四军医大学。 1 2 试剂 干酪素：中国医药公司北京公司；牛B 一酪蛋白 标准品：s i g m a ；弗式完全佐剂、弗式不完全佐剂： 北京鼎国生物技术有限责任公司；辣根过氧化物酶 联羊抗兔 g G ：北京拜尔迪生物技术有限公司。 1 3 实验方法 1 3 1 牛B 一酪蛋白抗原的制备

7、与鉴定将干酪素5g 溶于1 0 0m Lp H l 2 0 的3 3m 6 讥的尿素中，调节 p H 4 6 ，3 0 0 0r m i n 离心1 0m i n 得到沉淀和上清液。 收稿日期：2 0 0 7 1 0 - 3 0 基金项目：陕西省教育厅专项科研计划项目( 0 7 J K l 9 0 ) 。 作者简介：宋宏新( 1 9 5 9 _ - ) ，男，教授，主要从事生物化学与分子生物学、食品科学的科研与教学工作。 万方数据 良品安宝与艟潮 向上清液加水使尿素浓度稀释至0 5m o l L ，再一次 离心得到沉淀，后者得到B 一酪蛋白I q 。抗原鉴定采用 S D S P A G E 电

8、泳，分离胶浓度1 0 ，浓缩胶浓度 5 。 1 3 2 兔抗牛B 一酪蛋白多克隆抗体的制备将2m s m L 的牛B 一酪蛋白3m L 与3m L 弗式完全佐剂充分 混匀、乳化。在3 只新西兰白兔背部皮下多点注射。 1 0d 后，相同浓度的B 一酪蛋白与等量弗式不全佐剂 充分乳化后，进行第一次加强免疫，以后间隔7d 再 加强3 次，在加强免疫期间用间接E L I S A 检测抗血 清效价，达到效价要求后对兔进行颈脉放血，分离血 清，存放于一2 0 4 0 冰箱。 采用饱和硫酸铵分级沉淀法纯化血清，依次以 5 0 、4 0 、3 3 的饱和硫酸铵纯化一次P l 。 1 3 3 间接E L I S

9、 A 检测牛乳中B 一酪蛋白的含量f 4 - 6 1 用包被缓冲液将B 一酪蛋白标品或待测样品适当 稀释，在9 6 孑L 酶标板上每孔加入1 0 0I x L 。平板置4 过夜后，用P B S 一吐温( P B S T ) 洗板3 次。每孔加 入1 0 0p , L 质量分数为l 的P B S T 稀释的明胶，3 7 作用1h ，洗板。在每孑L 加纯化后的兔抗牛B 一酪蛋白 多抗，3 7 。C 孵育2h ，洗板。加二抗，每孔1 0 0u J L 体 积比为1 ：1 0 0 0 稀释的酶标羊抗兔I g G ，3 7 孵育lh ， 洗板。加入H R P 的底物缓冲液10 0 “折L ，室温下避光

10、孵育2 0 m i n 后，用浓度为2 - n o l L 的硫酸终止反应，每 孔加入5 0 “L 。酶联检测仪上4 5 0 n m 处读取O D 值。 以上包被抗原和多抗的最佳稀释度均已经过方 阵滴定法确定1 7 1 。 2 结果 2 1 B 一酪蛋白分离与抗体制备结果 由图1 所示，泳道1 和泳道2 分别为标品B 一酪 蛋白以及干酪素中提取的B 一酪蛋白，光密度扫描分 析，用此法能够制得纯度较高的B 一酪蛋白。从S D S P A G E 电泳结果图2 可以看出，硫酸铵初步纯化后的 抗体中已除去绝大部分杂蛋白。 食品科技 I F O s c I * c EA N DT E C H N O

11、L O G Y 注：1 兔抗牛I g G 标品；2 盐析透析后抗体；3 原抗血清。 图2 兔的抗血清和初步纯化后的抗体的 S D S P A G E 电泳结果 蛋白多次注射免疫实验兔后，抗体效价有明显升高， 最后效价达到l ：1 0 2 4 0 。 1 2 0 0 0 1 0 0 0 0 8 0 0 0 萋6 0 0 0 4 0 0 0 2 0 0 0 O 0 1 02 03 04 05 0 天数d 图3 新西兰白兔免疫后抗体效价变化 2 4 抗体特异性测定结果 为了鉴定抗体的特异性，分别用乳清蛋白、d 一 酪蛋白、K 一酪蛋白以及B 一酪蛋白抗原包被酶标板， 采用抗体效价测定的方法，根据反应

12、结果检测各蛋 白是否与所制备的B 一酪蛋白抗体有交叉反应，如图 4 所示。 言 e - o I n S 遥 自 。 抗体的稀释僭数n 图4 抗体与其他相关蛋白的交叉反应( 系列1 为B 一酪蛋 白，2 为d 一酪蛋白，3 为K 一酪蛋白，4 为乳清蛋白1 图4 中横坐标为间接E L I S A 法中抗体的稀释倍 数，初始浓度为1 ：1 0 按2 n 倍比稀释。纵坐标是通过 酶标仪测定的酶标羊抗兔抗体I g G H R P 的底物显色 4 5 0n m 下的吸光值，O D 值反映了待测抗体与固 注：1 标品；B 一酪蛋白2 干酪素中提取的p 一酪蛋白。 相抗原的反应强度大小。从图中可以看出，所制

13、备 图1 从干酪素中分离的1 3 - 酪蛋9 3S D S P A G E 电泳结果 的多克隆抗体与其他蛋白质的亲和力很弱，与B 一酪 2 2 抗体效价测定 蛋白的亲和力较强，具有较强的特异性。 由图3 的结果可以看出，本实验用分离的B 一酪 2 5 标准曲线及精密度、重复性、准确性实验 万方数据 食品科技 i l F O O DS C I N C EA N D 刀目C 删O “培y 将标准B 一酪蛋白稀释成0 - 3 0 0 0n g m L 进行包 被，抗体工作浓度l ：3 2 0 ，测定4 5 0m n 的O D 值。结 果显示，当标准B 一酪蛋白浓度在2 5 2 5 0 0n g m

14、L 时， O D 值与浓度为线性关系。以标准B 一酪蛋白质量浓度 为横坐标，以0 D 。为纵坐标，将这一区域的值取 出绘制标准曲线f 见图5 1 。 尽 e- o 导 一 j 鸯 o o B 一酪蛋白浓度( n g m L ) 图5B 一酪蛋白的标准曲线 按间接E L I S A 操作程序重复检测同浓度梯度B 一 酪蛋白，依间接E L I S A 检测法重复检测，用工作曲 一目品安宝与桓潮 线计算3 - 酪蛋白值，比较验检结果的重复性，测量 结果如表l 所示，可以看出，板内检测的氏值的 变异系数( C V ) 小于5 ，回收率在9 3 5 - 1 2 7 O ， 说明板内检测样品的重复性良好，

15、系统稳定。因此建 立的间接E L I S A 具有良好的重复性。 3 小结 牛乳B 一酪蛋白占酪蛋白中的含量最高，通过建 立E L I S A 可以检测其含量。同时，牛乳8 一酪蛋白作 为抗原有着很高的特异性1 8 1 。而对于这些特定的抗 原，市面上很难买到相应的抗体或者价格昂贵。因 此，实验室建立一套完整的制备多克隆抗体方法非 常必要。目前，随着羊乳市场的扩大以及羊乳价格 高于牛乳，羊乳中掺入牛乳成分的现象也屡有发生( 9 1 。 通过将本试验中获得的兔抗牛B 一酪蛋白抗体进行 特异性免疫吸收后，也可以用于羊乳中牛乳成分 的掺假检测，以对乳品的质量检测标准的制定提供 技术依据。 表1 间接

16、E L I S A 试验的重复性 参考文献： 【l 】张东送，庞国昌，高法国毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含 量测定及掺假检测方面的应用 3 1 - 食品与发酵r - - 业2 0 0 5 3 1 ( 1 ) ：1 3 0 - 1 3 2 【2 】王廷华，李官成，X i n F uZ h o u 抗体理论与技术【M 】北京： 科学出版社，2 0 0 5 ：2 0 3 2 0 5 3 】焦奎，张书圣酶联免疫分析技术及应用 M 】北京：化学工 业出版社2 0 0 4 ：1 0 3 1 0 7 【4 】T E R E S AG A R C H ， R O S A R I OM A R T I N ， E

17、L E N A R O D R I G U E Z ，e ta 1 D e t e c t i o no fB o v i n eM i l ki nO v i n e M i l kb ya l lI n d i r e c tE n z y m e - L i n k e dl m m u n o s o r b e n tA s s a y I J 】JD a i r yS c i ，1 9 9 0 ，7 3 ( 6 ) ：1 4 8 9 - 1 4 9 3 【5 】K A R A S O V A L , R A U C H P ，F U K A L LC o n s t r u c t

18、 i o n o f c o m p e t i t i v ee n z y m ei m m u n o a s s a yf o rd e t e r m i n a t i o no f a l a c t a l b u m i na n d1 3 - 1 a c t o g l o b u l i n so fC O W Sm i l k J C z e c hJ F o o dS c i 1 9 9 9 1 7 ：5 一1 4 【6 】 M I C H A E L AV i T K O V 钆P A V E LR A U C H ，L A D I S L A V F U K A

19、L O p t i m i z a t i o no fi n d i r e c tc o m p e t i t i v eE L I S Ao fa 一 B 一，a n dK - c a s e i n sf o rt h et h e r m a la n dp r o t e o l y t i ct r e a t m e n t o fm i l ka n dm i l kp r o d u c t s J C z e c hJF o o dS c i ，2 0 0 2 ，2 0 ( 2 ) ： 5 3 6 2 【7 】7 卢蓉蓉，孙震，许时婴，等乳铁蛋白的免疫化学分析法一酶 联

20、免疫吸附测定法f J 】食品科学，2 0 0 2 ，2 3 ( 4 ) ：1 0 2 1 0 4 【8 】8 I n e SM L o p e z - C a l l e j a ，I s a b e lG o n z a l e z ，V i o l e t aF a j a r d o ， e t a 1 A p p l i e a t i o no f a l li n d i r e c tE L I S Aa n daP C R t e c h n i q u ef o rd e t e c t i o no fC O W S 7m i l ki ns h e e p ，sa n d

21、g o a t s 7 l l I i l I 【c h e e s e s 阴I n t e r n a t i o n a lD a f f yJ o u r n a l ，2 0 0 7 ，1 7 ( 1 ) ：8 7 - 9 3 【9 】9 I a nPH u r l e y ，R o b e r tCC o l e m a n ，HE l y s eI r e l a n d ，e ta 1 U s eo fs a n d w i c hI g GE L I S Af o rt h ed e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no f a d u l t e r a t i o no fm i l ka n ds o f tc h e e s e 叨 I n t e r n a t i o n a lD a i r yJ o u r n a l , 2 0 0 6 1 6 ：8 0 5 8 1 2 全国中文核心期刊食品行业的优秀伙伴 广告服务热线：0 10 6 7 913 8 9 3 万方数据