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1、 8 2 0中华实验外科杂志2 0 0 5 年7 月第2 2 卷第7 期C h i n J E x p S u r g , J u ly 2 0 0 5 , V o l 2 2 , N o . 7 实 验 研 究 细胞凋亡在大鼠体外肝缺血再灌注 损伤中的作用 陈俊任汪谦李湘珑陈伟锋 【 摘要】 目的探讨体外切肝不同术式对肝脏缺血再灌注损伤中肝细胞凋亡的影响。方法 利用S D大鼠建立完全离体、 半离体切肝动物模型， 术后 4、 2 4 h 处死大鼠采取标本， 通过病理、 电 镜观察肝脏形态学改变， 免疫组织化学检测肝组织的核增殖抗原( P C N A ) 表达， 原位末端标记法 ( T U N
2、E L ) 检测细胞凋亡。结果完全离体组肝脏损害最严重， 细胞凋亡阳性指数最高， 再灌注后 4 h 和2 4 h 分别为2 4 . 4 士 1 . 9 , 3 2 . 6 土 2 . 7 ， 而半离体组为1 7 . 0 士 2 . 6 , 2 6 . 4 士1 . 1 ， 两组间差异有统计 学意义( 尸 0 . 0 5 ) ; 完全离体组再灌注4 h 和2 4 h 后P C N A的表达分别为“. 6 士 2 . 5 , 7 7 . 2 士 1 . 5 ， 明 显高于半离体组的5 7 . 4 士1 . 5 , 6 8 . 6 1 2 . 5 ( P 0 . 0 5 ) 。 结论肝窦内皮细胞凋亡
3、及之后伴随的肝细 胞凋亡是肝缺血再灌注后肝脏损伤的方式之一， 在肝细胞凋亡的同时也存在肝细胞的增生， 半离体 体外肝手术对肝脏损伤相对轻、 暴露良 好， 因此临床上应优先选择。 【 关键词】 肝手术; 缺血; 再灌注损伤; 脱噬作用 E f f e c t o f ao p t o s i s o n i s c h e m i a - r e p e r f u s i o n i n j u r y i n r a t e x s i t y l i v e r s u r g e r y C H E N J u n - r e n ， W A N G Q i a n ， L I X i
4、a n g - h o n g , e t a l . D e p a r t m e n t o f H e p a t o b i l i a r y S u r g e r y , F i r s t A f f i l i a t e d H o s p i t a l o f S u n Y a t - S e n U n 二 t y , G u a n g z h o u 5 1 0 0 8 0 , C h i n a A b s t r a c t O b j e c t i v e T o s t u d y t h e e f f e c t s o n h e p a t
5、i c a p o p t o s is d u r in g h e p a t i c is c h e m i a - r e p e r f u - s i o n i n j u ry b y r a t e x o r a n t e s i t u l i v e r s u r g e ry. Me t h o d S p r a g u e - D a w l e y r a t s w e r e u s e d t o e s t a b l i s h t h e a n i m a l m o d e ls o f “ e x s it u “ a n d “ a n
6、 t e s i t u “ l iv e r s u r g e r y . F o u r h a n d 2 4 h a f t e r o p e r a t io n , t h e r a t s w e r e k i ll e d a n d s p e c i m e n s w e r e c o l l e c t e d . T h e s p e c i m e n s w e r e s u b j e c t e d t o H E s t a i n i n g , e l e c t r o n m i c r o s c o p y , T U N E L
7、a s s a y a n d i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s t a i n i n g t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n o f P C N A . R e s u l t s I n “ a n t e s i t u “ g r o u p , t h e p e r c e n t a g e o f a p o p t o t i c c e ll s 4 h a n d 2 4 h a f t e r o p e r a t i o n w a s 1 7 . 0 士 2 . 6
8、 a n d 2 6 . 4 土 1 . 1 r e s p e c t i v e l y , b u t t h a t w a s 2 4 . 4 士1 . 9 a n d 3 2 . 6 1 2 . 7 r e s p e c t i v e l y i n “ e x s i t u “ g r o u p ( P 0 . 0 5 ) . T h e e x p r e s s io n s o f P C N A w a s 6 6 . 6 1 2 . 5 a n d 7 7 . 2 1 1 . 5 r e s p e c t i v e l y 4 h a n d 2 4 h a
9、 f t e r o p e r a t i o n in “ e x s i t u “ g r o u p w a s h ig h e r t h a n t h a t i n “ a n t e s i t u “ g r o u p ( P 0 . 0 5 ) . C o n c l u s i o n A p o p t o s i s o f e n d o t h e l i a l c e ll s f o l l o w e d b y h e p a t o c y t e s i s a n i m p o r t a n t m e c h a n i s m o
10、f c e l l d e a t h a f t e r l i v e r i s c h e m i a / r e p e r f u s i o n i n - j u ry. “ A n t e s i t u “ l i v e r s u r g e ry s h o u l d b e f i r s t c h o s e n i n c l i n i c a l a p p l i c a t i o n t o r e s e c t d i f f i c u l t t u m o r . K e y w o r d s L i v e r s u r g e r
11、 y ; I s c h e m ia ; R e p e r f u s io n i n j u r y ; A p o p t o s is 当巨大肝肿瘤侵犯肝后下腔静脉、 肝腔静脉汇合 部或肝内主要血管， 用常规肝切除法由于受到肝缺血 时间和肿瘤部位限制而多不能手术切除。体外切肝术 使此类患者有可能达到治愈性的外科手术切除。我们 利用大鼠建立几种体外肝模型， 试图了解各种体外肝 手术方式对肝脏缺血再灌注损伤所致的细胞凋亡及对 肝脏结构与功能的影响， 为临床的术式选择提供依据。 材料与方法 1 . 体外肝手术: 健康雄性 S D大鼠， 鼠龄 3 - - 4 个 月， 体重2 5 0 -
12、- 3 0 0 g ， 由中山大学实验动物中心提供。 3 0 只S D大鼠随机分成 3 组( n 二1 0 ) ， 正常对照组( A 基金项目: 国家教育部骨干教师资助项目( 2 0 0 0 6 5 ) 作者单位: 5 1 0 0 8 5广州. 中山大学附属第一医院肝胆外科( 汪谦、 李 湘兹、 陈伟锋) ; 深圳市第二人民医院普外科( 陈俊任) 组) 、 半离体组( B组) 和完全离体组( C组) 。各组手术 方式如下: 正常对照组( A组) 大鼠乙醚吸入麻醉， 仰卧 固定， 上腹横切口入腹， 游离肝脏周围韧带后关腹， 术 后灯照保暖至麻醉清醒， 5 %葡萄糖盐水饮用， 单笼饲 养。半离体组
13、( B组) : 按上法麻醉后开腹， 游离肝脏周 围韧带和肝上下腔静脉， 使全身肝素化。微血管夹阻 断肝下下腔静脉和肝蒂， S t i n s k y 钳阻断肝上下腔静 脉， 于远心端横断肝上下腔静脉， 分离肝与后腹壁间的 组织， 将肝脏翻出切口 外， 可以充分显露肝静脉和下腔 静脉汇合处， 然后肝脏原位植入肝床， 8 - 0 无损伤缝线 连续缝合肝上下腔静脉， 恢复肝血流( 肝脏缺血时间约 2 0 m i n ) ， 术后处理同正常对照组。完全离体组( C 组) : 参照改良的K a n a d a 二袖套法原位肝移植进行。 2 . 标本的采集及处理: 术后4 , 2 4 h 处死大鼠。取 新
14、鲜肝组织， 分别保存于 1 0 %甲醛及电镜液中。将固 定在甲醛中的肝组织制成石蜡切片: 用苏木精染色， 光 8 2 1 镜下观察肝损伤的情况; 应用T d T介导的d U T P缺口 末端标记法( T U N E L ) 检测各组体外肝手术后肝细胞 凋亡情况， 细胞凋亡试剂盒( A p o p T a g P e r o x i d a s e k i t s S 7 1 0 0 ) 购自I n t e r g e n 公司， 在O L Y M P U S 显微镜下观 察凋亡细胞分布， 细胞核中有棕黄色为阳性细胞， 每张 片子随机选取5 个视野测定阳性细胞数及总细胞数， 计算出阳性细胞指数(
15、 指数=阳性细胞/ 总细胞数) ; 免 疫组织化学检查采用链霉素抗生素蛋白一 生物素酶标 免疫组织化学染色法( L S A B 法) 检测P C N A的表达水 平， P C N A试剂盒购自 北京中山生物技术有限公司， P C N A的定量采用与细胞凋亡相同的半定量方法。将 固定在电 镜液中的标本利用透射电镜 H I T A C H I - 6 0 0 ( J a p a n ) 检测肝超微结构变化。 3 . 统计学处理: 所有数据用均数士 标准差( x士: ) 表示， 采用单因素方差分析。 组表达强， 完全离体肝 C组 P C N A表达最强， 达 ( 6 6 . 6 士 2 . 5 )
16、%; 2 4 h 后 B , C组P C N A表达均明显增 强， C组表达最强( 表 1 ) 0 表 1 细胞凋亡与P C N A的表达情况 组别 细胞凋亡数( %)P C N A阳性细胞数( %) 4h 2 4h A B 3. 4士1 . 1 1 7 . 0士2. 6 2 4 . 4 士1 . 9 “ 1 . 8士0 . 4 2 6 . 4士1 . 1 3 2 . 6士2 . 7 3 5 . 8士2. 6 5 7. 4士1 . 5 6 6 . 6 士2 . 5 “ 3 3 . 8士2 . 8 6 8 . 6士2 . 5 7 7 . 2土1 . 5 注: 各组间比较， “ P 0 . 0 5
17、 讨论 结果 1 . 苏木素一 伊红( H E ) 染色: A组肝细胞结构及细 胞器形态正常。B组肝缺血再灌注 4 , 2 4 h肝细胞形 态变化: 汇管区管腔内可见血细胞， 间质区可见以中性 粒细胞为主的炎症细胞， 肝腺泡ul区细胞排列紊乱、 肝 细胞水样变性或脂肪变性， 胞浆内可见脂肪滴， 肝窦扩 张、 淤血， 中央静脉淤血明显。C组肝再灌注 4 , 2 4 h 的肝细胞形态变化: 汇管区间质内可见大量以中性粒 细胞为主的炎症细胞浸润， 小血管腔内大量血细胞成 分并见散在的小血管壁破坏伴管周出血， 肝细胞排列 紊乱， 呈浊肿变性， 肝窦明显变窄， 肝腺泡111区内可见 散在点片状肝细胞坏死
18、和炎症细胞侵润， 肝细胞坏死 区伴有出血。 2 . 电镜结果: A组的超显微结构基本正常。B组 的超显微结构有以下特点: 肝细胞线粒体明显肿胀， 峪 显示不清， 部分肝细胞内质网旺盛， 部分细胞脂肪变 性。C组肝细胞线粒体丰富， 肿胀较前加重， 峪显示不 清， 也可见肝细胞、 肝窦内皮细胞凋亡。 3 . 肝组织的细胞凋亡与 P C N A的表达: T U N E L 结果显示， 再灌注4 h 后C组中凋亡细胞最多， 其次为 B组， A组中较少见细胞凋亡; 再灌注2 4 h 后凋亡细胞 数较4 h 增多， 仍然是C组中凋亡细胞最多， 其次为B 组， A组中较少见细胞凋亡; B , C两组中均见再
19、灌注4 h 后凋亡细胞主要分布在汇管区尤其是中央静脉、 微 血管内皮细胞及周围肝细胞， 2 4 h 后凋亡细胞的分布 向邻近肝组织扩散， 阳性数增加( 表 1 ) 。免疫组织化 学显示 P C N A的表达， 肝缺血再灌注 4 h后 B组较 A P C N A是增殖期细胞特异表达的核蛋白， 是细胞 D N A聚合酶S 的重要辅助成分， 不仅在 D N A复制中 起关键作用， 而且参与细胞D N A合成及分裂增殖， 它 的含量和表达程度反映了细胞的增殖活性， 可作为评 价细胞状态的一项指标， 尤其在肿瘤细胞中表达较 高 ， “ 。 本实验研究结果显示体外肝脏手术后肝缺血再灌 注损伤中可出现肝窦内
20、皮细胞和肝细胞的在灌注后出 现细胞凋亡， 随灌注时间延长， 2 4 h 肝细胞与肝窦内皮 细胞凋亡比率有所增加。在再灌注后相同的时间点， 完全离体组肝组细胞凋亡所致的肝脏损害明显强与半 离体组。同时， P C N A的表达的量与肝细胞受损的严 重程度相一致， 表明肝脏缺血再灌注后， 不仅有以细胞 凋亡为表现的肝细胞损伤， 并且肌体也相应的启动了 肝脏细胞的再生。 完全离体切肝离断血管最多， 平均手术时间超过 1 0 h 。半离体切肝第一肝门仅给予阻断而不离断， 肝 上、 肝下下腔静脉离断。是否采用原位低温灌注肝切 除术、 半离体、 离体体外肝术， 主要根据肿瘤病变部位， 肿瘤切除后是否行复杂的
21、血管吻合。半离体切肝避免 离断肝蒂， 简化了手术过程。肝上、 肝下下腔静脉离断 后， 肝脏能翻出切口外， 可从容处理肝脏背面肿瘤 ” 。 从病理、 电镜及细胞凋亡情况可见半离体对肝组织损 伤相对较轻， 手术操作相对简单， 因此临床上应优先选 择。 参考文献 陈腾， 吴承远， 王建刚， 等. 增殖细胞核抗原在脑胶质瘤中的表达. 中 华实验外科杂志， 2 0 0 3 , 1 1 : 1 0 1 4 - 1 0 1 5 . 叶晨， 韩本立， 董家鸿， 等. 大鼠脂肪变性供肝减体肝移植术后的肝 再生. 中华实验外科杂志， 2 0 0 4 , 2 1 : 2 0 7 - 3 0 8 . 陈 俊任， 汪谦. 体外肝切除技术的进展. 临床外科杂志， 2 0 0 3 , 1 1 . 1 8 8 - 1 8 9. ( 收稿日 期: 2 0 0 4 - 0 7 - 2 6 )