精子DNA完整性的检测及其在辅助生殖技术中的作用.pdf

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1、第2 5 卷第1 1 期V o l. 2 5 , No . 1 7 2 0 0 5 年1 1月N o v . 2 0 0 5 生殖与避孕 R e p r o d u c tio n 汲C o n t r a c e p t io n h tt p :/ / w w w.R a n d C.c n r a n d c s i p p c s t c .s h .c n 精子D N A完整性的检测及其 在辅助生殖技术中的作用 李刚孙莹璞 郑州大学第附rl 1) : 院生殖医学中心，郑州，4 5 0 0 5 2 ) 【 摘要】 辅助生殖技术 ( 川u)中，砂 口 胞浆内单精子注射 工 C S l )

2、 的出现开创了治疗男性不育的新 局面， 同时使得精子D N A完整性倍受人们关注 精子D N A完整性对自然受孕、 人工授精、 胚胎、 胎儿、 婴儿乃至成人的发育至关重 要 研究表明精子D N A完整性是优于常规精液 分析的 独立参 数， 与A R T 结局 有很高 的相关 性 因 此精子D N A完 整性检测对于A R T 有很重 要的意义 目 前 有 多种方法检测精子D NA完整性 关键词: 精 子D NA完整性:辅助生殖技术; 精子染色质结构分析 中图分类号: R 7 7 1 . 6文献标识码: A文章编号: 0 2 5 3 - 3 5 7 X ( 2 0 0 5 ) 1 1 - 0 6

3、 9 0 - 0 4 辅助生殖技术 ( A R T)取得了举世瞩目的发 展， 尤其是卵胞浆内 单精子注射 ( I C S I )的出 现， 使一些严重少、弱、畸形精子症患者贡新获得了 生育其自身遗传子女的希望。但行I CS I 时，精子 的自然选择过程被绕过， 遗传物质受损的精子可能 直接注入卵子，因此精子D NA完整性受到人们的 里视。 研究表明临床上对不育患者精液常规检杏包 括精 子密度、数量、活动率、畸形率等并不能很 好地预测精子的 受精能力和妊娠结少 芬 1 ， 且精子 D N A 完整性影响精子受精能力、受精后原核的形成， 胚胎着床及子 代的健康， 所以 精子D N A 完整性对辅

4、助生殖技术的影响和作用日益受到人们的亚视u 1 核蛋白的组型转换及核小体结构丢失以致最后获得 缩合的染色质h l o精子发生过程中，与D NA结合 的核蛋白发生从组蛋白到过度蛋白到鱼精蛋白的组 7 ( U 转换。精子进入附翠后，鱼精蛋白中的人量琉 基不断氧化成三硫键 与D N A紧密结合形成致密的 胞核。同时鱼精蛋自能中和D N A电荷，济低D NA 分子问的静电作用，另外，鱼精蛋白还 J 精 护 在 生殖道转运过程中 D NA的保护和抵抗卵细胞质促 成熟因子 ( MP F)的作用有关t a t 。这些机制保证 了精子遗传物质的稳定性。 2 精子D N A损伤机制 精子 D N A的组装及其完

5、整性 精子D NA生化性质稳定。精子核包含了父方 的遗传物质，由鱼精蛋白和D NA组成。精子形成 是一个核缩合的过程即局部重排、与D NA结合的 通信作者: 孙莹璞; T e l : + 8 6 - 3 7 1 - 6 9 1 3 3 1 1 ; E - ma il :s y p 2 0 0 8 v ip . s i n a .c o m 研究发现不育男 性精子核有多种异常， 包括染 色质结构异常、微缺失、染色质结构I排、非整 倍体和D N A链断裂。 人射出的精子D N A损伤包括 单链和双链断裂。某些环境因素、基因突变、染 色体异常都会干扰精子发生过程中高度有序的一系 列生化反应， 最终导

6、致精子核异常。但其确切的 机 制尚未完全阐明由丁人类精子不发生转录和翻 译， 因此现有的研究结果可以归纳为3 种机制: 凋 6 9 0 - 亡异常: 凋亡不同于细胞死亡， 它是由体内外因素触 发细胞内预存的死亡程序而导致的细胞生理性主动 死亡过程。机体通过凋亡确保止常的生 r 发育， 维持内环境的稳定和发挥积极的防御功能。 正常情 况下， 人类架丸生殖细胞分化前经多次有丝分裂呈 克隆扩展，需要通过凋亡来控制其数量。生殖细 胞表面表达凋亡蛋白F a s ，而 S e r t o l ; 细胞表面表达 F a s 受体( F a s L ) , F a s / F a s l 途径可能i)J 控精

7、子凋亡。 S a k k a s 等 P I 发现不育男性精子表面F a s 蛋白 ( i“ ) 增加， 尤其在少精子症 患者中F a s ( + ) 精子 达5 0 %以I _ 。 这 说明 机体没有发生 止常的凋亡以 清除 D N A 受损的 精 子。 内 源性核酸酶( 拓扑异构酶工 I ) 异常: 精子发 生过程中，染色质的组装需要 内源性核酸酶的参 与。 臼 形成的连接缺口( n i c k ) , 有利于 鱼精蛋白 替换 组蛋自。但同时也可能造成D NA损伤或精子发生 异 常 ， 。 氧化应激: 研究表明 生理浓度的 活性氧 ( R 0 S ) 有 利于 精子获能和顶体反应， 而高浓

8、度R O S 对精子各细胞器都有不同的负影响。 R O S 能导致 单或双链 D NA断裂、染色质组装异常、凋亡等， 且R O S单独也可诱导DN A损拐 = i 3 精子D N A完整性检测原理和方法 3 . 1 精子染色质结构分析法 ( S CS A) 1 9 8 0 年由E v e n s o n 提出， 用热或酸处理精液， 使精子D N A变性，以评估精子D N A的稳定性。通 过流式细胞仪 ( F C M ) 可以 定量检测精子D N A的 损 伤。 此 方 法 利 用 叮 陡 橙 ( a c r i d i n e o r a n g e , A O ) 的 异 染 性来区分变性与

9、正常的精子 D N A。正常精子 D NA 紧密结合而具有抗酸性，维持双链的稳定性而 那些受损不成熟精子形成松散结构的染色质，其 D N A在酸的作用 卜 变性形成单链。 A O与正常精子 双链D NA结合呈单体形式发出绿色荧光， 与变性精 子单链D NA 结合牡聚合物形式发出红或黄色荧光。 F C M能准确监测每个精子发出的荧光信号， 传给 计算机， 用 专门的 软件处 理得出S C S A 参数: D N A 片段指数( D N A fr a g m e n t a t i o n i n d e x ,D F I , 即C O M P a t ) 是指变性 D N A精子的百分数。研究发

10、现，D F I 与 精液常规参数呈低度相关，而与妊娠率高度相关 因此可以作为独 立丁精子常规参数之外预测小育的 指标。 O O n D N A 可染性( h i g h D N A s t a i n a b i l i ty , FI D S ) 指对绿可染性高精 子 的百分比， 其精子核未完全缩 合使染料的嵌入力增强， 它与圆精子细胞有关， 反映 精子成 熟度。 3 . 2 彗星试验 即单细胞凝胶电泳实验 ( S C G E ) o通过定量 测定 D N A单链和双链断裂，分析其损伤，由于其 快速、灵敏、可靠、简单而被) 泛应用于休细胞 D N A的 检测 近年又用于精子D N A 损伤的

11、检 测， 且 其结果与I V F中胚胎质量和结局密切相关 6 1 。其主 要步Mr为: 制各精子悬液， 。 琼II NI MM合铺于玻片 上，待凝1 1, 11 后使精子溶解，D NA解链，然后电 泳，损伤的D NA片段向阳极移动，形成 “ 彗星” 尾部，未损伤的 D NA 则形成 “ 彗星”头部。洗 涤后用 DN A荧光染料染色，在荧光显微镜 卜 观 察。其结果分析有以 F 儿种方法: 彗早样细胞发 生率:根据细胞荧光图像是否像彗早一样头尾分 明将其分为彗星细胞和非彗星细胞， 计数一定v - 细 胞中彗星细胞所占的比例即彗星样细胞发生率， 估 计D NA的损伤程度。其主观因素多，影响实际结

12、染。 在显微镜下或在照片上测量彗星的一些 民 度 参数如尾 Lc .总彗早长度、尾长与头部直径的比 值等来评价 D N A损伤的程度。彗星尾部荧光强 度1彗星头部荧光强度的比值。尾矩， 即尾部 DN A i 片 总D NA的白分比与头、尾巾心间距的乘 积，由于距离和强度指标均不全面，该指标比上 述其他指标好 ，因此被广泛接受。 3 .3 原位标记法 最初用于细胞凋亡的检测，现己用 于评估精 子DN A损伤情况。方法有两种:原位缺口平移法 和末端转移酶介导的脱氧三磷酸鸟首末端标记法 ( T U N E L ) 。前者由D N A聚合酶I 催化反应，常 用的标记物为生物素或地高辛;后者由末端转移

13、酶催化 反应 ，常川 的标记 物为异硫氰荧光素 ( F I T C) 1 1 . D NA断裂的精 子在末端转移酶催化 下将F I T C - d NT P 连接在断裂的末端，通过流式细 胞仪 ( F C M)便可检测 DNA断裂的精子数量 3 . 4 精子染色质扩散试验 ( S CD) 由F e r n a n d e z 等18 1 首先提 ! ， 方法是将精子悬液 与琼脂糖混合铺于玻片 L， 酸处理后溶解细胞除去 核蛋白， 染色， 最后用荧光显微镜观察。除去核蛋 白后，精 子染色质松散，D NA环附着在残留的核 结 构上， 形成光晕。试 验发 现， 止常精子D N A产生 扩散的光晕，

14、而损伤的精子不产生或产生很小的光 晕。 其机理尚不清楚。止常生育男性和小育男性 的S C D值有显著差异。囚此，S C D是一种简便、 6 9 1 - 快速、准确地评价男性不育的方法。 4 精子D N A完整性检测的临床应用及意义 研究说明精子D N A完整性是比 传统精液参数 更好的预测男性生育的指标，有望成为寻求 A R T 治疗夫妇的重要评估手段9 。同一份标本重复测定 精子完整性的变异系数 3 0 %为低度生育力; 8 0 %为 无 生育能力。 2 0 0 4 年V i r r o 等p 2 7研究了2 4 9 对需行 V F - E T 或I C S I 治疗的夫妇中S C S A参

15、数与受精、 囊胚 发 育及妊娠之间的关系， 结果是在高 D F I 组和低D F I 组， I V F 和工 C S I 受精率没有统计学差异，H D S - 1 5 %, I V F 受精率低( 3 0 %的 患者囊胚形成率低 1 5 % 的患者需行I C S I 助孕 所以精 子D N A 完整性 检杏能 客观地评估男性生育力 和预测亚临床不孕， 为临床诊断提供客观依据。 4 . 2预测辅助 生殖技术的成败， 为临床选择正确的 助孕方法提供依据 预测妊娠结局是生殖专家急需解决的重大课 题。 一种可以预测妊娠结局的参数不但可以让医生 告诉患者他们在采取辅助生殖技术中获得妊娠的机 率，而且还可

16、以减少他们的痛苦和经济负担。同 时也为临床选择止确的助孕方法提供依据。2 0 0 4 年B u n g u m等0 3 研究了S C S A在预测宫内 人工受精 ( I UI ) , I V F, I C S I 结局中的作用 。共研究了3 0 6 对夫妇，其中 1 3 1 对行I UI 治疗，1 0 9对行I VF治 疗，6 6对行 I C S I 治疗。结果足I UI 中，DF I 2 7 %和H D S 2 7 %或 H D S1 0 %组高。而D F I 2 7 %组I C S I 结局明 显 较 I VF 好，因此此类患者建议行 I C S 1 助孕。所以 S C S A是预测A R

17、 7结局的有用方法， 并且为临床选 - 6 9 2 - 择正确的助孕方法提供了依据p 4 A s o 4 . 3评价优选方法对精子D NA的影响 辅助生殖技术中， 精子的 优选是一个常规操 作。精子优选可以 得到没有精浆、细胞碎片及病 原微生 物的精子悬液， 同时回收足量形态、 功能正 常的精子。方法主要有上游法、密度梯度离心法、 玻 璃棉柱过滤法 ( G WF ) 和精子洗涤等。 Z i n i 等1 b 使 用 S C S A方法研究了上游法和P e r c o ll 密度梯度法优 选精子D N A的完整性。结果两种方法都能获得活 动好、 形态正常的精子 ， 但上游法可以回收D N A完

18、整性好的精子，而P e r c o l l 密度梯度法则不能提高 完整性好的精子 回收率。 L a r s o n 等n 用S C S A 对双 层P e r c o l l 密 度梯度法( D G C ) 及G W F 处理后2 6 名男 性精子进行 了D NA完整性分析。结论是两种方法 都可以改善精子完整性、活力、活率。但在回收 活力、 形态正常、 成熟的 精子上，, D G C 法优于G W F 法， 而G WF 法回收染色质止常精子比 例显著高 于 DG C法。这提示我们重新检查精子处理方法， 选择 最佳组合， 使其对精子D N A损伤最小 4 . 4评价冻存方法对精子D N A的影响

19、 辅助生殖技术中，精子的冷冻和复苏已成为 常规。它是供精人 _ 授精 ( A工 D)的必须步骤， 同时也是男性保存生育能 力的 有效方法。 冷 冻复苏 过程可以造成精子活力、活率 下降、膜破裂及头 部项体功能异常等 。尽管精 子冷冻复苏后用于 AR 7取得了成功，但其对精子D N A完整性是否有 影响仍不十分清楚， 但多数研究认为以液氮为储存 剂超低温保存对精子 DNA完整性没有影响。 D o n n e ll y 等 p q 利用彗星方法研究了生育组和不育组 精子在冷冻前后的D N A损伤。发现生育组精子在 处理前后D NA完整性均不受冷冻的影响，而不育 组冷冻复苏后精子 D N A损伤明显

20、增加。精子形态 和头部完整性与D NA完整性没有相关性。这提示 我们在行I C S I 时，通过观察选择形态正常的精子 并不能确保其D N A的完整性，且冷冻复苏对不育 男性精子 D NA损伤较大。 另外，利用寒丸抽取精子 ( T E S A) 行I C S I 治疗男性不育已获成功。 冻存翠丸精子已被用于临 床。 但其足否影响精子 D N A 完整性及IC S I 结 局目 前 尚 无 一 致 观点 ， T h o m p s o n - C r e e 等 ， ， 研究了 8 8 例行 T E S A - I C S I 治疗阻塞性无精子症的不育患者。 彗星试验证实冷冻复苏后精子D NA完

21、整性严重受 损，妊娠率显著低于新鲜精子组。因此建议取新 鲜T E S A 精子行I C S I ， 同时 应进一步改善冷冻方案 以 保护不育患者精子D N A不受冷冻损伤。 综上所述， 精子】 ) N A 完整性与辅 助生殖技 术 密切相关， 精子D N A异常导致受精失败、胚 胎发育 停1 F 、流产、 胎儿畸形等1 2 0 1 。 儿乎所有的研究都 说明精子D N A完整性的检测在预测A R 7结局、 评 价男性不育 和为临 床选择正 确的 助孕方法等方 面明 显优于常规精液分析。同时在I C S I 前首先对精子 D NA进行评估十分必要。另外精子D N A完整性分 析可以帮助我们选择合

22、适的精 子 优选和冷冻方案， 使医源性精子损伤最小化。因 此， 精子D N A完整 性检测在A R T中有重要的作用和应用前景。 参考文献 1 S il ls E S , F r y ma n J T , P e r lo e M, e t a l .C h mma t in fl u o re s c e n c e c h a r a c t e r is t ic s a n d s t a n d a r d s e me n a n a ly s is p a r a me t e r : c o , r e la t io n s o b s e r v e d i n a n d

23、 r o lo g y t e s t i n g a mo n g 1 3 6 ma l e s r e f e r r e d f o r i n f e rt i lity e v a lu t io n .J O b s t e t G y n a e c o l, 2 0 0 4 ,2 4 ( 1 ) :7 4 - 7 2 L a r so n - G o o d K L , B ra n n ia n J D , H a n s e n K A, e t a l . R e la t io n s h i p b e t we e n th e o u tc o me s o f

24、a s s i s t e d r e p r o d u c ti v e te c h n iq u e s a n d s p e r m D NA f r a g me n ta t io n a s me a s u r e d b y t h e s p e r m c h r o ma t in s t r u c t u r e a s s a y .F e r f l S t e r i l, 2 0 0 3 , 8 0 ( 4 ) :8 9 5 - 9 0 2 3 F u e n te s - Ma s s c o r r o G & S e r r a n o H. S

25、p e r m c h ro ma ti n . A r c h A n d r o l , 2 0 0 0 , 4 5 ( 3 ) : 2 1 5 一5 4 S a k k a s D, Ma t t a t o , Ma n i c a r d i G C , e t a l. N a t u r e o f D N A d a ma g e i n e j a c u la t e d h u ma n s p e r m a t o z o a a n d t h e p o s s ib l e in v o l v e me n t o f a p o p to s is . B

26、io l Re p r o d , 2 0 0 2 , 6 6 ( 4 ) : 1 0 6 1 - 7 . 5 Mo u s t a f a MH&S h a r m a R E. R e la t io n s h i p b e t w e e n R O S p r o d u c t i o n , a p o p to s is a n d D NA d e n a tu r a t i o n i n s p e r m a t o - z o a f r o m p a t ie n t s e x a min e d f o r in f e rt i l it y . H u

27、 m R e p r o d , 2 0 0 4 , 1 9 ( l ) : 1 2 9 - 3 8 . 6 1 T o ms u M, S h a r ma V&Mil le r D . E mb ryo q u a li ty a n d NF tr e a t me n t o u t c o m e s ma y c o r r e l a t e w i t h d i f f e r e n t c o me t a s s a y p a r a me t e r s . H u m R e p r o d , 2 0 0 2 , 1 7 ( 7 ) : 1 8 5 6 -62

28、7 B e n c h a i b M, B rau n V , L o ma g e J , e t a l . S p e r m c h r o ma t in f ra g me n ta t io n d e c r e a s e s th e p r e g n a n c y r a te s i n a n a s s i s t e d r e p r o d u c t iv e t e c h n i q u e . H u m R e p r o d , 2 0 0 3 , 1 8 ( 5 ) : 1 0 2 3 - 8 8 F e m a n d e z J L ,

29、 Mu r i e l L , R i v e r o ML , e t a l . T h e s p e r mc h mm a t in d i s p e r s io n te s t a s i m p le me th o d f o r t h e d e t e r min a t io n o f s p e r m D NA f r a g me n ta t io n . J A n d r o l , 2 0 0 3 , 2 4 ( 1 ) :5 9 - 6 6 9 Z i n i A , F i s c h e r MA , S h a r i r S , e t

30、a l . P re v a le n c e o f a b n o r m a l s p e r m DN A d e n a t u a t io n in f e rt ile a n d in f e rt ile me n . U mlo g y , 2 0 0 2 , 6 0 ( 6 ) : 1 0 6 9 - 7 2 1 0 1 Z i n i A , Ka ma K , P h a n g D , e t a l. B io lo g ic a l v a ri a b i li ty o f s p e r m D NA d e n a tu r a t io n in

31、in fe rt i le me n . U r o lo g y , 2 0 0 1 , 5 8 , 2 5 8 - 6 1 I 1 E v e n s o n D P & J o s t L K . S p e r m c h r o ma t i n s t r u c t u r e a s s a y i s u s e f u l f o r f e rt i li ty a s s e s sme n t . Me t h o d s Ce l l S c i, 2 0 0 0 , 2 2 ( 2 - 3 ) : 1 6 9 - 8 9 1 2 V ir r o MR , L a

32、 r s o n - C o o k KL & E v e n s o n D P . S p e rm c h ro ma t in s t r u c t u r e a s s a y ( S C S A ) p a r a me te r s a r e r e l a t e d to f e rt ili z a t io n , b la s t o c y s t d e v e l o p me n t , a n d o n g o in g p r e g n a n c y i n i n v it r o f e r ti l i z a t io n a cr d

33、in t r a c y t o p la s mic s p e r m in j e c ti o n c y c l e s . F e rt il S te r i l, 2 0 0 4 , 8 1 ( 5 ) : 1 2 8 9 - 9 5 1 3 B u n g u m M, H u ma id a n P , S p a n n M, e t a l . T h e p r e d i c t iv e v a l u e o f s p e r m c h r o m a t in s t r u c t u r e a s s a y ( S C S A ) p a r a

34、me t e r s f o r t h e o u t c o me o f in t ra u te r in e in s e rn in a t io n , IVF a n dIC S I. H u m R e p r o d , 2 0 0 4 , 1 9 ( 6 ) : 1 4 0 1 - 8 1 4 L a r s o n KL , D e J o n g e C l , B a r n e s A M, e t a l . S p e rm c h r o ma t in s t r u c t u r e a s s a y p a r a m e t e r s a s

35、p r e d ic to r s o f fa i le d p r e g n a n c y f o ll o w i n g a s s is t e d r e p r o d u c ti v e te c h n i q u e s . Hu m Re p r o d , 2 0 0 0 , 1 5 ( 8 ) : 1 7 1 7 -2 2 1 5 E s tc r h u i z e n A D, F r a n k e n D R , L o u r e n s J G H, e i a l . S p e r m c h r o ma t in p a c k a g in

36、 g a s a n in d ic a t o r o f in v it r o f e rt i li z a t io n r a t e s . H u m R e p r o d , . 2 0 0 0 , 1 5 (3 ) :6 5 7 - 6 1 . 1 6 Z in i A , F in e l li A , P h a n g D, e t a l . In fl u e n ce o f s e m e n p ro c e s s in g te c h n iq u e o n h u ma n s p e rm D N A in t e g r ity. U r o

37、 lo g y , 2 0 0 0 , 5 6 ( 6 ) : l 0 8 1 - 8 4 1 1 7 ) L a r s o n K L , B r a n n ia n J D , T imm B K, e t a l . D e n s ity g ra d ie n t c e n tr if u g a t io n a n d g la s s w o o l fi ltr a t io n o f s e me n r e mo v e s p e r - ma t o z o a w i t h d a ma g e d c h r o ma t in s t r u c t

38、u r e . H u m R e p r o d , 1 9 9 9 , 1 4 ( 8 ) :2 0 1 5 - 1 9 1 8 D o n n e l ly E T , S t e e le E K , Mc C lu re N , e t a l. A s s e s s m e n t o f D N A i n t e g r it y a n d mo r p h o l o g y o f e j a c u la te d s p e r m a t o z o a f ro m f e rt i le a n d i n f e rt i le m e n b e f o

39、r e a n d a f te r c ryo p re s e r v a t io n H u m R e p r o d , 2 0 0 1 , 1 6 ( 6 ) :1 1 9 1 - 9 1 9 1 T h o m p s o n - C r e e ME , Mc C lu r e N , D o n n e ll y E T , e t a l . E ff e c t o f c ryo p r e s e r v a t io n o n t e s t ic u l a r s p e r m n u c l e a r D N A f r a g - m e n t a

40、 t i o n a n d it s r e la ti o n s h ip w it h a s s i s t e d c o n c e p ti o n o u t - c o me f o ll o win g I C S I wit h t e s t ic u l a r s p e r ma t o z o a . R c p r o d B io me d O n li n e , 2 0 0 3 , 7 ( 4 ) :4 4 9 - 5 5 . 2 0 Mo r r is I D, B u t t S , Dix o n L , e t a l . T h e s p

41、e c tr u m o f D NA d a ma g e in h u ma n s p e r m a s s e s s e d b y s in g l e c e l l g e l e le tr o p h o r e s i s ( C o me t a s s a y ) a n d i t s r e la t io n s h i p t o f e r ti li - z a ti o n a n d e mb ry o d e v e lo p me n t . Hu m R e p r o d , 2 0 0 2 , 1 7 ( 4 ) : 9 9 0 - 8 . ( 2 0 0 5 年6月2 1日收稿) 一 6 9 3