神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色.pdf

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1、上 海 第 二 医 科 大 学 学 报 A c a d e m i cJ o u r n a l o fS h a n g h a iS e c o n dM e d i c a lU n i v e r s i t yV o l . 2 5N o . 7J u l . 2 0 0 5 【 作者简介】 许 勤(1 9 6 6-) , 女, 上海人, 主治医师, 博士. 【 文章编号】 0 2 5 8-5 8 9 8( 2 0 0 5)0 7-0 7 0 2-0 3 基础研究 神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色 许 勤1, 鲍 南2, 李 敏3, 金 誉1, 施诚仁3, 蔡 威3 ( 上海第二医

2、科大学新华医院1科研中心,上海 2 0 0 0 9 2; 2上海儿童医学中心小儿神经外科;3小儿外科) 【 摘 要】 目的 应用细胞团石蜡包埋技术, 检测神经球内部的神经干细胞标记物巢蛋白(n e s t i n) 表达。方法 从孕1 7d的S D大 鼠胚胎大脑海马部位分离, 培养神经干细胞, 石蜡包埋神经球, 通过免疫组化方法检测神经球内部的n e s t i n表达。结果 培养中 的神经球均显示n e s t i n阳性表达, 但阳性细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较大差异。结论 细胞团石蜡包埋技术检测 神经球内部的n e s t i n表达, 能全面反映神经球中神经干细胞存在的比例,

3、 可作为优化培养技术的实验基础。 【 关键词】神经干细胞; 神经球; 巢蛋白 【 中图分类号】R 3 3 8. 1 1 【 文献标识码】A N e s t i nI mm u n o h i s t o c h e m i c a l S t a i n i n go nP a r a f f i nE m b e d d e dN e u r o s p h e r e s X UQ i n 1, B A ON a n 2, L IM i n 3, J I NY u 1, S H IC h e n g - r e n 3, C A IW e i 3 ( 1R e s e a r c hC e

4、 n t e r;2D e p a r t m e n t o fP e d i a t r i cN e u r o s u r g e r y, S h a n g h a iC h i l d r e n sM e d i c a lC e n t e r; 3D e - p a r t m e n to f P e d i a t r i cS u r g e r y,X i n h u a H o s p i t a l,S h a n g h a iS e c o n d M e d i c a lU n i v e r s i t y,S h a n g h a i 2 0 0

5、0 9 2,C h i n a) A b s t r a c t: O b j e c t i v e U s i n gc e l l sa g g r e g a t i o np a r a f f i ne m b e d d i n gt e c h n i q u e t od e t e c tn e s t i n i mm u n o h i s t o - c h e m i c a l s t a i n i n g i nn e u r o s p h e r e s . M e t h o d s S t e mc e l l ss e p a r a t e df

6、r o mt h eh i p p o c a m p u so f1 7do l dr a t f e t u s w e r e c u l t u r e di nv i t r o. N e s t i ns t a i n i n go nc e l l s i n s i d en e u r o s p h e r e sw e r ed e t e c t e db y i mm u n o h i s t o c h e m i s t r y . R e s u l t s A l ln e u r o s p h e r e s i nc u l t u r ew e r

7、 ep o s i t i v e l ys t a i n e df o rn e s t i n. B u t t h ep o s i t i v er a t ea n dp o s i t i v e s i t eo fn e u r o s p h e r e sw e r ed i f f e r e n t . C o n c l u s i o n T h i s t e c h n i q u eh a dt h ea d v a n t a g eo fd e t e c t i n gc e l l sn e s t i n e x p r e s s i o n i

8、 n s i d en e u r o s p h e r e s . I tm a yc o n t r i b u t e t os u p p l ye x a c t i n f o r m a t i o n s f o ro p t i m i z i n g t h e c e l l c u l t u r e t e c h n i q u e . K e yw o r d s: n e u r a l s t e mc e l l s; n e u r o s p h e r e s; n e s t i n 干细胞(s t e mc e l l) 是高度未分化的, 具有多

9、向分 化潜能和自我更新能力的一类细胞。在成体哺乳动 物体内, 存在2个持续一生产生新神经元的皮质区 域, 即海马和嗅球。在这些大脑的特定区域, 存在内 源性的神经干细胞( n e u r a ls t e mc e l l s,N S C) 。大脑 来源的神经干细胞在体外适当的培养条件下和有丝 分裂原(E G F/F G F) 存在下, 能够不断分裂增殖, 形 成神经球 1,2。在发展成神经球的过程中, 神经干细 胞经历了多次对称性细胞分裂, 每次循环, 产生2个 新的神经干细胞, 但神经球中同时存在不对称性细 胞分裂, 不是所有子代细胞都是干细胞, 有些细胞发 生了自发分化 3。本文对胚胎大

10、鼠海马来源的神经 干细胞进行体外培养和扩增, 应用细胞团石蜡包埋 技术, 鉴定神经球中神经干细胞标记物中间丝巢蛋 白( n e s t i n) 的存在及比例, 以了解培养的神经球中神 经干细胞存在的比例, 以及体外条件下神经干细胞 增殖的特点和条件, 并可作为优化培养技术的实验 基础。 材料与方法 材料 孕1 7d的健康S D大鼠, 清洁级, 中国医 学科学院上海斯来克实验动物有限责任公司提供, 生产许 可 证 号:S C X K( 沪)2 0 0 3-0 0 0 3。DMEM/ F 1 2培养基和B 2 7由G i b c o公司提供; 人碱性成纤维 细胞生长因子(b a s i cf i

11、 b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r,b F - 207 N o . 7 许 勤, 等:神经球石蜡包埋和巢蛋白免疫组化染色 G F) 和人表皮生长因子(e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r, E G F) 由S i g m a公司提供; 抗巢蛋白抗体由C h e m i - c o n公司提供。 分离神经干细胞 取孕1 7d的S D大鼠, 颈椎 脱臼处死, 严格无菌条件下取出胚胎, 解剖显微镜下 分离出脑组织, 取海马组织, 用P B S - G冲洗, 0. 1 2 5% 胰蛋白酶/0. 0 2 ME D TA消

12、化数分钟, 吸管吹打粉碎 组织, 用含1 0%小牛血清的P B S - G中和, 离心,P B S - G洗3次,2 0 0目筛网过滤获得单细胞悬液, 接种于 N 2(DMEM/F 1 2、B 2 7、b F G F、E G F、 谷氨酰胺、 青链 霉素) 培养液中。 细胞培养 原代细胞种植于培养板中, 71 0d 后用无菌注射器吹打, 机械分离传代, 每周换液2 次, 约7d传代一次。 神经球石蜡包埋 取一孔培养的神经球, 离心 去上清, 4%多聚甲醛固定,7 0%、8 0%、9 5%和1 0 0% 梯度乙醇脱水, 石蜡包埋。 神经球抗n e s t i n免疫组化检测 神经球的石蜡 切片经

13、脱蜡和抗原修复, 用3%H2O 2和3%B S A处 理, 加抗n e s t i n单抗4 过夜,P B S洗3次, 加二抗 ( 二步法,A n t i b o d y公司提供) 3 0m i n,P B S洗3次, D A B显色1 0m i n, 苏木素复染, 梯度乙醇脱水, 二甲 苯透明, 中性树脂封片, 显微镜(O L YMP U S) 下观 察。 结 果 神经干细胞的增殖能力 原代培养细胞为小圆 形细胞, 分散于培养板底部。3d后细胞分裂聚集成 球, 悬浮生长, 称为神经球( 图1) 。神经球随培养时 间延长而逐渐增大, 至71 0d, 每个细胞团细胞数 可达数十至数百, 部分细胞

14、团贴壁, 细胞团周围有形 态不规则的、 带突触的细胞爬出。细胞团的贴壁与 细胞团大小无关。神经球经机械分离, 能多次传代 并维持增殖约6倍状态1 2月。 图1 培养中的神经干细胞 2 0 0 F i g1 N e u r a l s t e mc e l l s i nc u l t u r e 2 0 0 神经球的抗n e s t i n免疫组化染色 不同大小和 不同代的神经球均显示n e s t i n阳性表达( 图2) , 但阳 性细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较大差 异。随着所传代数增加, 阳性率高的细胞团数减少; 大神经球的阳性细胞多位于球的表面; 中小神经球 中阳性细胞率相对

15、较高; 每个神经球的阳性率从 2 0%9 0%不等。 图2 神经球的n e s t i n免疫组化染色 4 0 0 F i g2 N e s t i n i mm u n o h i s t o c h e m i c a l s t a i n i n go nn e u r o s p h e r e s 4 0 0 A:s m a l l a n dm i d d l en e u r o s p h e r e s;B:b i gn e u r o s p h e r e s . 讨 论 神经干细胞鉴定的重要指标之一是中间丝巢蛋 白的存在, 巢蛋白是哺乳动物中枢神经系统干细胞 的骨架蛋

16、白, 它的表达起始于神经板形成的早期, 随 神经细胞的分化而逐渐消失, 因此, n e s t i n是神经干 细胞的特异性标志。成体哺乳动物神经系统如海 马、 室管膜和脑室下区存在神经干细胞, 并且能体外 扩增和分化的事实已见于国内外的报道 46。本研 究分离的胚胎大鼠海马来源的神经干细胞在体外培 养中, 也显示了其很强的增殖能力。在此基础上, 我 307 上 海 第 二 医 科 大 学 学 报 V o l . 2 5 们应用细胞团石蜡包埋技术, 对培养的神经球进行 了抗n e s t i n免疫组化检测, 以鉴定神经球内部具有 神经干细胞属性的细胞。结果显示, 在相同培养条 件下, 在不同

17、大小和不同代的神经球中, n e s t i n阳性 表达的细胞比例和细胞团中阳性细胞所处部位有较 大差异。首先, 培养早期( 约1 3代) 形成的中等大 小神经球( 数十至数百个细胞) ,n e s t i n阳性表达 5 0%, 阳性细胞的分布无一定规律, 有弥散分布, 也 有相对集中分布, 而后期这种n e s t i n阳性表达高的 神经球进一步减少, 证实在特定培养条件下, 神经干 细胞是通过对称分裂和( 或) 不对称分裂方式不断增 殖, 即至少一个子代细胞保留干细胞属性, 部分细胞 发生了不同程度的分化。聚集成的神经球中可含有 神经干细胞, 正在分化的前体细胞和已分化的神经 元和神

18、经胶质细胞。这也可以解释神经干细胞在传 代过程中有大量死亡的原因, 当神经球被分离成单 个细胞时, 只有神经干细胞能继续呈指数增殖, 其他 分化细胞迅速死亡。其次, 较大神经球( 数千细胞) 的阳性细胞多位于球的表面, 其相对阳性细胞比例 较低, 提示大神经球的内部细胞可能接触不到培养 基中用以维持神经干细胞不分化的细胞因子, 出现 自发分化。因此, 神经球大并不能代表其具有更多 的神经干细胞, 在体外培养中必需及时传代, 避免形 成较大神经球, 以维持神经干细胞的不分化状态。 同时这个结果也显示, 与以往的神经球n e s t i n免疫 荧光染色相比较, 免疫荧光方法是将整个神经球与 n

19、e s t i n结合, 仅反映了神经球表面细胞的n e s t i n表 达, 不能检测神经球内部的n e s t i n表达。而我们的 方 法 能 通 过 连 续 切 片, 更 全 面 地 检 测 神 经 球 的 n e s t i n表达。 应用细胞团的石蜡包埋技术, 可检测神经球内 部细胞的n e s t i n表达, 全面了解培养中神经干细胞 存在的比例, 掌握神经干细胞在体外特定条件下增 殖的条件和特点, 为优化培养技术提供实验基础。 【 参考文献】 1J o h a n s s o nC B,S v e n s s o n M,W a l l s t e d tL,e ta l.

20、N e u r a ls t e m c e l l s i nt h ea d u l th u m a nb r a i nJ. E x pC e l lR e s,1 9 9 9,2 5 3(2) : 7 3 3-7 3 6. 2T e m p l eS,A l v a r e z - B u y l l aA.S t e mc e l l si na d u l tm a mm a l i a n c e n t r a ln e r v o u ss y s t e mJ. C u r rO p i nN e u r o b i o,1 9 9 9,9(1) : 1 3 5-1 4

21、1. 3G a l l iR,G r i t t iA,B o n f a n t iL,e t a l. N e u r a l s t e mc e l l s:a no v e r - v i e wJ. C i r cR e s,2 0 0 3,9 2(6) :5 9 8-6 0 8. 4G r i t t iA,B o n f a n t iL,D o e t s c hF,e t a l.M u l t i p o t e n t n e u r a l s t e m c e l l sr e s i d e i n t ot h er o s t r a l e x t e n

22、 s i o na n do l f a c t o r yb u l bo f a d u l t r o d e n t sJ. JN e u r o s i c,2 0 0 2,2 2(2) :4 3 7-4 4 5. 5D a a d iMM.I nv i t r oa s s a y sf o rn e u r a ls t e mc e l ld i f f e r e n t i a t i o n J. M e t h o d sM o lB i o l,2 0 0 2,1 9 8:1 4 9-1 5 5. 6D u i t t o zAH,H e v o rT.P r i m

23、 a r yc u l t u r eo fn e u r a lp r e c u r s o r s f o r mt h eo v i n ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m(C N S) J. JN e u r o s c i M e t h o d s,2 0 0 1,3 0;1 0 7(1-2) :1 3 1-1 4 0. 【 收稿日期】2 0 0 5-0 1-2 4【 修回日期】 = = = = ( ( ( ( 2 0 0 5-0 4-0 7 巴德年院士受聘我校名誉教授 6月1 5日下午, 在主题为“ 生命科学新时代医学” 报告会上, 中

24、国工程院院士、 浙江大学医学院院长、 博士生导师巴德年教授受聘我校名誉教授。校党委副书记黄红在受聘仪式上简要介绍了巴德年院士的 学术成就, 校长沈晓明为其颁发证书并佩戴校徽。 巴德年院士1 9 6 2年毕业于哈尔滨医科大学医学系, 1 9 6 8年研究生毕业于北京医科大学生物化学专 业, 1 9 8 2年在日本北海道大学癌症研究所获得博士学位。曾任黑龙江肿瘤研究所副所长、 所长, 哈尔滨医 科大学副校长, 黑龙江省医学科学院院长, 中国驻日本大使馆教育参赞等。1 9 9 2年出任中国医学科学院 院长, 中国协和医科大学校长, 1 9 9 4年当选中国工程院院士,1 9 9 9年当选为美国国家科学院医学部外籍 院士。现任浙江大学医学院院长、 中华医学会副会长、 中国免疫学会名誉理事长、 国务院学位委员会委 员、 中国工程院管理学部常务委员, 并担任 中华医学杂志 等多种国家级杂志的主编常委等工作。 407