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1、研究原著文章编号： 1000-2790 （2006） 13-1230-04 白藜芦醇对豚鼠心室肌细胞 L-型钙通道的影响 易方方， 唐其柱， 冯斯婷， 王 腾 （武汉大学人民医院心血管内科， 湖北 武汉 430060 = ） 收稿日期： 2005-10-31； 接受日期： 2005-12-01 通讯作者： 唐其柱. Tel：（027） 88041911 Ext. 2213 Email： qizhutang yahoo. com. cn 作者简介： 易方方. 硕士生 （导师唐其柱） . Tel： 13476110894 Email： yifangfang yahoo. com. cn Effec
2、ts of resveratrol on L-type calcium current in isolated ventricular myocytes of guinea pig YI Fang-Fang，TANG Qi-Zhu，FENG Si-Ting，WANG Teng Department of Cardiology，Peoples Hospital，Wuhan University， Wuhan 430060，China 【Abstract】AIM：To investigate the effects of resveratrol on the L-type calcium curr
3、ent（ICa-L）in isolated ventricular myocytes of guinea pig. METHODS：Single ventricular cell was obtained fromhealthyguineapigheartusingenzymaticdissociation methods. The whole-cell patch clamp was used to record the ICa-L following the administration of resveratrol at 1， 50， 100 mol/ L. RESULTS： Resve
4、ratrol reduced the ICa-Lin a concentration- dependent manner，but it had no effect on I-V shape of ICa-L. Resveratrol markedly shifted the steady-state activation curve of ICa-Lto the right，and V1/2value increased from（ - 18. 97 4. 08）mV in control to（ -15. 97 4. 13）mV in the presence of resveratrol（
5、n =7，P =0. 02） ，the k value from（3. 64 0. 56） to（3. 82 0. 60） （n = 7， P = 0. 67） . Inactivation curve of ICa-Lwas not affected significantly. The time constant of reacti- vation of ICa-Lwas reduced from（98. 50 9. 00）ms to（54. 53 4. 27）ms（n = 6， P = 0. 000）by resveratrol. CONCLUSION： Resveratrol inhi
6、bited the L-type calcium channel，mainly acting on the activity and recovery processes. 【Keywords】resveratrol； whole-cell patch clamp； calcium current 【摘 要】目的： 研究白藜芦醇对正常豚鼠心室肌细胞 L-型钙 电流 （ICa-L） 的影响. 方法： 采用全细胞膜片钳技术， 记录不同 浓度白藜芦醇作用前后对 ICa-L的影响. 结果： 白藜芦醇呈浓 度依赖性阻断 ICa-L， 但对激活电位、 峰电位、 反转电位均没有 影响； 白藜芦醇使 ICa-
7、L稳态激活曲线右移， V1/2由对照的 （ -18. 97 4. 08）mV 变为 （ -15. 97 4. 13）mV（n =7， P = 0. 02） ， k 由 （3. 64 0. 56） 变为 （3. 82 0. 60） （n = 7， P = 0. 67） ； 对失活曲线无影响， 不改变 ICa-L失活特性； 白藜芦 醇使 ICa-L失活后再恢复时间常数 缩短， 从 （98. 50 9. 00）ms 变为 （54. 53 4. 27）ms （n =6， P =0. 000） . 结论： 白藜芦醇对 ICa-L有阻断作用， 主要作用于钙通道激活和恢复过程. 【关键词】白藜芦醇； 全细胞
8、膜片钳； 钙电流 【中图号】R331. 3 +8 【文献标识码】A 0 引言 白藜芦醇化学名为 3， 5， 4三羟基_反_二苯代 乙烯 （3， 5， 4 trihydroxyrans stilbene） ， 是一种主要存 在于葡萄皮、 花生中的多酚类植物抗毒素. 现认为它 是适量饮用葡萄酒有利于心血管健康的主要作用因 子 1. 大量研究2 -3发现白藜芦醇对心肌缺血 - 再 灌注损伤有保护作用； 对血管有广泛的舒张效应 4； 能抗动脉粥样硬化， 防治冠心病 5. 但其对心肌细胞 离子通道的作用少见报道， 我们采用膜片钳技术研究 白藜芦醇对心室肌细胞 ICa-L的影响. 1 材料和方法 1. 1
9、 材料 健康成年豚鼠31 只 （武汉大学医学院动 物中心） ， 体质量 250 350 g， 雌雄不拘；I 型胶原酶， 蛋白 酶 E，HEPES（ Gibco 公 司） ；CSOH，CSCl， Na2ATP （Sigma 公司） ； 白藜芦醇 （西安赛得高科生物 股份有限公司） ； 其余均为国产分析纯. 无钙台氏液 （mmol/ L） ： NaCl 135， KCl 5. 4， MgCl21， NaH2PO4 0. 33， Glucose 20， HEPES 10， pH 7. 38（NaOH 调节） ； KB 液 （mmol/ L） ：glumatic acid 50， KOH 85， KC
10、l 30， MgSO43， Taurine 20， Glucose 10， HEPES 10， EGTA 0. 5， pH 7. 2 （KOH 调节） ； 电极外液组成 （mmol/ L） ： NaCl 37， Choline Chloride 100， CaCl21. 8， MgCl20. 5， HEPES 10， Glucose 10， CSCl 4. 6， pH 7. 3 （CSOH 调 节） ； 电极内液组成 （mmol/ L） ：CSCl 120，CaCl21. 0， MgCl25，Na2ATP 5， EGTA 11，HEPES 10， Glucose 11， pH 7. 4 （CS
11、OH 调节） . 白藜芦醇在 DMSO 中配成 1. 5 mmol/ L 母液， 每次实验时， 母液溶于电极外液中 配成实验所需终浓度进行灌流， DMSO 终浓度低于 1 mL/ L. 1. 2 方法 1. 2. 1 心室肌细胞的分离 将豚鼠腹腔注射肝素 500 U/ kg， 头部击昏， 迅速开胸取出心脏置于 1000 mL/ L O2饱和的 4 生理盐水中冲洗， 剪开心包， 连 0321 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （13） http： / / journal. fmmu. edu. cn 接于 Langendorff 心脏灌流装置上逆
12、行灌流， 灌流压 维持在 70 mm H2O， 用无钙台氏液灌流 3 5 min， 冲 出心脏内残留血液， 心脏完全停跳后， 改用含 0. 33 mg/ L 型胶原酶， 0. 1 mg/ L 蛋白酶 E 的低钙液 （Ca2 +80 mmol/ L） 灌流 3 5 min， 至心脏膨大松弛流 出液成丝后取下， 除去心房， 在含 BSA 1 g/ L 的 KB 液中剪碎心室肌， 37温孵， 稀释， 倒出上清液，此为 第一份细胞贮存液. 剩余的沉淀部分继续用 KB 液温 孵， 稀释， 倒出上清依次可以得到多份细胞存储液. 灌流液始终给予 1000 mL/ L O2饱和， 循环水浴使灌 流液保温在 3
13、7左右. 1. 2. 2 全细胞记录技术 吸数滴细胞保存液加于 1. 5 mL 灌流槽， 置于倒置显微镜 （Olympus IX70） 载 物台上， 待细胞静置贴壁， 细胞外液灌流清洗细胞， 电 极选用硬质玻璃 （上海神经生理所提供） ， 经微电极 拉制 （Narishige PB-7） 二次拉制而成， 电极充以内液 后阻抗 3. 5 5 M. 选取横纹清晰， 表面无颗粒， 无 收缩的细胞， 采用微电极操纵仪 （Narishige MD320） 移动电极， 当电极尖端与细胞表面形成高阻抗封接后 （ 2 G） ， 补偿电极与细胞膜之间的电容， 进一步给 负压吸破细胞膜， 经电容电流和电极串联补偿
14、即可行 全细胞记录. 所有实验均在室温下进行. 1. 2. 3 试验分组 共分为 4 个浓度组， 分别为对照 组 （n =8） ， 1 mol/ L （n = 9） ， 50 mol/ L （n = 7） ， 100 mol/ L （n = 7） ， 记录药物灌流前后 ICa-L， 50 mol/ L 组还需记录通道激活， 失活和失活后恢复电流. 统计学处理： 数据分析采用 pulse 8. 31 软件对全 细胞记录进行图形与数据转换， 数据以 x s 表示， or- igin 6. 0 软件对数据进行统计学处理， 并进行曲线拟 合. 不同浓度药物作用前后间比较采用 Oneway ANOVA
15、检验及 LSD-t， 50 mol/ L 白藜芦醇作用后通 道动力学改变采用 t 检验， P 0. 05） . 首次射频治疗后 3 mo 未愈再次治疗而愈的 3 例， 3 例无效改为手术治疗. 表 1 射频热凝固治疗功血和宫颈糜烂效果n （%） 诊断n治愈显效有效无效 功血6044 （73. 3） 9 （15. 0 ）4 （6. 7）3 （5. 0） 宫颈糜烂8076 （95. 0）4 （5. 0）0 （0）0 （0） 2 讨论 射频热凝固方法是一种利用高热治疗的新技术， 近 年已用于多种肿瘤的治疗 1 -3， 其治疗原理是： 在 B 超引导 下， 将射频治疗源经过阴道、 宫颈管、 子宫腔等自
16、然腔道， 准确 定点地介入到病变部位， 仪器自动精确地控制其治疗功率、 时 间和温度， 在病变局部组织产生生物热效应 （60 85） ， 使 病变内膜组织细胞直接热凝固死亡或凋亡； 生物热效应使假 包膜下供应病变组织的血管内血栓形成而终止血供， 继而使 病变组织发生缺血、 变性坏死和萎缩； 生物热效应使病变组织 内的雌孕激素受体和神经组织灭活， 阻止病变组织继续生长. 在上述作用下使机体局部病变得以控制， 继而进入组织修复. 射频热凝固微创技术操作简捷， 能有效减少组织创伤并降低 创伤对全身产生的不良影响， 其治疗功血和子宫颈糜烂疗效 显著 3. 【参考文献】 1李丽娜， 张 颖. 介绍一种治
17、疗子宫疾病的新方法自凝刀 微创介入技术 J . 医学信息杂志， 2005， 18 （1） ： 68 -69. 2Miao Y，Ni Y，Bosman H. Radio-frequency ablation for eradication of pulmonary tumor in rabbits J . J Surg Res， 2001， 99 （2） ： 265 - 271. 3邱学华， 赵 巧. 子宫内膜消融术治疗功能失调性子宫出血 34 例 J . 第四军医大学学报， 1999， 20： 863 -866. 4Lee BB. Radio-frequency ablation of uterine leiomyoma：Amew min- imally invasive hysyerecctomy altemative J .Obstet Gynecol， 2002， 99 （4） ： S9 -10. 编辑 潘伯荣 3321 第四军医大学学报 （J Fourth Mil Med Univ） 2006； 27 （13） http： / / journal. fmmu. edu. cn