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1、神经干细胞的体外培养及增强型绿色荧光 蛋白基因转染研究 刘伟国冯军峰杨小锋郑学胜 【摘要】目的探索大鼠胚胎神经干细胞（NSCs）的体外培养，探讨 NSCs 作为基因靶细胞，以及逆转录 病毒介导增强型绿色荧光蛋白（EGFP）标记 NSCs 的可行性。方法胚胎大鼠脑组织分离神经干细胞，无血 清培养，免疫组织化学技术鉴定。用 Lipofectin 将 pLEGFP-N1 逆转录病毒载体导入 PA317 包装细胞，用 G418 筛 选获得抗性细胞克隆，扩增抗性细胞并收集病毒上清；病毒上清感染神经干细胞，用 G418 筛选，荧光显微镜 下观察并挑选 EGFP 表达最强的克隆，并做免疫组化鉴定；进一步培养
2、扩增，做传代细胞的分化鉴定。结果 培养出大鼠胚胎神经干细胞。荧光显微镜下检测感染逆转录病毒的神经干细胞，以及免疫组化鉴定，均显 示 EGFP 获得良好表达；而且感染细胞能够被诱导分化为神经元和神经胶质细胞。结论大鼠胚胎神经干细 胞能够在体外适宜的条件下进行长期培养；神经干细胞可直接作为基因靶细胞；利用逆转录病毒载体，建立 稳定表达 EGFP 的神经干细胞系具有可行性，为进一步做标记细胞移植研究奠定基础。 【关键词】神经干细胞；增强型绿色荧光蛋白；逆转录病毒载体 中图分类号：R - 33文献标识码：A 文章编号：1007-0931（2005）09-0003-03 A Study on Cultu
3、re of Neural Stem Cells in vitro and Transfection of Enhanced Green Fluorescent Protein LIU Wei-guo，FENG Jun-feng，YANG Xiao-feng，et al .（ The Second Affiliated Hospital，Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou，Zhejiang，310009，China .） 【Abstract】ObjectiveTo explore the culture of neural stem c
4、ells（NSCs）in vitro and the feasibility of NSCs being gene target cells and enhanced green fluorescent protein（EGFP）labeling NSCs. MethodsThe NSCs were isolate from rat embryo brains，then cultured in serum free medium，and identified by immunocytochemistry. pLEGFP-N1 retroviral vectors were transferre
5、d into PA317 cells by lipofectin. After selected by G418，the resistant colonies were cloned，and the virus supernatant was collected. The NSCs were infected by the virus supernatant，and then selected by G418. The colonies with the best expression of EGFP were observed and selected using fluorescence
6、microscope，and identified with immunocytochemistry technology，which were further cloned and their passage cells were also identified with immunocytochemistry technology. ResultsThe NSCs were successfully cultured and G418 resistant clones of NSCs gave off strikingly bright green fluorescence. The EG
7、FP expressed well，and affected cells could be induced to differentiate into neurons and glial cells respectively. ConclusionsThe NSCs originated from rat embryo brains can be cultured in vitro under appropriate conditions，and it can be directly used as gene target cells. Moreover，it is feasible to c
8、onstruct the NSCs expressing EGFP stably with the use of retroviral vectors，which can be further applied for the transplantation study of labeling cells. 【Key words】Neural stem cells；Enhanced green fluorescent protein；Retroviral vector 本课题属浙江省自然科学基金课题（M303658） 作者 单 位：浙江大学医学 院 附 属 第 二 医 院，浙 江 杭州31000
9、9 神经干细胞具有很强的自我更新和多向分化潜能 1， 为中枢神经系统的损伤修复以及多种神经系统疾病的治疗 带来了新的希望 2。同时，基因工程技术的迅速发展使人 们可以对神经干细胞进行不同的遗传学修饰，以满足不同 的科研及临床治疗需要。神经干细胞移植于活体动物模型 后，可能发生死亡，或者能存活、分化，甚至与宿主神经 组织进行整合。有效的检测外源输入性神经干细胞的转归， 对于 判 断 移 植 疗 效 极 其 重 要。 绿 色 荧 光 蛋 白 （ green fluorescent protein，GFP）由水母中克隆得到，增强型绿色荧 光蛋白（enhanced green fluorescent
10、protein，EGFP）是其人工 改造型，有其独特的优势，是目前细胞生物学示踪剂研究 中的一种重要手段 3。本实验分离培养了胚胎大鼠神经干 细胞，并以逆转录病毒介导 EGFP 标记神经干细胞，探索其 可行性，并为进一步开展标记细胞移植研究奠定基础。 材料与方法 1材料和试剂实验动物：SD 孕鼠（14d）10 只（浙江大 学医学院实验动物中心） 。细胞株：PA317 细胞（上海细胞 生物 化 学 研 究 所） 。质 粒：pLEGFP-N1 逆 转 录 病 毒 载 体 （Clontech 公司） 。主要试剂：DMEM 培养基，DMEM/ F12（1: 1）无血 清 培 养 液，胎 牛 血 清，L
11、ipofectin，1.25g/ L 胰 蛋 白 酶，B27，抗 神 经 巢 蛋 白 抗 体（Nestin IgG） 、抗 GFAP 抗 体 （GFAP IgG） 、NSE 抗体（NSE IgG） （均来自 Gibco 公司） ； 3浙江预防医学 2005 年第 17 卷第 9 期Zhejiang Prev Med，September 2005，Vol 17，No. 9 bFGF，EGF，溴化二甲胺（Polybrene） ，G418（均来自 Sigma 公司） ；抗 EGFP 抗 体（Clontech 公 司） ；DAB 显 色 试 剂 盒 （武汉博士德生物工程公司） 。 2神经干细胞的分离、
12、培养和传代脱颈法处死 14 天孕 龄 SD 孕鼠，70%乙醇浸泡消毒，打开腹腔取出子宫置于盛 有 D-Hank 液的培养皿中，剥离 胎盘，冲洗几次，获得胚 胎，剥离硬脑膜，分离出大脑半球，将其移至另一个含有 D-Hank 液的无菌青霉素瓶中，剪成 1mm3小块，加入 1.25g/ L 的胰蛋白酶边消化边用滴管吹打约 5 分钟。过 300 目尼龙 筛网，离心，弃上清，台盼蓝染色活细胞计数。用 DMEM/ F12 调节为 2 5 105个 / ml 的细胞密度接种，加入 2% B27、 20ng/ mlbFGF 和 10ng/ mlEGF，放入 37，5% CO2培养箱中 培养。每 2 3 天换半
13、液 1 次，每 6 7d 传代 1 次：1000rpm 离心 8min 收集神经球，胰酶消化，并轻轻吹打成单细胞状 态，计数后用新鲜培养基及神经生长因子（同上）接种培 养。 3神 经 干 细 胞 的 鉴 定取 传 代 生 长 的 神 经 球 接 种 于 经 0.1%多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，加入含 10% 胎牛血 清的 DMEM/ F12 培养液使神经球贴壁，2 小时后即进行固定 染色，用抗 Nestin 单抗标记神经干细胞，以 DAB 显色剂常 规显色。 4pLEGFP-N1 转染 PA317 细胞及筛选含 10% 胎牛血清 的 DMEM 培养基常规培养 PA317 细胞，胰酶消化后传代
14、。 用 Lipofectin 将 pLEGFP-N1 逆转录病毒载体转染 PA317 包装 细胞。转染 24 小时后荧光显微镜下（激发光波长 488nm） 观察 EGFP 表达情况，并用 400g/ ml G418 筛选 2 周，获得 稳定转染并持续表达 EGFP 的抗性克隆。选择表达 EGFP 最 强的抗性细胞并扩增培养，收集病毒上清液 4。 5病毒上清液感染神经干细胞将 0.5ml 病毒上清液与 1.5ml 正常培养基，以及 Polybrene 8g/ ml 混合后加入传代神 经干细胞中，感染 5 小时，然后改换正常培养基。24 小时 后，胰蛋白酶消化并轻轻吹打成单细胞悬液，接种于 96
15、孔 培养板中，并加入 400g/ ml G418 筛选抗性克隆。荧光显微 镜下挑选 EGFP 表达最强的克隆，进一步培养、传代扩增。 6EGFP 在 PA317 包装细胞和神经干细胞中整合表达的鉴 定设定激发光波长 488nm，荧光显微镜下观察 EGFP 表达 情况。分别对稳定转染并持续表达 EGFP 的 PA317 细胞和神 经干细胞进行摄片，并对照观察常规培养的 PA317 细胞和 神经干细胞。与神经干细胞的 Nestin 染色相同的方法，用 抗 EGFP 抗体标记神经干细胞，DAB 显色剂显色。 7表达 EGFP 的神经干细胞的分化细胞鉴定挑选表达 EGFP 的神经干细胞，做消化、传代，
16、并以 5 104/ 片细胞 密度接种于经 0.1%多聚赖氨酸包被的玻璃盖玻片上，加入 含 10%胎牛血清的 DMEM/ F12 培养液，分化培养 5 天，分 别用 NSE 抗体、抗 GFAP 抗体来标记，DAB 显色剂显色。 结果 1神经干细胞的分离、培养和传代用上述方法分离、培 养得到的胚胎大鼠神经干细胞，镜下观察活细胞胞体透亮， 悬浮生长。原代培养时细胞瓶中可见到一些细胞碎片和部 分贴壁的杂细胞，传代则少见。2 3 天以后，原本单个的 神经干细胞分裂形成细胞小球，以后细胞小球逐渐变大形 成克隆球。这些克隆球球体透亮，边缘整齐，细胞排列紧 密。至 7 8 天时，神经干细胞大量扩增，神经球中细
17、胞达 数百个。本实验室传代（最多 10 代以上） ，以及冻存复苏 （最长达 6 个月）后神经干细胞基本特征与原代相似。 2神经干细胞的鉴定神经球接种于含血清的培养基后， 细胞很快开始贴壁生长，球形的细胞团变扁，向四周长出 众多突起，呈放射状。Nestin 免疫染色，结果显示克隆球呈 Nestin 表达阳性。 3PA317 细胞表达 EGFP 的观察常规培养的 PA317 细胞 在荧光显微镜下无任何荧光。而成功转染了 EGFP 的 PA317 细胞在波长 488nm 的激发光下，表现出明显的绿色荧光。 仔细观察，尚可发现各绿色荧光的形态正是 PA317 细胞的 形态。 图 1 常规（左）及荧光（
18、右）显微镜下转染了 EGFP 的神经干细胞（ 100） 4EGFP 在神经干细胞中整合表达的鉴定图 1 左右两侧 分别是对同一部分神经干细胞在普通光和 488nm 激发光下 的观察。充分表明 EGFP 在神经干细胞（神经球）中获得了 良好的表达。而对照未作感染的神经干细胞，荧光显微镜 下无任何荧光。EGFP 免疫组化染色结果见图 2，呈明显的 EGFP 阳性反应。 5表 达 EGFP 的 神 经 干 细 胞 的 分 化 鉴 定接 种 的 传 代 EGFP 阳性神经干细胞，很快开始贴壁生长。球形透亮的细 胞变扁，胞体呈双极突起的椭圆形和带多个细长突起的多 边形。分化 5 天后免疫组织化学鉴定，发
19、现分化的细胞中 有 NSE 阳性的神经元细胞和 GFAP 阳性的神经胶质细胞。 图 2 神经干细胞团中的细胞呈 EGFP（ + ） （ABC 法， 400） 4浙江预防医学 2005 年第 17 卷第 9 期Zhejiang Prev Med，September 2005，Vol 17，No. 9 讨论 神经干细胞在神经系统损伤修复和神经退行性疾病的 细胞替代治疗和基因治疗中有巨大的应用价值。本实验以 SD 孕鼠为研究对象，探索了 SD 大鼠神经干细胞的分离、 培养、传代及其鉴定。从胚胎大鼠大脑中分离培养的细胞 团，在特定的培养条件下，具有很强的分裂、增殖及自我 更新能力。传代（最多 10 代
20、以上） ，以及冻存复苏（最长 达 6 个月）后神经干细胞基本特征与原代相似。免疫组化 表明培养的细胞团表达神经干细胞特异性抗原 Nestin。成功 分离、培养的神经干细胞，为神经干细胞的进一步研究提 供了基本条件。 对中枢神经系统的损伤或病变部位实行细胞替代或基 因治疗在目前极具发展前景，是神经病学上的重大治疗战 略。对发育中或成年中枢神经系统内植入胚胎神经组织的 一些实验已经证明，某些部位的神经母细胞或分裂后的年 幼神经元能够部分重建神经环路和功能 5。将神经干细胞 移植入受损脑组织不仅可以补充、替代受损的神经组织， 而且还能将外源性基因导入，使其在体内病变部位有效表 达。本实验用逆转录病毒
21、介导，成功在神经干细胞中导入 EGFP，并且在感染的神经干细胞及其传代细胞中均有 EGFP 编码蛋白的有效表达。这说明，神经干细胞可以成为载体 细胞为中枢神经系统某些疾病，尤其是退行性疾病（如帕 金森病） ，导入治疗基因（如帕金森病导入 TH 基因）或者 是一些营养成分（如 NGF、GDNF 等） ，提供一种有效手段。 本实验从细胞标记的角度选用逆转录病毒包装绿色荧 光蛋白标记神经干细胞，发现转染了 EGFP 的神经干细胞在 体外经多次传代不影响 EGFP 的表达，NSCs 本身仍能分化 为神经元和神经胶质细胞。因此 EGFP 可作为基因转染后的 良好细胞标记，为进一步行标记细胞移植治疗实验奠
22、定了 基础。 参考文献 1Mckay R. Stem cells in the central nervous systemJ . Science，1997， 276（5309） ：66. 2Jannotti C，Lu XB，Lu PH，et al. Neural stem cell transplantation in the repair of spinal cord injuryJ .Progress in Natural Science， 2001，11（7） ：490 503. 3Naylor LH. Reporter gene technology：the future looks
23、 brightJ . Biochem Pharmacol，1999，58：749 757. 4Miller A D，Rosman G J. Improved retroviral vector for gene transfer and expressionJ . Bio Techniques，1989；7（9） ：980. 5Kalb R G，Strittmatter S M. Neurobiology of spinal cord injuryM . Totowa：New Jersey Humana Press INC，2000. 80 94. （收稿日期：2004-11-23） （上接第
24、 2 页） 图 2 三叶青提取物对原代培养大鼠肝细胞毒性作用 *和空白对照组比较 P 0.05。 讨论 肿瘤治疗一直是困扰医学界的世界性难题，特别是对 肝癌、肺癌等发病率较高的癌症 5，至今尚无比较满意的 治疗方法和治疗药物。在放化疗药物耐受性日益严重的同 时，中医中药及有关营养的支持为治疗肿瘤开辟了一条崭 新的道路。为此，我们试图利用我国特有的三叶青进行抗 肿瘤试验研究。 实验结果发现，三叶青提取物中乙酸乙酯溶部分对人 肝癌细胞 HepG2 活性具有较强的抑制作用，正丁醇部分也 有一定的作用。有人对三叶青的主要成分作过初步的研究， 发现乙酸乙酯溶部分主要成分为 6-O-苯甲酰基胡萝卜甙 （6
25、-O-benzoyldau-costerol） 6，研究证明具有一定的肿瘤抑 制作用和抗病毒作用。通过本实验研究发现，三叶青提取 物中乙酸乙酯溶部分的确具有很好的肿瘤细胞毒作用，为 进一步研究及临床用药提供了科学的依据。 实验同时发现，对正常原代培养的大鼠肝细胞活性没 有明显的影响，对 LDH 活力影响也较对 Hep G2 要小，提示 三叶青的各部分提取物对正常细胞影响较肿瘤细胞要小。 但对三叶青中的有效成分究竟通过何种途径发挥作用，需 要作进一步的研究和探索。 参考文献 1中国医学科学院药物研究所 . 中药志M . 第二册，北京：人 民卫生出版社，1984. 219. 2刘东，杨峻山 . 中
26、国特有植物三叶青化学成分的研究J . 中 国中药杂志，1999，24（10） ：611 612. 3李瑛琦，陆文超，于治国 . 三叶青的化学成分研究J . 中草 药，2003，34（11） ：982 983. 4Seglen PO. Preperation of isolated rat liver cellsJ ，Methods in cell Biology. 1976，13：29. 5 Ding Gangqiang， Yu Ming， Gong Weiwei， et al.Nutrition-related disease and death in Zhejiang provinceJ .Asia Pacific J of Clin Nutr，2004，13（12） ：162 165. 6杨大坚，刘红亚，李新中，等 . 破石珠化学成分研究J . 中 国中药杂志，1998，23（7） ：419 421. （收稿日期：2005-02-17） 5浙江预防医学 2005 年第 17 卷第 9 期Zhejiang Prev Med，September 2005，Vol 17，No. 9