稳定转染DICER基因对HELF细胞功能的影响.pdf

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1、2 0 1 0 年4 月 第2 0 卷第4 期 中国比较医学杂志 C H I N E S EJ O U R N A LO FC O M P A R A T I V EM E D I C I N E A p r i l ，2 0 1 0 V 0 1 2 0N o 4 稳定转染D i c e r 基因对H E L F 细胞功能的影响 何琳1 ”，王禄增1 ，郑志红1 ( 1 中国医科大学实验动物部辽宁省实验动物转基因重点实验室， 2 中国医科大学附属第四医院中心实验室，沈阳1 1 0 0 0 1 ) 【摘要】目的观察正常人胚肺成纤维细胞( H E L F ) 在稳定转染D i c e r 基因后增

2、殖能力及迁移能力的变化。 方法应用脂质体介导方法转染D i c e r 基因表达载体于H E L F 细胞，G 4 1 8 筛选，P C R 检测整合情况，R T P C R 检测 表达情况，W e s t e r n b l o t 检测蛋白表达水平，确定稳定转染细胞株，M T r 方法检测细胞增值能力，T r a n s w e l l 方法检测 细胞迁移能力。结果D i c e r 基因稳定转染H E L F 细胞系建立，用R T P C R 和W e s t e r n - b l o t 方法检测刭D i c e r 基因 m R N A 和蛋白表达水平都明显增强。与转染空载体的H

3、E L F 细胞相比，转染D i c e r 基因的H E L F 细胞4 8 、7 2 、9 6h 的 M T T 光吸收值明显升高( P 0 0 5 ，无 统计学意义。 1 ：H E L F 细胞D i c e r 蛋白的表达；2 ：p c D N A3 1 转染组D i c e r 蛋 白的表达：3 ：p c D N A3 1 - D i c e r 转染组D i c e r 蛋白的表达。 注：转染空载体p c D N A 3 1 的H E L F 细胞与转染p c D N A 3 I D i c e r 质粒的H E L F 细胞之间比较，P 0 0 5 ；转染空载体p c D N A

4、 3 1 的H E L F 细胞与正常H E L F 细胞之间比较。P = 0 2 1 。本实验 重复3 次，结果一致。 l ：P r o d u c to fD i c e rp r o t e i ni nH E L Fc e l l s ；2 ：P r o d u c to fD i c e r p r o t e i ni nc e l l st r a n s f e c t s db yp c D N A3 I ； 3 ：P r o d u c to fD i c e r p r o t e i ni nc e l l st r a n s f e c t e db yp c D

5、N A3 I D i c e r N o t e ：C o m p a r i s o no ft h eH E L Fc e l l st r a n s f e c t e db yp c D N A3 1w i t h t h eH E L Fc e l l st r a n s f e c t e d b yp c D N A3 1 D i c e r P 0 0 5 C o m p a r i s o no ft h eH E L Fc e i l st r a n s f e c t e db yp c D N A3 1w i t ht h e n o r m a lH E L F

6、c e D s P = 0 2 1 T h ee x p e r i m e n tw r e p e a t e dt h r e e t i m e sa n dt h e r e s u l t sw e r ec o n s i s t e n t 图3W e s t e r nb l o t 检测在稳定转染H E L F 细胞中D i c e r 蛋白表达 F i g 3 T h eD i c e r p r o t e i ne x p r e s s i o nd e t e c t e db y W e s t e r nb l o t 2 4M T T 检测结果 转染p c

7、D N A3 1 D i c e r 质粒的H E L F 细胞的 M ，I I 光吸收值在4 8 、7 2 、9 6h 显著高于p c D N A3 1 空载体组( P 0 0 5 ) ，提示将p e D N A3 1 一D i c e r 质 粒转染H E L F 后，使H E L F 细胞生长率逐渐增加，说 明D i c e r 基因表达水平上调能使H E L F 细胞生长增 殖速度加快( 图4 ，表1 ) 。 善 娶 督 紫 注：1 ，0h ；2 ，2 4h ；3 ，4 8 h ；4 ，7 2 h ；5 ，9 6h 转染p c D N A 3 I D i c e r 质粒 组与转染p

8、c D N A 3 I 空载体组比较尸 O 0 5 N o t e ：I ，Oh o u r ；2 ，2 4h o u r s ；3 。4 8h o u r s ；4 ，7 2h o u r s ；5 ，9 6h o u r sT h e c o m p a r i s o no ft h eH E L Ft r a n s f e c t e db yp c D N A 3 1 - D i c e rw i t ht h eH E L F t r a n s f e c t e db yp c D N A 3 1 P 0 0 5 图4 三组细胞不同时间点的M T T 光吸收值检测细胞增殖 变

9、化趋势的差异 F i g 4T h eM I To p t i c a la b s o r b a n e ea td i f f e r e n tt i m e st od e t e c t t h ep r o l i f e r a t i o nt r e n di nc e l l so ft h et h r e eg r o u p s 2 5 T r a n s w e l l 检测结果 转染p c D N A 3 1 - D i c e r 质粒的H E L F 细胞比转 染空载体p c D N A3 1 的H E L F 细胞和普通H E L F 细 胞穿透人工重构基

10、底膜的细胞数明显增多( 图6 ，见 彩插4 ) ，用平均穿膜细胞数标化成相对数后进行统 计作图( 图5 ) 。由图5 可见，转染p c D N A3 1 D i c e r 质粒的H E L F 细胞穿膜细胞数为1 9 8 5 4 7 5 ，而 未转染组H E L F 细胞和转染空载体p c D N A 3 1 的 H E L F 细胞分别为2 7 5 0 6 3 0 和2 6 8 8 5 2 4 ，质 粒p c D N A 3 1 一D i c e r 转染的H E L F 细胞与空载体 p c D N A 3 1 转染的H E L F 及H E L F 细胞比较，穿膜细 胞数有显著增多。转

11、染p c D N A3 1 D i c e r 组与未转 染组、转染体空载体p c D N A 3 1 组比较，差异具有统 计学意义( P 0 0 5 ) 。 3 讨论 D i c e r 是R N Am 家族的成员之一，其定位在 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年4 月第2 0 卷第4 期C h i nJC o m p M e d ，A p r i l2 0 1 0 。V 0 1 2 0 N o 4 2 5 0 2 0 0 巅1 5 0 壁 耋1 0 0 钕 5 0 O 歹，矿 爹 注：质粒p c D N A 3 1 D i c e r 转染的H E L F 细胞、空载体p c D

12、 N A 3 1 转 染的H E L F 及H E L F 细胞穿过人工重构基底膜细胞数的差异。转 染p c D N A 3 1 - D i c e r 质粒组与转染p c D N A 3 1 空载体组比较P 0 0 5 N o t e ：T h ed i f f e r e n c ei nt h en u m b e r so fc e l l sp e n e t r a t i n gt h r o u g ht h e b a s e m e n tm e m b r a n ea m o n gt h eH E L Fc e U st r a n s f e c t e db yp

13、 c D N A 3 I D i c e r ，n o r m a lH E L Fc e l l sa n dH E L Fc e l l st r a n d e c t e db yp c D N A 3 1 C o m p a r i s o no ft h eH E L Fc e H st r a n s f e c t e db yp c D N A3 I - D i c e rw i t h t h et h eH E L Fc e l l st r a n s f e c t e db yp c D N A 3 1 P 0 0 5 图5T r a n s w e l l 实验结

14、果 F i g 5 R e s u l t so fT r a n s w e l lc h a m b e ra s s a y 1 4 q 3 2 1 3 ，主要存在于细胞质，是m i R N A 成熟所必 需的酶。D i c e r 与其酶切产物之一m i R N A 及其他蛋 白质形成核酸蛋白复合物在多种生物过程中起调 节作用，包括细胞增殖、分化、凋亡、死亡等。有研 究发现许多疾病的形成尤其是肿瘤的发生与D 池r 基因表达异常密切相关。研究显示，在有些肿瘤组 织中D i c e r 基因起到抑癌基因的作用，其表达水平下 调，如：在非小细胞肺癌中D i c e r 基因表达水平下调， 引

15、起l e t - 7 表达下调，并与预后正相关”6 1 ；在卵巢癌 中D i c e r 基因表达水平下调o 。有些肿瘤组织中 D i c e r 基因起到原癌基因的作用，其表达水平上调， 如：在肝癌和前列腺癌中D i c e r 基因表达水平 上调8 t 引。 根据前人研究结果可以看出D i c e r 基因在不同 的肿瘤中表达水平不一致。为了进一步了解D i c e r 基因表达上调在肿瘤细胞异常增殖及侵袭转移过 程中的作用机制，我们应用脂质体介导的转染方法 制备了D i c e r 基因高表达的细胞模型。通过用M ，兀 实验绘制生长曲线，发现转染p c D N A3 1 - D i c

16、e r 质 粒的H E L F 细胞较转染空载体p c D N A 3 1 的H E L F 细胞生长速度明显加快( P 0 0 5 ) ，说明D i c e r 基因 表达增加能使H E L F 细胞生长增殖速度加快，提示 D i c e r 基因表达增加可能会使细胞产生恶性转化的 趋势；同时本研究将稳定转染的细胞和正常细胞分 别接种于T r a n s w e l l 小室的上室，通过在显微镜下观 察计数穿过人工重构基底膜的细胞数测定H E L F 细 胞迁移能力的变化，发现转染p c D N A3 1 一D i c e r 质 粒的H E L F 细胞比转染空载体p c D N A 3

17、1 的H E L F 细胞和普通H E L F 细胞穿过人工重构基底膜的细胞 数明显增多( P 0 0 5 ) ，说明D i c e r 基因的表达增加 能使H E L F 细胞的体外侵袭和迁移能力有所增强， 这些与以往的报道是一致的。有研究显示D i c e r 基 因定位在人染色体1 4 q 3 2 1 3 ，而这一位点正是最常 见的引起肺腺癌的突变位点0 。，当D i c e r 基因表达 增加时，引起该位点突变，从而引起细胞恶性转化： 使细胞增值速度加快，侵袭和迁移能力增加。还有 研究显示D i c e r 的酶切产物之一m i R N A 与人类肿瘤 发生密切相关，在B 细胞淋巴细胞

18、瘤中D i c e r 基因 表达增加，引起m i R 1 7 9 2 簇m i R N A 经常被扩增， H e 和O D o n n e l l 等人H u 发表的论文描述：在B 细 胞淋巴瘤中常常有1 3 q 3 1 位点的扩增，而在这一扩 增区域的唯一基因就是C 1 3 0 f f 2 5 。C 1 3 0 f f 2 5 基因的 第3 内含子编码一个非编码蛋白的R N A 基因，m R 一 1 7 - 9 2 。H e 分析了具有1 3 q 3 1 扩增的细胞系的1 9 1 个m i R N A s ，发现其中有6 个m i R N A s 的表达增加， 其中5 个属于m R 一1

19、7 9 2 基因簇，研究还发现许多B 细胞淋巴瘤组织m i R N A 一1 7 的前体表达增加，并且 他们通过对比过表达M y c 和m i R 一1 7 - 9 2 m i R N A 基因 的淋巴瘤与仅有M y c 过表达的肿瘤细胞进行比较， 发现前者具有更强的增殖能力，说明m R 1 7 9 2 m i R N A 簇的过表达与M y c 协同作用加快了肿瘤 的发生。以上研究结果也说明D i c e r 基因表达增加， 引起具有癌基因功能的m i R N A 表达上调可能是肿 瘤形成的原因之一。但D i c e r 基因具体的作用机制 尚不十分清楚，为此我们将在转基因小鼠的动物模 型上

20、进一步对D i c e r 基因的功能及作用机制进行 研究。 参考文献： L e eY 。A h nC ，H a r tJ ，e ta LT h en u c l e a rR N a s e D r o s h a i n i t i a t e sm i c m R N Ap r o c e s s i n g J N a t u r e 。2 0 0 3 4 2 5 ：4 1 5 4 1 9 L u n dE ，G u t t i n g e rS ，C a l a d oA ，e ta 1 N u c l e a re x p o r to f m i c r o R N Ap r e

21、 c u r s o r s J S i n e n c e ，2 0 0 4 。3 0 3 ：9 5 9 8 K i d n e rC A 。M a r t i e n s s e nR A M a c r oe f f e c to fm i c r o R N A si n p l a n t s 【J T r e n d sG e n e t ，2 0 0 3 ，1 9 ：1 3 1 6 B a r r e lD P M i c r o R N A s ：C , e n o m i c s ，b i o g e n e s i s ，m e c h a n i s m ，a n d f

22、 u n c t i o n J C e l l 2 0 0 4 1 1 6 ：2 8 1 2 9 7 Y a n a i h a r aN ，C a p l e nN ，B o w m a nE ，e ta 1 U n i q u em i e r o R N A 血 - 血 一 扇阻 ，；1J l 2 3 4 5 r L r L ； 万方数据 中国比较医学杂志2 0 1 0 年4 月第2 0 卷第4 期C h i nJC o m pM e d ，A p r i l2 0 1 0 ，V 0 1 2 0 N o 4 5 5 ( 上接第3 6 页) 转基因猪或基因敲除猪奠定良好基础。 参考文献：

23、 2 3 4 5 C o c k r e l lA S ，K a f r iT G e n ed e l i v e r yb yl e n t i v i m sv e c t o r s J M o lB i o t e c h n 0 1 2 0 0 7 ，3 6 ( 3 ) ：1 8 4 2 0 4 6 顾为望，刘运惠，唐小江，等西藏小型猪血液生理生化指 标的初步研究 J 中国实验动物学报，2 0 0 7 ，1 5 ( 1 ) ：6 0 6 3 L o i sC ，H o n gE J 。P e a s eS ，e ta 1 G e r m l i n et r a n s m i s

24、 s i o na n d t i s s u e s p e c i f i ce x p r e s s i o no ft r a n s g e n e sd e l i v e r e db yl e n t i v i r a l v e c t o r s J S c i e n c e ，2 0 0 2 ，2 9 5 ( 5 5 5 6 ) ：8 6 8 8 7 2 贾俊双，孙妍，肖东，等慢病毒介导的外源基因体外投递 系统的建立 J 热带医学杂志，2 0 0 8 ，8 ( 1 0 ) ：1 0 2 8 1 0 2 9 ，1 0 3 7 V o d i c k aP ，S m e

25、 t a n aK J r ，D v o r d n k o v 6B 。e ta 1 T h em i n i a t u r e p i g a na n i m a lm o d e li nb i o m e d i c a lr e s e a r c h 。 J A n nNY A e a dS e i ，2 0 0 5 ，1 0 4 9 ：1 6 1 7 1 申红芬。姚志芳，贾俊双，等诱导性多潜能干细胞( i P S c e l l s ) ：现状及前景展望 J 生物化学与生物物理进展， 2 0 0 9 ，3 6 ( 8 ) ：9 5 0 9 6 0 ( 修回日期) 2 0 0

26、9 - 1 2 - 2 8 ( 上接第3 9 页) 明显增高，从而产生大量的H M G B l 参与了V I L I 的 5 】 发生，但其具体作用机制还有待进一步研究。 参考文献： 1 T r e m b l a yL N ，S l u L s k y A S V e n t i l a t o r - i n d u c e di n j u r y ：f r o m 6 b a m t r a u m a st ob i o t r a u m a J P r o sA s s o cA mP h y s i c i a n s 。1 9 9 8 ， 1 1 0 ：4 8 2 4 8 8

27、 S l u s m k yA S ，I m x iY V e n t i l a t o r - i n d u e e dl u n gi n j u r y ，c y t o k i n e s ， P E E P ，a n dm o r t a l i t y ：i m p l i c a t i o nf o rp r a c t i c ea n df o rc l i n i c a l 城8 h J I n t e n s i v eC a r eM e d ，2 0 0 3 。2 9 ( 8 ) ：1 2 1 8 1 2 1 9 B r a d l e yP P ，P r i

28、 e b a tD A ，C h r i s t e n s e nR D ，e ta 1 M e a s u r e m e n to f c u t a n e o u si n f l a m m a t i o n ：e s t i m a t i o no fn e u t r o p h i lc o n t e n tw i t h e n z y m em a r k e r J JI n v e s tD e r m a t o l ，1 9 8 2 ，7 8 ：2 0 6 2 0 9 T e n e n b a u mT 。E s s m a n nF ，A d a mR

29、，e ta 1 C e l ld e a t h ，c a s p a s e a c t i v a t i o n ，a n dH M G B Ir e a l e a s eo fp o r c i n ec b o m i dp l e x u s e p i t h e l i a lc e l l sd u r i n gS t r e p e o e o c c u ss u i si n f e c t i o ni nv i t r o J 】 【7 8 B r m n R e s ，2 0 0 6 1 1 0 0 ( 1 ) ：1 1 2 d eO l i v e i r

30、aF M ，d eA b r e ud aS i l v aI C ，R u m j a n e kF D ，e ta 1 C l o n i n gt h eg e n e sa n dD N Ab i n d i n gp r o p e r t i e so fh i s hm o b i f i t y g r o u pB I ( H M G B l ) p r o t e i n sf r o mt h eh u m a nb l o o df l u k e s S c h i s t o s o m am a n s o n ia n dS c h i s t o s o m

31、aj a p o n i c u m J G e n e ， 2 0 0 6 ，3 7 7 ：3 3 4 5 W a n gH ，B l o o m0 ，Z h a n gM ，e ta 1 H M G B - 1a sal a t em e d i a t o r o f e n d o t o x i nl e t h a l i t yi nm i c e J S c i e n c e ，1 9 9 9 。2 8 5 ( 5 4 2 5 ) ： 2 4 8 2 5 1 A b r a h a mE A r c a r o l iJ ，C a r m o d yA ，e ta I H M

32、 G B ，1S 8a m e d i a t o ro f a c u t el u n gi n f l a m m a t i o n J JI m m u n o l ，2 0 0 0 ，1 6 5 ( 6 ) ：2 9 5 0 2 9 5 4 L i n d e r s s o nE K ，H o j m pP ，G a iW P ，e ta 1 a l p h a s y n u c l e i n f i l a m e n t 8b i n dt h et r a n s c r i p t i o n a lr e g u l a t o rH M G B 1 J N e u

33、 r o r e p o r t 2 0 0 4 ，1 5 ( 1 8 ) ：2 7 3 5 2 7 3 9 【修回日期 2 0 1 0 0 1 1 0 ，J 1 J 1 J 2 3 4 r L r L r L 万方数据 周娜，等盐酸氨溴索联合布地奈德对致敏大鼠气道炎症及肺组织氧化应激水平的影响f 正文见第4 6 页 Z H O UN a ，e ta 1 T h eE f f e c to fA m b r o x o lH y d r o c h l o r i d eC o m b i n e dw i t hB u d e s o n i d eS u s p e n s i o no

34、nA i r w a y I n f l a m m a t i o na n dO x i d a t i v eS t r e s si nR a t sw i t hA s t h m a ( F u l lt e x to np a g e4 6 ) 图1 正常对照组大鼠肺组织( H E ) F i g 1 T h eh i s t o l o g yo fl u n gt i s s u ei nan o r m a lr a t ， H Es t a i n i n g 图3B U D 组肺组织( H E l F i g 3 T h eh i s t o l o g yo fl u

35、 n gt i s s u ei nar a to ft h e B U D g r o u p H Es t a i n i n g 图2 致敏组大鼠肺组织( H E ) F i g 2T h eh i s t o l o g yo fl u n gt i s s u ei nar a to ft h e a l l e r g i z e dg r o u p H Es t a i n i n g 图4A M B + B U D 组肺组织( 旺) F i g 4 T h eh i s t o l o g yo fl u n gt i s s u ei nar a to ft h e B U

36、 D + A M Bg r o u p H Es t a i n i n g 何琳。等稳定转染D i c e r 基因对H E L F 细胞功能的影响 H EL i n ，e ta 1 E f i e c to fS t a b l eT r a n s f e c t i o no fD i c e rG e n eo nt h eF u n c t i o no fH u m a n E m b r y o n i cL u n gF i b r o b l a s t s ( 正文见第5 0 页) ( F u l lt e x to np a g e5 0 ) l ：未转染H E L F

37、 细胞；2 ：p c D N A 3 1 转染组；3 ：p c D N A 3 ，l D i c e r 转染组。 图6T r a n s w e l l 实验检测稳定转染的H E L F 细胞穿过人工重构基底膜的差异 1 ：N o r m a lH E L Fc e l l s ；2 ：I - I E L Fc e l l st r a n s f e c t e db yp c D N A3 1 ：3 ：H E L Fc e l l st r a n s f e c t e db yp c D N A3 I D i c e r F i g 6 D i f f e r e n c e si nt h en u m b e r so fc e l l sp e n e t r a t i n gt h r o u 曲t h eb a s e m e n tm e m b r a n e ，d e t e c t e db yT r a n s w e l lc h a m b e ra s s a y 。