神经干细胞培养影响因素的研究.pdf

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1、琶亩至匿垫! Q 堡旦筮1 2 鲞筮2 翅鲤旦型堕丛i ! i 垡竖坠珏鲤! 堕墅! ! ! ! 塑! 垡堕! ! ：生：! 垒：塑! ：至：丛! 堡! ，垫! Q 3 1 5 d u et om i t o e h o n d r i a ld y s f u n c t i o n J C e l lB i 0 1 T o x i o n l 1 9 9 9 ，1 5 ( 6 ) ，3 6 7 - 3 7 3 。 7 I J e e l e r e qI A ，F a r r e l lc c 。F i e l dJ ，B e l lD R ，G o n z a l e zg J ，R o

2、 h e m o n C ：C Y P 2 E Ia n dC Y P 4 A 船m i c r o s o m a lc a t a l y s t so fl i p i dp e r o x i d e s i n n u r l n en o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p a f i f i s J 】JC l i nI n v e s t 2 0 0 0A p r ， 1 0 5 ( 8 ) ：1 0 6 7 1 6 7 5 8 C h i t t u r is ，F a r d lG C ：E t i o p a t h o g e n

3、e s i so fn o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p - a f i t i s J S e m i n a r s i nL i v e r D i s e a s e 2 0 0 1 ，2 1 ( 1 ) ，2 7 - 4 1 9 T a n e j aN ，T j a l k e n sR ，P h i i h e aM A ，R e h e m m l l a 九：I r r a d i a t i o no fm i - t e c h e n d r i ai n i t i a t e sa p o p t o s i si nac

4、 e l lf r e es y s t e m 】 ，O n c o g e n e 2 0 0 1J a n1 1 ；2 0 ( 2 ) ：1 6 7 1 7 7 【1 0 C a l d w d lS H ，s 帆r d l wR H 。K h a nE M d f M i t o c h o n d f i a la b n o n n a l i - t i e s i nn o n a l c o h o l i cs t e a t o h e p a t i t i s J JH e p a t o l ，1 9 9 9 ，3 1 ：4 3 0 4 3 4 【1 1 樊丽琳，陈

5、东风肝脏线粒体呼吸功能损伤在大鼠非酒精性脂肪 性肝病中的作用 】重庆医学2 0 0 7 ，3 6 ( 1 5 ) ，1 5 0 3 1 5 0 5 【1 2 B e r n a r dM I G N O T F Ea n dJ e a n I m cV A Y S S I E R E M i t o c h o n d r i aa n d a p o p t o s i s J E u r J B i o e h e m 1 9 9 8 ，2 5 2 。1 一1 5 1 3 】R 0 0 rB G ，G o r e sG J L i v e rc e l ln e c r o s i s ：

6、c e l l u l a rm e c h a n i s m sa n d c l i n i c a li m p l i c a t i o n s J 】G a s t r o e n t e r o l o g y 1 9 9 5 ，J a n ，1 0 8 ( 1 ) ：2 5 2 2 7 5 【1 4 】妇嘲G ，P e t i tP ，Z a m a a m iN ，V a y s s i & eJ L ，M i g n o t t eB T h eb i o - c h e m i s t r yo fp r o g r a m m e dc e l ld e s t h

7、J F A S E BJ 1 9 9 5 ，O c t ，9 ( 1 3 ) ： 1 2 7 7 1 2 8 7 【1 5 】R i c h t e rC ，S c h w e i z e rM ，C o a s a r i z z aA ，F r a n c e e c h ic C o n t r o lo fa p o p 嫡sb y t h ec e l l u l a r A T P l c v d J F E B SL e a 1 9 9 6J a n8 ，3 7 8 ( 2 ) ： 1 0 7 1 l O 1 6 】刃a i v o t o v s k yB ，O n n i u

8、 ss ，B m s t u g u nO T ，D o s k e h n dS O I n j e c t e de y t e c h r o m eei n d u c e sa p o p t o s i s J N a t u r e 1 9 9 8 ，3 9 1 ：4 4 9 - 4 5 0 1 7 G e o r g eEN 。K a a sa n dS t e nO r r e n i u s C a l c i u mS i g n a l i n ga n dC y t o t o x - i e i t y J E v i r a nH e a l t hP e r s

9、 p e c t 1 9 9 9 ，1 0 7 ( s u p p l1 ) ：2 5 - 3 5 1 8 H a l e s t r a pA P ，W o o d f i e l dK Y ，C o n n e mC EO x i d a t i v es t r e s s ，t h i o lm g e n t s ，a n dm e m b r a n ep o t e n t i a lm o d u l a t et h em l t e c h o n d r l a lp e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o nb ya f f e c

10、 t i n gn u e l e o t i d eb i n d i n gt ot h ea d e n i n en u d e o t i d e t r a n s l o e a s e J JB i dC h e m 1 9 9 7F e b7 ，2 7 2 ( 6 ) ：3 3 4 6 - 3 3 5 4 1 9 】H a l e s t r a pA P ，M c S t a yG P 。C l a r k es J T h ep e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e c o m p l e x ：a n o t h

11、 e rv i e w J 】B i o c h i m i e 2 0 0 2F e b M a r ，8 4 ( 2 3 ) ： 1 5 3 一1 6 6 2 0 】C r o m p t o nM ，V i i is ，W a r dJ M C y c l o p h i l i n Db i n d ss t r o n g l yt oc o r n - p l e x c eo ft h ev o l t a g e - d e p e n d e n ta n i o nc h a n n e la n dt h ea d e n i n en u c l e o t i d e

12、u a n s l o c a s et of o r mt h ep e r m e a b i l i t yt r a n s i t i o np o r e J E u rJ B i o c h e m 1 9 9 8D e cl ，2 5 8 ( 2 ) ：7 2 9 7 3 5 2 l 】N i e h o l s o nD W A p o p t o o i s B a i t i n gd e a t hi n h i b i t o r s J N a t u r e 2 0 0 1 M a r1 ，4 1 0 ( 6 8 2 4 ) ：3 3 - 3 4 2 2 】沈方沈

13、倩。夏强细胞凋亡与线粒体通透性转变孔的研 究进展 J 浙江大学学报( 医学版) ，2 0 0 5 ，3 4 ( 2 ) ：1 9 1 1 9 6 2 3 】W a n gC ，N e f f “ D A 。K r o l i k o w s k iJ G ，W e i h r a u c hD ，B i e n e n g r a e b e rM 。 W a r l t i e rI X ；K e r s t e nJ R ，P a g e lP S T h ei n f l u e n c eo fB c e l ll y m p h o - l n a2p r o t d n ，a l

14、la n t i a p o p t o t i er e g u l a t o ro fm i t o c h e n d r i a lp e r m e a b i l i t y t r a n s i t i o n i s d l u r a n e i n d u c e da n di s e h e m i ep o s t c o n d i t i o n i n gi n r a b b i t s t J A n e s t hA n a l g 2 0 0 6M a y ，】0 2 ( 5 ) ：1 3 5 5 1 3 6 0 。 2 4 T r o s tK ，

15、k “I g t 嘲J J T h em i t o c h o n d r i a lp e r m e a b i l i t yt l a n s i t i o n ：a n e wp a t h o p h y s i o l o g i e a lm e c h a n i s mf o rR e y e bs y n d r o m ea n dt o x i el i v e r i n j u r y 1 JP h a r m a e o l E x pT h e r 1 9 9 6S e p 2 7 8 ( 3 ) ：1 0 0 0 1 0 0 5 ( 收穗日期：2 0 0

16、 9 一1 2 1 惨回日期：2 0 0 9 1 2 1 6 ) 神经干细胞培养影响因素的研究 李燕( 综述) ，郭勇，徐富翠( 审校) 【摘要神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞、少突胶质和对痰病损伤具有反应性修复潜能的细胞。神经干细 胞的发现对神经系统的难治性疾病的治疗带来了希望。然而，内源性神经干细胞的数量在机体内特别是在成体内存在极少，使其 在反应性疾病损伤中的修复作用体现非常有限，因此，体外有效培养和扩增神经干细胞仍然是目前科研工作者荻取神经干细胞的 主要手段。本文就影响神经干细胞培养的主要影响因素如取材、分离培养、接种密度及传代纯化方法等方面进行分析，为神经干 细胞的体外培

17、养提供参考。 关键词】神经干细胞；分离；细胞培养 【中图分类号 R 一3 3 1 【文章编号】1 6 7 2 7 1 9 3 ( 2 0 1 0 ) 0 2 - 0 3 1 5 - 0 3 长期以来人们一直认为高等动物的的神经细胞是终身存 活的，成熟的神经元是终末细胞，如果神经元细胞受损伤死亡， 只有由神经胶质来填充，其功能将永久丧失。然而神经干细胞 的发现打破了这种传统的认识，目前研究发现，内源性神经干 细胞具有对疾病损伤的反应性，在疾病损伤时能向损伤部位迁 移、芳增殖分化为有功能的神经元，这使德医学者对中枢神经 系统损伤和退行性疾病的治疗看到了新的希望。由于内源性 【文献标志码 A D o

18、 i ：1 0 3 9 6 9 j i s s n 1 6 7 2 7 1 9 3 2 0 1 0 0 2 0 7 2 神经干细胞对疾病损伤修复的能力有限，因此神经干细胞的移 植治疗仍然是目前神经系统疾病治疗中的主要细胞来源。成 功培养神经干细胞是该研究和应用的基础和前提，本文就当前 国内外的神经干细胞体外培养方法及影响因素做如下综述。 l 神经干细胞的生物学特征 神经干细胞( N e u r a ls t e mc e l l s ，N S C s ) 属于多能干细胞。 作者单位：6 4 6 0 0 0 四川。泸州医学院组织胚胎学教研室 李燕( 硕士研究生) 、郭勇、徐富翠 万方数据 3 1

19、 6 1 9 8 9 年A n d e r s o n 等通过实验首先证实它的存在，并提出了神 经干细胞概念1 。近年来已经从胚胎及成年动物的中枢神经 系统脑室下区、齿状回的颗粒下区、纹状体和脊髓的室管膜下 区等部位分离、纯化出神经干细胞。神经干细胞具有自我更新 的能力和多分化的潜能，可以分化成神经元、星形胶质细胞和 少突胶质细胞促进修复损伤的神经，并且能够利用其迁徙特性 在脑实质内弥散较远的距离，在结构上与宿主体内整合，且无 免疫原性反应，所以神经干细胞除了神经替代作用，还可作为 中枢神经系统基因治疗的载体细胞。神经干细胞的这些特性 使其在治疗中枢神经系统损伤性疾病及其伤后功能重建方面 有巨

20、大的应用前景。 2 神经干细胞的原代培养 2 1 供体年龄和取材部位的影响供体年龄对神经干细胞的 纯度的有一定影响。实验研究显示，胚胎鼠大脑皮质中的神经 干细胞数量明显高于新生鼠，且胎龄为1 2 1 5 d 左右的鼠胚胎 体内神经干细胞的分化能力最强。这与神经干细胞在大鼠胚胎 内增殖分化时间一致，即在第1 l 天生成，第1 5 天数量达高峰， 以后逐渐减少直至新生个体出生忙J 。取材部位对神经干细胞 的纯度也有影响。不同部位来源的神经于细胞增殖活力明显 不同，而且维持增殖活力的时间也有差异H J 。张在金Ho 等发 现，相同胎龄，从脑室下区分离的神经干细胞传代次数和增殖 活性明显强于从海马、纹

21、状体、皮层分离的神经干细胞。 2 2 分离方法对神经干细胞的纯度影响( 1 ) 胚胎或新生神 经组织的分离常采用机械分离法，将组织块用眼科剪尽量剪 碎，加入少量培养液，用加样器轻轻吹打到肉眼看不到明显的 组织块为止，再用2 0 0 目筛网过滤即可得到含神经干细胞的单 细胞悬液。也可以用注射器内芯研磨组织通过不锈钢筛网或 将组织放在注射器内通过针头压出，但该方法对组织损伤较 大。( 2 ) 对于成年神经组织的分离常采用酶消化分离法，因为 成年神经组织中神经细胞间连结紧密、突触联系非常发达、且 轴突纵横交错成一个立体三维网络结构，因此用机械方法很难 将其分离。目前广泛应用的是0 2 5 胰蛋白酶与

22、0 0 2 E D - T A l ：1 混合使用。将组织块用眼科剪充分剪碎后，吸入离心 管，加入消化酶约l m l ，置3 7 0 C 消化1 5 m i n ，中间摇晃一次，用 等量含1 0 胎牛血清的培养基终止消化，吸管吹打混匀，2 0 0 目筛网过滤后离心加入培养基重悬即可得到含神经干细胞的 单细胞悬液。 机械分离法和消化分离法两者都各有缺点，消化分离法消 化酶的消化时间不易掌握，并且用于分离神经干细胞的消化酶 对细胞都具有潜在的损害作用，可能会引起细胞表面一些神经 生长因子受体丢失，而这些受体是神经干细胞维持未分化状态 的关键因素。机械分离方法吹打的力度和次数也不易掌控，机 械切割作

23、用会使细胞活性降低，可用短期胰蛋白酶消化后再加 以适当机械吹打，既能分离获得大量细胞，减少细胞死亡。近几 年由于流式细胞仪分选技术的成熟，利用一些神经干细胞特异 的表面抗原C D 3 3 十C D 3 4 + C D 4 5 + 直接从神经细胞悬液中分 选出神经干细胞1 。还有利用免疫磁珠法从胚胎大鼠脑中成功 分离出神经干细胞，干细胞蛋白检测阳性细胞纯度达到9 0 【6 】。 2 3 接种密度对神经干细胞的纯度影响与其他细胞相比， 神经干细胞的生长更具有密度依赖性。赵志英等提出神经干 细胞的最佳接种密度至少为1x1 0 5 个T I l l 。一般以5 1 0 3 个 I I l l 的细胞密

24、度进行接种甚至可以达到1 1 0 6 个l I l l ，在5 C O ：、9 5 湿度、3 7 培养箱中培养将更有利于神经干细胞增 殖o 。神经于细胞通常根据培养液颜色变化和细胞生长情况 每2 3d 换液一次。由于神经干细胞呈悬浮生长，换液时要 离心弃去上清液再加人新鲜培养基重悬细胞后再接种。C h a n g 等试验结果发现半量换液的方法优于全量换液，这是因为神经 干细胞的自我更新、激活、增殖和分化主要依赖于周围特殊的 微环境，而细胞正在增殖中具有自分泌作用，分泌的细胞因子 同样也可以影响周围的其他细胞。采用半量换液的方法可以 最大程度地使细胞生存环境保持稳定，有利于细胞生长哺】。 2 4

25、 血清对神经干细胞的培养的影响血清中含有很多未知 的促分化因子，为去除血清中可能诱导神经干细胞分化的生长 因子等干扰因素，神经干细胞的体外培养基通常采用含有表皮 生长因子( E G F ) 、碱性成纤维细胞生长因子( b F G F ) 、白血病 抑制因子( L I F ) 等生长因子和谷氨酰胺以及B 2 7 或N 2 等辅助 因子的D M E M F 1 2 ( 1 ：1 ) 基础培养基，选择性促进神经干细胞 增殖。历俊华一1 等应用1 0 胎牛血清D M E M F 1 2 培养基预 培养4 8 h 后，再换为不含血清培养基培养神经干细胞，神经干 细胞的聚球速度明显加快，可提前2 3d 收

26、获神经干细胞球。 血清预培养加速神经干细胞聚球原因，可能与血清中的某些成 分可加速神经干细胞的表面粘附性有关，但确切机理还有待进 一步研究。 3 神经干细胞的传代培养 3 1 传代时间的选择提高神经干细胞的克隆形成率和形成 速度是传代培养神经干细胞的关键。神经干细胞经过原代培 养后，细胞数量大量增殖，形成神经球直径逐渐增大，毕将导致 球中心的神经干细胞因缺乏营养而死亡，因此及时进行传代是 防止其衰老死亡的关键，文献报道一般选用原代培养5 7 d 【I 引 时进行，既避免细胞过度增殖而死亡，同时也保持细胞增殖的 活性。 3 2 传代培养的方法选择神经干细胞体外生长为悬浮不贴 壁生长，因此传代培养

27、可选用直接吸出克隆球或离心收集细胞 后传代。选用直接吸出克隆球传代时要注意选用微吸管，并在 倒置显微镜下进行操作，以保证克隆球吸出的准确。当克隆球 吸出后，再用吸管反复吹打克隆球致细胞分散。但是要注意吹 打的力量，用力过猛或吹打次数过多将会影响细胞活性，而吹 打不充分又不能有效离散神经球，耿慧慧等采用分批吹打 结合使用E P O 的方法：能达到神经球分散和保持细胞活性的 作用，且传代后结合使用E P O 能增加细胞的增殖能力。 S v e n d s e n t 2 , t 3 等在对神经干细胞进行传代时，将原代培养 的神经干细胞球分割成均匀的4 份，使神经干细胞之间的联系 得以保留，这样既可

28、以保持神经干细胞的增殖状态，又能在短 期内获得更多的神经干细胞克隆。他们还创立了一种大规模 扩增神经干细胞数量的方法。他们不把神经球打散，而是将神 经球的平均直径控制在1 5 0 u r n 左右，这样球中心的细胞就不会 万方数据 发生坏死。然后将神经球置于悬浮生物反应器中培养，1 2 d 内 传代3 次，细胞数目就扩增了近3 0 0 0 倍，细胞密度达到1 1 0 6 个l I l l ，且活细胞比例达到8 0 以上。 L o w 【1 4 1 等则将E G F 反应性鼠神经干细胞用旋转管法培养 3 d 后，形成肉眼可见的三维复合物，细胞数量是培养瓶培养的 数十倍。还有学者堵3 采用有限稀释

29、法挑选的神经干细胞球 通过克隆连续传代法进行大量扩增，也获得了纯度高且较大数 量的神经干细胞。此外，在原代培养时每天添加定量、新鲜的 生长因子，也有助于神经干细胞的快速增殖J 。 4 目前神经干细胞培养存在的问题 目前，对神经干细胞的培养通常采用神经球悬浮无血清培 养，但此种方式有其缺陷。首先，形成球体的时候，内部的细胞 未能接触到培养基中抑制分化的因子和营养成分，容易死亡和 分化；再次，形成同一神经球的细胞不一定是单个细胞增殖而 来，所以对实验数据的可靠真实性有很大的影响。为此能否考虑 将神经干细胞球悬浮培养一段时间后再改为贴壁培养是一项神 经干细胞培养工作者值得迸一步研究的问题。有学者已经

30、开始 着方面的尝试，P a l m e rD s ) 等证实，神经干细胞的贴壁培养可以 显著增加细胞平均暴露面积，有利于神经干细胞充分获取细胞 因子刺激长期稳定增殖。但由于神经干细胞球贴壁后比较容易 分化，后来有人对神经干细胞进行单克隆单层化扩大培养。他 们采用原代培养S D 胎鼠神经干细胞，在形成神经球之后，移至 0 1 明胶包被的培养皿，显微镜下挑取一个贴壁的神经球细胞 团，吹打后贴壁培养同样方法传代培养5 6 次，得到由一个神 经干细胞扩增的克隆，对得到的神经干细胞进行鉴定以及分化 能力的评估，证明得到的细胞就是神经干细胞。 5 展望 尽管神经干细胞的研究到现在已经取得了大量的成果，但

31、神经于细胞在体外的分离培养技术还是不十分成熟，影响神经 干细胞在体外增殖分化的因素也较多，很多方面还处于研究阶 段，神经干细胞在体外培养容易贴壁分化，目前尚未找到有效 的改善方法。 其次，神经干细胞的定向诱导分化及移植治疗也存在许多 问题。神经干细胞的定向诱导分化是移植的前提，但脑内神经 元所负担的功能极为复杂，种类繁多，真正意义上的定向诱导 分化应使神经于细胞比较精确地分化成具有特定功能的神经 元仍是神经干细胞增殖分化培养中的难点。 通过癌基因转导的方法建立的永生化神经干细胞系，为科 研工作者带来了方便，但永生化神经干细胞存在着潜在的致瘤 性，限制了其应用价值。神经干细胞的体外培养体系的有效

32、建 立是深入研究和使用神经干细胞的重要前提，值得广大科研工 作者进一步探讨。 【参考文献l 1 】A r I d 删ID J ，M i c h e l s o h nA R o l eo fg l u e o e o r t i e o i d si nt h ec h r o m a f l _ i m 咖r d e v e l o p m e n t a ld e c i s i o n J I n tJD e vN e u n e i 1 9 8 9 ，7 ( 5 ) ： 3 1 7 4 7 5 4 S 7 S e a b e r gR M ，S m u k l e rS R ，v a

33、nd e rK o o yD I n t r i n s i cd i f f e r e n c e sd i s - t i n g u i s ht r a n s i e n t l yn e u r o g e n i ep r o g e n i t o r sf r o mn e u r a ls t e mc e l l si n t h ee a r l yp o s t n a t a lb r a i n J D e vB i o l ，2 0 0 5 ，2 7 8 ( 1 ) ：7 l 一8 5 S e a b e r gR M ，S m u k l e rS R ，v

34、 a nd e rK o o yD I n t r i n s i cd i f f e r e n c e sd i s - t i n g u i s ht r a n s i e n t l yn e u r o g e n i ep r o g e n i t o r sf r o mn e u r a ls t e mc e l l si n t h ee a r l yp o s t n a t a lb r a i n J D e vB i o l ，2 0 0 5 ，2 7 8 ( 1 ) ：7 1 8 5 张在金，董艳卢亦成大鼠胎脑不同部位神经干细胞比较性 培养的研究 J 】

35、中华神经外科疾病研究杂志，2 0 0 8 ，7 ( 4 ) ：3 2 5 3 2 7 S e r g e n tT a n g u yS ，C h a g n e a nC ，N e v e ul ，da F l u o r e s c e n ta c t i v a t e d c e l ls o r t i n g ( r A t S ) ：ar a p i da n dr e l i a b l em e t h o dt oe s t i m a t et h eh u m h e ro fn e u r o n 8i nam i x e dp o p u l a t i o n

36、J JN e u r e s e iM e t h o d s ，2 0 0 3 ， 1 2 9 ：7 3 7 9 6 高国一，卢亦成，等免疫磁珠法分选胚胎大鼠脑神经干细胞的 初步研究 J 第二军医大学学报，2 0 0 0 N o v ；2 1 ( 1 1 ) ：1 0 9 2 1 0 9 4 7 赵志英，胡海涛，师社会，等新生大鼠脑源性神经干细胞培养方 法的优化 J 中国修复重建外科杂志，2 0 0 5 ，1 9 ( 7 ) ：5 4 4 5 4 7 8 C H A N GMY 。P A R KCH ，L E Es LE m b r y o m cc o r t i c a ls t e m

37、c e l l s 静 c r e t ed i f f u s i b l ef a c t o r st oe n h a n c et h e i rs u r v i v a l J N e u r o r e p e r t 。 2 0 0 3 1 4 ：1 1 9 1 一1 1 9 5 9 历俊华，郑淑荣，万虹，等血清预培养促进神经干细胞的增殖 J 中国康复理论与实践，2 0 0 5 ，1 l ( 5 ) ：3 3 9 3 加 【1 0 T a n gY aj u a n ，G u oX i a ox i a ，e fa 1 S e p a r a t i o na n do r

38、i e n t a f i o n a lc u l t u r e o fn e u r a ls t e mc e l l s J J o u r n a lo f C l i n i c a lR e h a b i l i t a t i v eT i s s u eE u # - n c e r i n gR e s e s c hJ u l y1 5 ，2 0 0 8V o l ，1 2 ，N o 。2 9 。 1 1 】耿慧慧，赵莉，赵保明提高胚鼠脑源性神经干细胞克隆形成 的一种方法 J 解剖与l 临床，2 0 0 8 ，1 3 ( 4 ) ：2 9 1 - 2 9 3 1 2

39、】S e nA ，K a l t o sM S ，B e h i eL A P a s s s g i n gp r o t o c o l sf o rm a m m a l i a nn e u - m ls t e mc e l l si ns u s p e n s i o nb i o r e a c t o r sB i o t e c h n o lP r o s ，2 0 0 2 ，1 8 ( 2 ) ：3 3 7 3 4 5 【1 3 S e nA ，K a l h sM S ，B e h i eL A E x p a n s i o no f m a m m e l i a

40、 nn e u r a l s t e m c e l l si nb i o r e a c t o r s ：e f e c to fp y w c ri n p u t8 1 1dm e d i u mv i s c o s i t y J B r a i nR e sD e vB r a i nR e s 2 0 0 2 1 3 4 ( 1 2 ) ：1 0 3 一“3 1 4 L o wH P ，S a v a r e s eT M ，S c h w a r t zW J ，N e u r a lp r e c u r s o rc e l l sf o r mm d i m e n

41、 t a r yt i s s u e l i k es t r u c l u r e si nar o t a t i n g w a l lv e s s e lb i o re a c l o r J I nV i t r oC e l lD e vB i o L A n i m 。2 0 0 1 3 7 ( 3 ) ：1 4 1 1 4 7 1 5 D a v i sA A ，T e m p l eS As e l f r e n e w i n gm u l t i p o t e n t i a ls t mc e l li ne m - b r y o n i cr a tc

42、e r e b r a lc o r t e x J 】N a t u r e ，1 9 9 4 ，3 7 2 ( 6 5 0 3 ) ：2 6 3 2 6 6 【1 6 】杜杭根，李宏宇，杜理安大鼠神经千细胞体外培养及分化 J 浙江创伤外科，2 0 0 9 ，1 4 ( 1 ) ：2 1 2 3 【1 7 H a z e lT ，M u l l e rT ，C u l t u r eo fn e u r e e p i t h e l i a ls t e mc e H s J C u r tP r o - t e cN e u r e s c i 2 0 0 1 。C h a p t e

43、r3 ：U n i t3 1 1 8 P a l m e rT D 。S c h w a r t zP H ，T a u p i nP ，矗a C e l lc u l t u r e P r o g e n i t o rc e l l s f r o mh u m a nb r a i na f t e rd e a t h J N a t u r e ，2 0 0 1 ，4 1 ( 1 ) ：4 2 4 3 1 9 丁道芳。邢三丽周鸣呜，等大鼠胚胎神经千细胞单克隆化及单 层化培养和鉴定 J 生物化学与生物物理迸展2 0 0 9 ，3 6 ( 1 ) ：7 2 - 7 6 ( 收稿日期：2 0 0 9 - 1 2 - 3 1 ) 1 J 1 J 1 J 1 J 心 p H p 万方数据