糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经退行性病变的观察.pdf

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1、基础论著 糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区 神经退行性病变的观察 卢艳 盛树力 【 摘要】 目的 动态观察糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经营养因子和神经胶质纤维酸性 蛋白(G F A P) 的表达, 分析其靶组织神经元的改变和神经营养因子的变化与视网膜神经元变性的关 系。 方法 建立糖尿病模型后1周,2周,1月, 分别用4%多聚甲醛心脏灌注大鼠, 断头取顶盖, 冰 冻切片, 免疫组化检测糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区脑原性神经营养因子(B D N F) , 神经生长因 子(NG F) 和G F A P的改变。实验中设正常对照(N C) 组。 结果 与N C组比较, 糖尿病1周大鼠顶 盖前区B

2、D N F、NG F表达减少; 糖尿病2周大鼠顶盖前区胶质细胞和细胞内NG F A P表达增加。 结 论 糖尿病早期视网膜靶组织顶盖前区神经细胞即已出现损害, 神经营养因子表达减少, 糖尿病早期 视网膜靶组织顶盖前区神经退行性病变可能是糖尿病早期视网膜神经元变性的原因之一。 【 关键词】 糖尿病;视网膜靶组织;神经变性疾病;神经营养因子 T h en e u r o d e g e n e r a t i o no fp r e t e c t a l a r e a i nt h e e a r l y s t a g eo fd i a b e t e s L UY a n,SHENGS

3、h u - l i.O p h - t h a l m o l o g yD e p t.,X u a n w uH o s p i t a l,C a p i t a lU n i v e r s i t yo f M e d i c a lS c i e n c e s,B e i j i n g1 0 0 0 5 3, C h i n a C o r r e s p o n d i n ga u t h o r:E - m a i l l o u i s e l u 1 6 3 b j.c o m 【A b s t r a c t】 O b j e c t i v e T oa n a

4、l y z e t h ee x p r e s s i o no fB D N F,NG F,G F A Pi nW i s t a rr a tp r e t e c t e l a r e aa n dd e t e r m i n e t h er e l a t i o nb e t w e e nn e u r o nd a m a g ea n dn e u r o t r o p h i nc h a n g eo fp r e t e c t a l a r e aa n d r e t i n a l n e u r o d e g e n e r a t i o n i

5、nt h ee a r l ys t a g eo fd i a b e t e s . M e t h o d s M a l eW i s t a rr a t sw e i g h i n ga b o u t 2 0 0gw e r eu s e d t oc r e a t ed i a b e t i c a n i m a lm o d e l b y i n j e c t i n gS T Z.W i s t a r r a t sw e r ek i l l e db yh e a r t p e r - f u s i o nw i t h4% F D Pa t 1 -

6、w e e k,2 - w e e ka n d1 - m o n t ha f t e rd i a b e t e s . T h ed i s s e c t e dp r e t e c t a l a r e aw a s u s e dt od e t e r m i n e t h ee x p r e s s i o no fB D N F,NG Fa n dG F A Pw i t hi mm u n o h i s t o c h e m i s t r y . R e s u l t s I np r e t e c t a l a r e ao f d i a b e

7、t i c r a t,t h e e x p r e s s i o no fB D N Fa n dNG Fb e g a n t od e c r e a s e f r o m1 - w e e kDM, t h ee x p r e s s i o no fG F A Pb e g a n t o i n c r e a s e f r o m2 - w e e kDM. C o n c l u s i o n s T h e r e a r en e u r o nd a m a g e a n dn e u r o t r o p h i nd e c r e a s e i n

8、t h ep r e t e c t a la r e ai nt h ee a r l ys t a g eo fd i a b e t e s .N e u r o d e g e n e r a t i o na n d n e u r o t r o p h i nd e c r e a s e i np r e t e c t a l a r e a,w h i c hi st h et a r g e t t i s s u eo fr e t i n a,m i g h tb eo n eo f t h er e a - s o n sr e s u l t i n g i nr

9、 e t i n a ln e u r o d e g e n e r a t i o na t t h ee a r l ys t a g eo fd i a b e t e s . 【K e yw o r d s】 D i a b e t e s;T a r g e t t i s s u e,r e t i n a l;N e u r o d e g e n e r a t i v ed i s e a s e s;N e u r o t r o p h i c f a c t o r S T Z引起的糖尿病动物模型存在广泛的神经 元退行性病变 1,2。越来越多的研究表明糖尿病早 期,

10、视网膜微血管尚未出现病理改变, 视网膜神经元 即已出现退行性病变 3 - 8, 但是其发生、 发展的原因 至今尚不清楚。脊椎动物神经系统在其生长发育过 程中, 神经细胞必须和其靶组织建立正常的突触联 系, 不断地从靶组织获得神经营养因子(N F) , 才能 维持其生存和正常的生理功能。中脑顶盖前区是视 基金项目: 国家9 7 3项目资助(G 2 0 0 0 5 7 0 1) 作者单位:1 0 0 0 5 3 首都医科大学宣武医院眼科( 卢艳) , 神经生 化室(盛树力) 网膜靶组织, 对维持视网膜神经元的正常结构和功 能起有重要作用。本研究通过糖尿病大鼠模型, 动 态观察糖尿病早期视网膜靶组织

11、顶盖前区脑原性神 经营养因子(B D N F) 、 神经生长因子(NG F) 和神经 胶质纤维酸性蛋白(G F A P) 的变化。 材料与方法 一、 动物模型制备 体重为2 0 0g左右的成年雄性W i s t a r大鼠( 首 都医科大学动物实验室提供) 6 0只, 随机分为正常 对照(N C) 组和糖尿病模型(DM) 组, 实验前禁食 1 2h, 自由饮水。 921 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 N C组于1周、2周、1个月时给大鼠一次性腹 腔注射0. 0 5

12、m o l/L柠檬酸缓冲液( p H4. 5) 。DM 组: 将S T Z溶于0. 0 5 m o l/L柠檬酸缓冲液 ( p H 4 . 5) , 配成1 0m g/m l溶液, 按6 0m g/ k g 腹腔注射。 2 4h后剪尾采血, 用ON ET OU CH( 中国强生公司) 血糖仪测血糖, 用强生尿糖试纸测尿糖浓度, 血糖浓 度达1 5mm o l/L, 尿糖达+即为模 型建立成功。以后每周及处死大鼠前各测血糖、 尿 糖一次。 二、 免疫组化检测 分别于DM模型建立后1周、 2周、1个月, 用 4%多聚甲醛心脏灌注, 断头取顶盖前区置入3 0% 蔗糖- 4%多聚甲醛内固定, 冰冻切片

13、。免疫组化检 测B D N F、NG F、G F A P的表达。实验中设空白对 照。 1 .细胞计数: 每只大鼠取5张切片, 每张切片 于4 0倍高倍镜下随机选3个视野, 计数每个视野的 B D N F、NG F、G F A P阳性细胞数, 求平均阳性细胞 数/视野。 2 .计算机灰度分析: 每只大鼠取5张切片, 每 张切片随机选3个视野, 每个视野随机选5个阳性 细胞 进 行 计 算 机 图 像 半 定 量 分 析, 每 个 细 胞 内 B D N F、NG F、G F A P含量采用相对值( 即细胞灰度 值与背景灰度值相比) 。 三、 统计学处理 细胞记数及B D N F、NG F和G F

14、 A P灰度分析资 料用- xs表示, 差异显著性检验, 用多因方差分析, 用S S P S8. 0软件处理。 结果 一、 细胞计数 由表1可见, 从DM 1周开始大鼠顶盖前区 NG F阳性细胞数开始减少, 差异有统计学意义(P 0 . 0 1) ; 从DM2周开始, 大鼠顶盖前区B D N F阳 性细胞数开始减少, 差异有统计学意义(P0 . 0 1) ; 从DM2周开始G F A P阳性细胞数开始增加, 差异 有统计学意义( P0. 0 5) 。 二、 阳性细胞灰度值 由表2可见, 从DM1周开始大鼠顶盖前区神 经细胞内B D N F表达开始减少, 差异有统计学意义 ( P0. 0 1)

15、; 从DM2周开始胶质细胞内G F A P表 达增加, 差异有统计学意义(P0. 0 1) ;DM 1个月 顶盖前区神经细胞内NG F表达开始减少, 差异有 统计学意义( P0. 0 5) 。 表1 DM大鼠顶盖前区B D N F、NG F、G F A P阳性细胞 计数( -xs) T a b1 T h ec o u n t e dn u m b e r so fB D N F -,NG F -,G F A P - p o s i t i v ec e l l si np r e t a c t e la r e ao fd i a b e t i cr a t ( -xs) 组别 G r o

16、 u p 例数 n B D N FNG FG F A P N C1 58 .0 2 .11 7 .8 3 .04 .1 4 .4 D M 1周1w k 1 56 .2 2 .69 .4 4 .2 # 3 .6 1 .4 2周2w k 1 54 .8 2 .3 # 1 2 .9 2 .5 # 8 .5 3 .4 * 4周3w k 1 53 .0 0 .8 # 9 .8 2 .9 # 1 0 .7 3 .9 # 与N C组比较v sN C, *P0 . 0 5,#P0 . 0 1 表2 DM大鼠顶盖前区神经元内B D N F、NG F、G F A P 灰度值( -xs) T a b2 T h eg

17、 r a ys c a l e so fB ON F,NG Fa n dG F A Pi n p r e t e c t a l a r e ao fd i a b e t i cr a t(-xs) 组别 G r o u p 细胞数 n B D N FNG FG F A P N C4 5 0 .7 9 0 .0 50 .6 7 0 .0 80 .7 1 0 .0 6 D M 1周1w k 4 5 0 .7 0 0 .0 5 # 0 .6 3 0 .0 80 .7 7 0 .0 5 2周2w k 4 5 0 .7 4 0 .0 6 # 0 .6 4 0 .0 60 .8 0 0 .0 8 #

18、4周4w k 4 5 0 .7 6 0 .0 6 * 0 .5 8 0 .0 8 * 0 .7 8 0 .0 8 * 与N C组比较v sN C, *P0 . 0 5,#P0 . 0 1 讨论 一、 糖尿病早期大脑神经退行性病变 糖尿病早期, 无论是患者还是动物模型均存在学 习和认知功能障碍 8。同时糖尿病鼠脑海马神经元 存在明显神经退行性病变 1,2, 这些改变在糖尿病病 程1个月左右均已较明显。本研究中, 糖尿病病程1 周开始, 大鼠顶盖前区细胞内B D N F含量减少,N G F 阳性细胞数减少。糖尿病病程2周开始, 大鼠顶盖前 区B D N F细胞数减少, 同时胶质细胞记数和胶质细胞

19、内G F A P含量增加; 糖尿病病程1个月, 大鼠顶盖前 区N G F阳性细胞内N G F含量开始减少。胶质细胞 普遍存在于中枢神经系统, 其基本作用是维持神经元 的健康。当中枢神经系统由于肿瘤、 神经退行性病 变、 炎症或兴奋性毒性作用, 胶质细胞可被激活、 反应 性增生, 表现为G F A P和G F A Pm R N A表达增加。 神经营养因子m R N A广泛分布于脑组织。由于糖尿 031 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2 病代谢异常导致了脑组织神经细胞形态

20、异常, 神经营 养因子m R N A和蛋白减少 9。神经营养因子缺乏是 糖尿病诱发神经病变的重要原因, 它的减少有可能加 重神经退行性病变。 图1 正常大鼠顶盖前区B D N F表达,B D N F主要分布于胞浆内 图2 DM1个月大鼠顶盖前区B D N F表达减少 图3 正常大鼠顶 盖前区NG F表达,NG F主要分布于胞浆内 图4 DM1个月大鼠顶盖前区NG F表达减少 图5 正常大鼠顶盖前区G F A P表达, G F A P主要分布于胞浆和胞核内 图6 DM1个月大鼠顶盖前区G F A P表达增加 F i g1 T h ee x p r e s s i o no fB D N Fw a

21、 sm a i n l yd i s t r i b u t e d i nc y t o p l a s mo fp r e t e c t u ma r e a i nn o r m a lW i s t a r r a t F i g2 E x p r e s s i o no fB D N F i np r e t e c t u ma r e aw a sd e c r e a s e d i n1m o n t hd i a b e t i c r a t F i g3 T h ee x p r e s s i o no fNG Fw a sm a i n l yd i s t r

22、 i b u t e d i nc y t o p l a s mo fp r e t e c t u ma r e a i nn o r m a lW i s t a r r a t F i g4 E x p r e s s i o no fNG F i np r e t e c t u ma r e aw a sd e c r e a s e d i n1m o n t hd i a b e t i c r a t F i g5 T h e e x p r e s s i o no fG F A Pw a s m a i n l yd i s t r i b u t e d i nb o

23、t hc y t o p l a s ma n dc e l l n u c l e u so f p r e t e c t u ma r e a i nn o r m aW i s t a r r a t F i g6 E x p r e s s i o no fG F A P i np r e t e c t u ma r e aw a s i n c r e a s e d i n1m o n t hd i a b e t i cr a t 131 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o

24、 l 1 4,N o2 本研究结果表明, 糖尿病早期视网膜靶组织顶 盖前区已发生神经退行性病变, 即B D N F和NG F 阳性细胞数减少,B D N F和NG F表达减少, 随之胶 质细胞增殖。糖尿病早期顶盖前区神经退行性病变 是中枢神经系统退行性病变的一部分。 二、 视网膜与其靶组织顶盖 脊椎动 物 神 经 系 统 在 其 发 育 过 程 中 至 少 有 5 0%以上的神经元由于未能与其靶组织建立突触联 系, 不能获得神经营养因子而死亡。视网膜神经元 的靶组织是顶盖前区。视网膜内层神经元不仅有 B D N F、NG F、NT - 3的阳性表达 8, 而且分布有丰富 的神经营养因子受体 7

25、。青光眼发病机制研究已证 实, 视神经轴浆流阻滞, 视网膜节细胞因不能从其靶 组织获得神经营养因子而凋亡 7。因此视网膜靶组 织顶盖前区结构和功能的正常是维持视网膜功能与 结构正常的重要因素。 三、 糖尿病早期顶盖神经退行性病变和视网膜 神经退行性病变 新的研究表明, 视网膜神经元、 胶质细胞和血管 内皮细胞是组成糖尿病视网膜病变发病机制的三要 素 3 - 6。三者相辅相成共同参与了糖尿病视网膜病 变的发生发展。越来越多的研究表明, 糖尿病早期 存在视网膜神经细胞损害。动态观察糖尿病大鼠视 网膜神经元的改变, 发现糖尿病1周、 2周, 大鼠视 网膜神经元和微血管超微结构无明显改变 5。从糖 尿

26、病1个月开始, 尽管视网膜微血管超微结构尚无 变化, 但视网膜内层神经元超微结构已出现明显病 理改变。NG F可预防视网膜神经节细胞和M l l e r 细胞的凋亡, 减少视网膜G F A P的表达, 表明糖尿 病早期视网膜神经元损害与神经营养因子的消耗有 关 7。 本研究结果显示, 从糖尿病1周开始, 大鼠顶盖 B D N F含量减少,NG F阳性细胞数减少, 从糖尿病 2周开始, 顶盖B D N F阳性细胞数减少, 同时胶质细 胞和其细胞内G F A P表达增加, 从糖尿病1个月开 始顶盖NG F阳性细胞数减少。糖尿病大鼠视网膜 靶组织顶盖前区神经退行性病变早于视网膜神经元 的改变。因此,

27、 我们推测糖尿病早期视网膜神经元 退行性病变与其靶组织顶盖前区神经元退行性病变 相关, 而且和神经营养因子减少有关。关注糖尿病 早期视网膜及其靶组织顶盖前区神经退行性病变, 对于进一步研究糖尿病视网膜病变发病机制具有重 要意义; 对临床早期诊断和治疗糖尿病视网膜病变 提出了新的战略和理论。 参考文献 1 赵咏梅, 徐纯, 张岱, 等. 小鼠糖尿病脑病神经元退变的机制及淀 粉样蛋白前体1 7肽的作用.中华内分泌代谢杂志,2 0 0 0,1 6: 2 4 6 - 2 4 9. 2 S h e n gS L,Z h a oYM,Z h a oZW,e t a l .- Am y l o i da n

28、 d i t sb i n d i n g p r o t e i ni nt h eh i p p o c a m p u so fd i a b e t i c m i c e:e f f e c to fA p p - 1 7 p e p t i d e .N e u r o r e p o r t,2 0 0 1,2 9:3 3 1 7 - 3 3 1 9. 3 B a r b e rA J,A n t o n e t t iD A,G a r d n e rTW.A l t e r e de x p r e s s i o no f r e t i n a l o c c l u d

29、 i na n dg l i a l f i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i ni ne x p e r i m e n t a l d i a b e t e s . I n v e s tO p h t h a l m o lV i sS c i,2 0 0 0,4 1:3 5 6 1 - 3 5 6 8. 4 卢艳, 赵志伟, 吴航, 等.A p p - 1 7 肽对糖尿病大鼠神经网膜的保 护作用.眼科研究,2 0 0 2,2 0:2 8 9 - 2 9 2 . 5 卢艳, 姬志娟, 吴航, 等.电镜观察糖尿病大鼠神经网膜的超微结 构.首都医科

30、大学学报,2 0 0 2,2 3:4 5 - 4 8 . 6 L i e t hE,L a n o u eK F,A n t o n e t t iD A,e t a l . D i a b e t e s r e d u c e sg l u - t a m a t eo x i d a t i o na n dg l a u t a m i n e s y n t h e s i s i nt h e r e t i n a . E x pE y e R e s,2 0 0 0,7 0:7 2 3 - 7 3 0. 7 卢艳, 张晶瑶. 糖尿病对中枢神经系统的影响( 综述).国外医学 眼科

31、学分册,1 9 9 9,3:3 0 6 - 3 0 9 . 8 卢艳, 盛树力, 吴航.W i s t e r大鼠视网膜神经营养因子的表达. 眼科新进展,2 0 0 2,2 2:2 1 - 2 2 . 9 N i t t aA,M u r a iR,S u z u k iN,e ta l .D i a b e t i cn e u r o p a t h i e si n b r a i na r e i n d u c e db yd e f i c i e n c yo fB D N F.N e u r o t o x i c o lT e r a t o l, 2 0 0 2,2 4:6 9 5 - 7 0 1. ( 收稿日期:2 0 0 4 - 1 0 - 2 1) 231 中国糖尿病杂志2 0 0 6年第1 4卷第2期 C h i nJD i a b e t e s,A p r i l 2 0 0 6,V o l 1 4,N o2