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1、论著 神经节苷脂对大鼠缺血后脑水肿脑组织中A Q P 4 - m R N A 表达 的影响 赵荷剑高林贺维亚 河南大学淮河医院神经内科开封4 7 5 0 0 2 【摘要】目的探讨神经节苷脂对大鼠缺血后脑水肿脑组织中A Q P 4 一m R N A 表达的影响。方法线栓法复制脑缺血大 鼠模型，于缺血后6 h 、1 、3 、5 、7 d 观察模型大鼠脑组织含水量及A Q P 4 - m R N A 的表达。结桌 手术组大鼠脑组织水含量及 A Q P 4 - m R N A 的表达予6 h 后升高，3 d 达高峰，较假手术组和神经节苷脂组显著升高( P O 0 5 ) 。结论神经节苷脂能够降 低脑梗
2、死大鼠脑组织水含量及A Q P 4 - m R N A 的表达，减轻脑水肿。 【关键词】脑水肿 水通道蛋白4 ；神经节苷脂 【中图分类号】R - 3 3 2【文献标识码】A【文章编号】1 6 7 3 5 1 1 0 ( 2 0 0 9 ) 2 0 - 0 0 0 1 - 0 2 E f f e c to fG M lo ne x p r e s s i o no fA Q P 4 - m R N Aa f t e ri s c h e m i cb r a i ne d e m ai nr a t s Z h a oH e j i a n 。G a oL i n ，H P W e i y a
3、D e p a r t m e n to fN e u r o l o g y ，H u a i h eH o s p i t a lo fH e n a nU n i v e r s i t y ，K a i f e n g4 7 5 0 0 1 ，C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T oo b s e r v et h ee f f e c to fG M lo ne x p r e s s i o no fA Q P 4 一m R N Aa f t e ri s c h e m i cb r a i ne d e m ai n r a
4、 t s M e t h o d sT h er a tm o d e lo fc e r e b r a li s c h e m i ew a se s t a b l i s h e db yi n s e r t i n gn y l o nt h r e a d C h a n g e so fb r a i nw a t e rc o n t e n t a n de x p r e s s i o no fA Q P 4 一m R N Aw e r ee x a m i n e da f t e re e r e b r a li s e h e m i ca t6 h ，l d
5、 ，3 d ，5 d ，7 d R e s u l t sT h eb r a i nw a t e rc o n t e n t a n de x p r e s s i o no fA Q P 4 一m R N Ao fs u r g e r yg r o u pi n c r e a s e da t6 ha n dr e a c h e dt h ep e a ka t3 d ，t h e yw e r eo b v i o u s l yh i g h e rt h a n t h a ti nt h ef a l s es u r g e r yg r o u pa n dt h
6、eG M lg r o u p ( P ( 0 0 5 ) C o n c l u s i o nG M lc a nd e c r e a s et h ed e g r e eo fb r a i ne d e m ab yr e 。 d u c i n gb r a i nw a t e rc o n t e n ta n de x p r e s s i o no fA Q P 4 - m R N A K e yw o r d s B r a i ne d e m a ；A Q P 4 ；G M l 神经节苷脂( G M l ) 系细胞膜的重要成分之一，在中枢神 经系统中最丰富，具有促
7、进神经再生、神经轴突生长，突触形 成和恢复神经支配功能。研究表明G M l 对缺血神经元具有 保护作用。其机制之一为减轻脑水肿 1 。水通道蛋白( a q u a - p o r i nA Q P ) 是近年来发现的一组与水通透有关的细胞膜转 运蛋白，与缺血性脑水肿的发生关系密切，脑组织中主要是 水通道蛋白4 ( A Q P 4 ) 2 。但G M l 对A Q P 4 的影响报到尚 少。本实验通过研究G M l 对A Q P 4 的影响，进一步阐明 G M l 的脑保护机制。 1 材料与方法 1 1 实验动物健康雄性S D 大鼠7 5 只，体质量2 5 0 3 0 0 9 ，随机分3 组：假
8、手术组、手术组、神经节苷脂组，各2 5 只。各组分别按6 h 、1 357 d 时间点成5 个亚组，每个亚组 5 只。 1 2 动物模型制备大脑中动脉闭塞( M C A O ) 模型参照 Z e aL o n g s 线栓法。以水合氯醛腹腔麻醉分离并结扎左颈 总、颈外动脉。在左颈总动脉近交叉约5 m m 处切口，用直径 0 2 6 r a m 的鱼线插入颈内动脉，深度1 8 2 0 m m ，结扎颈内动 脉。假手术组颈内动脉不插鱼线。鱼线插人组鱼线插入并 固定后腹腔注入鱼线插入( 1 0 m g k g ，) 以后每2 4 h 一次。 1 3 指标检测 1 3 1 脑组织含水量测定：取大鼠右侧
9、脑组织称湿重，后于 9 5 1 0 0 “ C 烤箱中烘烤2 4 h 后称干重，按如下公式计算脑组 织含水量百分比：脑组织含水量= ( 湿重一干重) 湿重 1 0 0 。 1 3 2A Q P 4 m R N A 的测定：分别对各组脑组织制备匀浆， 采用T r i z o l 提取脑组织总R N A ，紫外分光光度仪测定R N A 含量，采用M M L V 试剂盒中步骤将R N A 逆转录成c D N A ， 再将c D N A 进行P C R 扩增，取扩增产物进行电泳，用凝胶图 像分析系统进行电泳条带光密度分析，计算A Q P 4 产物和p a c t i n 产物光密度积分的比值，作为A
10、Q P 4 - m R N A 表达的指 标。 1 4 统计学处理各实验组数据用z s 表示，多组之间 采用单因素方差分析。采用S P S S1 3 0 统计软件进行统计 学处理。 2 结果 表1各实验组脑水含量的变化( 孑士s ) 删挖1 广1 萼警_ 毛 假手术组2 57 8 3 3 ：t ：1 2 2 7 8 4 5 2 0 17 8 2 1 + 1 0 87 8 5 5 5 ：1 8 77 8 4 9 + 1 9 8 手术组2 57 9 8 3 ：1 ：2 2 1 a8 1 2 6 ：t ：2 5 7 8 3 4 9 + 2 8 8 8 2 5 3 + 2 6 7 z x8 0 6 8
11、 ：L 2 8 5 G M - I 组 2 57 虫l l 土1 6 7 8 m 黯士玉0 6 8 1 9 2 + 2 3 8 8 1 0 9 _ + 2 5 5 z 、7 9 3 4 + 2 3 7 注：与假手术组相比，P 0 0 5 ，与手术组相比，P 0 0 5 万方数据 2 生垦塞旦塑墅壅丛盘查；! ! ! 堡! ! 旦箜! ! 鲞箜! ! 塑曼垦i 塾! ! ! ! 坚塑! 堕! ! ! 盟! 型丛! ! ! ! 塑旦! ! ! ! ! ! Q 垡：；! ! ! ! Y ! ! ：! ! 型! ：垫 2 1 脑组织水含量测定结果手术组脑组织水含量于6 h 开始升高，3 d 达高峰，而
12、后下降，7 d 仍高于正常。G M l 组与 手术组比较，各时间点脑组织水含量均显著下降( P 0 0 5 ) ，见表1 。 2 2 A Q P 4 一m R N A 的表达手术组脑组织A Q P 4 一t u R N A 的表达较假手术组明显升高，差异有统计学意义( P O 0 5 ) ， G M l 组与手术组比较，各时间点脑组织A Q P 4 一m R N A 的表 达均明显下降，差异有统计学意义( P 0 0 5 ) 。见表2 。 表2 各实验组A Q P 4 一m R N A 的变化( x - - I - s ) 组别雄弋r 笔产笔竽等竽、 假手术组2 50 7 7 士O 1 8 0
13、 7 8 + 0 1 10 7 8 + 0 1 8 0 7 7 ：J ：0 1 70 7 8 0 1 8 手术组2 51 2 3 0 2 1 I 6 2 + 0 3 7 1 4 9 土0 1 8 1 3 5 0 2 7 1 2 8 士0 2 5 G M - 1 组2 50 8 9 土O 1 7 0 9 2 + 0 1 8 0 8 8 + 0 1 6 0 8 9 + 0 1 5 0 7 9 + 0 1 7 注：与假手术组相比， P 0 0 5 ；与手术组相比，P 0 0 5 ， 2 3 脑组织水含量与A Q P 4 一m R N A 表达的相关分析由 表1 和表2 分析得出：r = 0 7 7
14、6 ，P 0 0 1 ，提示水含量与 A Q P 4 一m R N A 的表达正相关。 3 讨论 本实验采用线栓法致大鼠脑缺血，诱发脑水肿，与脑梗 死后水肿形成的病理生理过程相似。脑组织水含量于6 h 开 始升高，3 d 达高峰，而后下降，7 d 仍高于正常。手术组各时 间点脑组织水含景均高于假手术组( P o 0 5 ) 。 水通道蛋白是一个高选择性、低活化能转运水分子的跨 膜通道蛋白家族。目前已鉴定出至少1 1 种水通道蛋白，依 次命名为A Q P0 1 0 。A Q P 家族町分两类：一类只允许水 分子通过，属于选择性水通道，包括A Q P 一0 、1 、2 、4 、5 、6 ；另一 类
15、A Q P 则同时允许水分子和其他的中性小分子( 如甘油，尿 素) 通过，包括A Q P - 3 、7 、9 。A Q P 一4 广泛存在于脑星形胶质 细胞膜的足板、蛛网膜下隙、血管周围的胶质细胞、审管膜细 胞、脉络丛上皮及下丘脑的视卜核、室旁核及海马齿状回和 小脑。由于星形胶质细胞是血脑屏障( B B B ) 的重要组成部 分，所以，A Q P 一4 的表达对于B B B 的功能调节有密切关系。 当A Q P - 4 表达上调时，可引起神经胶质细胞足突水肿，进而 使B B B 遭到破坏，导致脑水肿。在脑水肿组织中可见A Q P 4 的表达E 调。缺乏A Q P 4 的星形细胞对水的通透能力下
16、降 达7 倍【3 。M a n - l e y 等通过建立大鼠的大脑中动脉栓塞脑 缺血后水肿模型，发现与野生型鼠相比，A Q P 一4 敲除大鼠的 星形胶质细胞足突的膨胀程度较轻。T a n i g u c h i 等1 5 1 发现在 栓塞周围皮质的A Q P - 4m R N A 在缺血后第1 天表达轻微上 调。第3 天达到高峰，第7 天仍处于较高水平与磁共振监测 的脑水肿变化相一致，从而说明了A Q P 4 参与了缺血后脑水 肿的形成。国内对脑卒中后脑水肿与A Q P 4 表达的研究发 现 ”“，A Q P 4 蛋白的表达和脑水含量呈正相关，A Q P 4 表达 上调是形成细胞内水肿的关
17、键因素，在脑缺血再灌注损伤 中，A Q P 4 水平的迅速下降町能是机体对脑损伤作出的一种 保护性反应。本实验得出类似结果，手术组A Q P 4 一m R N A 表达6h 开始升高，3d 时达到高峰。手术组A Q P 4 一m R N A 表达均高于假手术组，有显著性差异( P 0 0 5 ) 。从脑水含 宦与A Q P 4 一m R N A 表达的相关分析可以看出，二者变化规 律一致，具有正性相关。提示A Q P 4 一m R N A 的表达与脑水 肿的程度呈正比关系。 神经节苷脂是一组含有唾液酸的鞘糖脂，神经节苷脂 ( 即单唾液酸四已糖神经节苷脂) 是哺乳类神经节苷脂的主 要种类。以往研
18、究 1 表明G M l 可抑制脑水肿的发生，这种 作用可能与恢复N a + - K + A T P a s e ，C a ”一M 9 2 + A T P a s e 活性 有关。本实验中，G M l 组的脑水含量及A Q P 4 一m R N A 表达 均比手术组低，说明G M l 可以下调水肿组织的A Q P 4 一m R N A 表达，从而减轻脑水肿，起到保护脑细胞的作用。但对于 A Q P 4 调节的分子机制尚需进一步研究。 参考文献 1 张大锡，孙青芳神经节苷脂对局灶脑缺血的保护作用 J 临 床神经科学，1 9 9 7 ，5 ( 3 ) ；1 3 2 1 3 5 2 任丽，孙善全缺血性
19、脑水肿生理病理研究进展口 国外医学 神经病学神经外科分册，2 0 0 3 ，3 0 ( 5 ) ：4 2 3 3 S o l e n o vE ，W a t a n a b eH ，M a n l e yG T ，e ta 1 S e v e n f o l d r e d u c e d o s m o t i cw a t e rp e r m e a b i l i t yi np r i m a r ya s t r o c y t ec u l t u r e sf r o m A Q P 一4 一d e f i c i e n tm i c e ，m e a s u r e db
20、yaf l u o r e s c e n c e q u e n c h i n g m e t h o d J A mJP h y s i o lC e l lP h y s i 0 1 2 0 0 4 ，2 8 6 ( 2 ) ：c 4 2 6 一 c 4 3 2 4 3M a n l e yG T ，F u j i m u r aM 。M aT ，e ta 1 Aq u a p o r i n - 4d e l e t i o ni n m i c er e d u c e sb r a i ne d e m aa f t e ra c u t ew a t e ri n t o x
21、i c a t i o na n di s c h e m i cs t r o k e J N a tM e d ，2 0 0 0 ，6 ( 2 ) ：1 5 9 1 6 3 5 3T a n i g u c h iM 。Y a m a s h i t aT ，K u m u r aE ，e ta 1 I n d u c t i o no fa q u a p o r i n 一4w a t e r c h a n n e lm R N Aa f t e rf o c a lc e r e b r a li s c h e m i ai n r a t J B r a i nR e sM o
22、 lB r a i nR e s ，2 0 0 0 ，7 8 ( 1 2 ) ：1 3 1 1 3 7 6 3 李燕华，孙善全实验性脑出血后水通道蛋白一4 的表达变化 J 中华神经科杂志，2 0 0 4 ，3 7 ( 2 ) ：1 4 4 1 4 8 7 鲁宏，熊f ：平，胡惠。等水通道蛋白一4 在缺血半暗带组织中的 表达 J 中华放射学杂志，2 0 0 5 ，3 9 ( 6 ) ：6 0 4 6 0 7 8 包仕尧。石向群，张志琳，等大鼠脑缺血再灌注损伤过程中水 通道蛋白一4 表达水平的变 J 国外医学脑血管疾病分册， 2 0 0 4 ，1 2 ( 2 ) ：1 2 2 1 2 5 ( 收稿2 0 0 9 0 8 0 2 ) 万方数据