组织工程食管的研究进展.pdf

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1、第 二 军 医 大 学 学 报 Ac a d J S e c Mi l Me d Un i v 2 0 0 5 Ma r : 2 6 ( 3 ) 3 3f 综述 组织工程食管的研究进展 鲍春荣， 丁芳宝 ( 第二军医大学长海医院 胸心外科， 上海2 0 0 4 3 3 ) 摘要 很多食管疾病需要行食管替代术， 用自 身组织行食管替代创伤大， 术后并发症多， 而现有的人工食管无法满足食管 替代的要求。利用组织工程技术研究人工食管是解决这些问题的希望， 本文就利用组织工程技术研究人工食管的发展进行 综述。 关键词 组织工程; 人工器官; 食管; 食管疾病 中图分类号 R 3 1 8 . 1 ; R

2、 5 7 1 文献标识码 A 文章编号 0 2 5 8 - 8 7 9 X ( 2 0 0 5 ) 0 3 - 0 3 3 1 - 0 3 S t u d y o n t i s s u e - e n g i n e e r e d e s o p h a g u s B A O C h u n - r o n g , D I N G F a n g - b a o ( D e p a r t m e n t o f C a r d i o t h o r a c i c S u r g e r y , C h a n g h a i H o s p i t a l , S e c o n

3、d Mi l i t a r y Me d i c a l U n i - v e r s i t y , S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 , C h i n a ) A B S T R A C T M a n y e s o p h a g e a l d i s e a s e s n e e d e s o p h a g e a l r e p l a c e m e n t . R e p l a c e m e n t w i t h a u t o g r a f t l e a d s t o g r e a t d a m a g e a n d c

4、o m p l i c a t i o n s . T h e e x i s t i n g a r t i f i c i a l e s o p h a g u s , h o w e v e r , c a n n o t m a t c h t h e d e m a n d s o f e s o p h a g e a l r e p l a c e m e n t . T h e s t u d y o f t i s s u e - e n g i n e e r e d s o p h a g u s . K E Y WO R D S e s o p h a g u s i

5、 s t h e h o p e t o s o l v e t h e s e p r o b l e m s . T h i s a r t i c l e r e v i e w s t h e p r o g r e s s io n o f t i s s u e e n g i n e e r e d e - t i s s u e e n g i n e e r i n g ; a r t i f i c i a l o r g a n s ; e s o p h a g u s ; e s o p h a g e a l d i s e a s e A c a d J S e

6、c Mi l Me d U n i v , 2 0 0 5 , 2 6 ( 3 ) : 3 3 1 - 3 3 3 许多先天性或后天性食管疾病都需要行食管替代术。 手术治疗时食管的替代物主要分两大类: 一类是用自身的其 他组织或器官， 另一类是人工的食管替代物。来自自身的食 管替代物有胃、 结肠、 空肠及游离的空肠等， 其缺点是手术打 击大， 术后并发症多， 如吻合口凄、 狭窄、 坏死、 反流等仁 2 ， 并 且它们都以牺牲部分消化道为代价， 常常造成消化功能紊乱 和营养吸收障碍， 在有胃肠道疾病或做过胃、 肠切除术的患 者， 该方法的应用也受到限制， 而且在婴幼儿开展此类手术 也存在一定的困

7、难。因此， 人们一直在努力寻求适宜的人工 食管替代物。 1研究历史 自B e r m a n 等在 1 9 5 1 年率先采用特制的聚乙烯管替代 食管缺损以来， 至今人工食管的研究已有 5 0余年的历史。 但在这些研究1 2 - .I 中， 人工食管的材料多为不可降解高分子 材料如硅橡胶、 D a c r o n , T e f l o n , 碳纤维等， 由于使用不可降解 高分子材料制成的人工食管与组织的相容性差， 受体血管、 组织无法长人， 人工食管内腔亦不能完全内皮化， 往往会导 致严重的并发症， 如感染、 吻合口痊、 吻合口狭窄等， 并由于 人工食管无法与受体组织完全愈合而得到生物学固

8、定， 最终 不可避免发生脱落。之后有文献报道 - . 6 1 采用生物可降解材 料和不可降解高分子材料构成复合体， 通过诱导受体食管组 织再生行食管重建， 在动物实验中取得了较满意的结果， 但 该方法仍存在较多的缺陷: ( 1 ) 不可降解高分子材料术后一 段时间需经胃镜取出; ( 2 ) 此类实验方法仅适用于食管缺损 较短者， 尚不能充分反映食管重建的全貌; ( 3 ) 再生的食管组 织与自身食管组织结构和功能上尚有较大的差距。 近年来， 应用自 体组织或细胞体外培育具有生理功能的 组织移植物的“ 组织工程” ( t i s s u e e n g i n e e r i n g ) 概念的

9、提出无 疑为解决这一问题带来希望， 1 9 8 7年美国麻省理工学院化 学工程师 L a n g e r 与波士顿麻省大学医院医生 V a c a n t i 等1 7 1 共同提出t i s s u e e n g i n e e r i n g的概念， 并于 1 9 8 8 年由美国国 家科学基金会( N S F ) 的一个专门工作小组对组织工程的内 涵做了如下界定: 应用组织工程学和生命科学的原理和方法 来解释正常和病理的哺乳动物组织器官的结构功能关系， 并 且发展具有生物活性的人工替代物来恢复、 维持或提高组织 器官的功能。其基本思路是: 在体外分离、 培养细胞， 或对骨 髓千细胞进行

10、诱导分化， 并将一定数量的细胞种植到作为细 胞外基质的支架上， 加以持续培养， 并将之移植到体内进行 缺损的修复和重建。其具体程式可简化如下1 8 1 : 种子细胞 规模扩增和可降解材料构造设计和制备种植细胞、 组织三 维培养植人体内”整合组织器官功能恢复、 维持或提高。 利用组织工程技术研究自体细胞化的心脏瓣膜、 人工血管、 人工皮肤、 人工膀胧、 人工骨及软骨等已成为国内外研究的 热点， 并已取得了很大的进展。 2 食管组织工程细胞来源 食管上皮细胞增殖较快， 从 0 . 5 c m 的食管勃膜样本上 基金项目 作者简介 国家自然科学基金( 3 0 2 7 1 2 9 3 ) 鲍春荣( 1

11、 9 7 7 - ) ， 男( 汉族) ， 博士生， 住院医师 ， C o r r e s p o n d i n g a u t h o r . E - m a i l : d r n a i l ( a s i n a . c o m 万方数据 3 3 2第二军医大学学报2 0 0 5 年 3 月， 第 2 6 卷 获得的上皮细胞置于直径6 c m的培养皿中培养， 仅需 7 d 上 皮细胞就可融合并覆盖整个培养皿表面1 9 1 ， 这就使得将其应 用于临床成为可能。相关基础研究表明， 上皮细胞间以及与 无细胞支架间的相互作用是维持上皮细胞生长分化的重要 因素， 其中整合素( i n t e

12、 g r i n ) 起重要作用， 另外表皮生长因 子( E G F ) 、 转化生长因子( T G F ) 等多种因子也对之有影响。 S a t o 等D O 将人食管上皮细胞在胶原基质上培养， 然后一起 植人无胸腺大鼠的背阔肌内， 1 6 d后可见有上皮细胞层长 成， 并且胶原基质内有新生血管形成。之后他们又将人食管 上皮细胞在P G A胶原复合体上培养8 -1 2 d ， 再制成管状物 植人无胸腺大鼠背阔肌内， 2 8 d 后形成与正常食管相类似的 管状结构， 管腔通畅无狭窄， 腔内上皮细胞生长良好， 分层达 巧 层， 且有基底膜层生成 ， 习 ; 而与之作对照的未种植上皮细 胞的P G

13、 A胶原管移入大鼠体内后均逐渐塌陷， 不能维持管 状结构。在此基础上， Mi k i 等p 2 3 又在体外细胞培养阶段加 人了成纤维细胞以促进食管上皮细胞的增殖分化。结果发 现， 上皮细胞的分层程度与加人的成纤维细胞的密度成正 比， 当其密度达 8 X 1 0 5 / m l 时， 培育出来的管状物其上皮细 胞分层达到2 0层， 与人的正常食管相当， 这样可大大提高其 屏障保护能力。成纤维细胞的刺激作用可能与其分泌的角 化细胞生长因子( K G F ) 有关。 定， 若用它制成稳定的三维管状结构， 必须有外部支撑。为 了使 P G A网更加稳定， 将 P L A或 P L G A ( 1 :

14、 1 共聚) 溶于氯 仿后喷洒于用 P G A网制成的管子上。P L A或 P L G A覆盖 其上形成物理连接， 连接越多其强度越大， 取决于喷洒的浓 度和总量。喷洒了P L A的管子比喷洒了P L G A的强度大， 降解慢。喷有 P L A的管子种植于大鼠体内， 在血管组织生 长过程中能保持其结构， 形成了一个中空的管状结构。其实 验结果表明用牙科喷雾器将 5 % P L A从距离约 1 5 c m处向 转动着的P G A纤维网制成的管子喷洒 1 0 s ， 在时间和浓度 上最为合适。 4 食管组织工程的方法 3 食管组织工程支架材料 可适于作为组织工程支架的材料有可降解高分子基质 材料和

15、不可降解高分子材料， 可降解高分子材料又有两类， 即天然高分子材料( 即生物支架) 和合成高分子材料 卜 7 。 前者的特点是细胞相容性好， 亲水性强， 但强度较差; 后者虽 具有较长的耐久性和较强的弹性， 然而其固有的疏水性及其 与细胞作用的低赫附性， 以及体内降解产物具有一定毒性， 使其应用受到限制， 需进一步完善。组织工程食管天然生物 支架方面的研究不多， 主要是借鉴了其他器官组织工程研究 的方法。B a d y l a k 等 1 e 用猪小肠赫膜下组织( S I S ) 和膀胧薪 膜下组织( U B S ) 两种细胞外基质( E C M) 作为组织支架修补 狗食管缺损。在狗食管上人为

16、造成长 5 c m约半周缺损和完 全缺损， 用 E C M修补， 术后存活 4d到 1 5 个月。3 0 -6 0 d 后异源性支架完全吸收并被骨骼肌和完整的食管鳞状上皮 替代， 骨骼肌可能来源于与之相连的周围食管。管状替换的 食管4 5 d 时表现出明显狭窄。用 E C M作为支架来制成组 织工程食管来修补食管缺损成为一种可能， 但管状替换时狭 窄仍是一个主要问题。组织工程用高分子材料支架主要应 用聚经基酸类物质， 如聚乳酸( P G A ) 、 聚乙醇酸( P L A ) , 聚乙 醇酸与聚乳酸的共聚物( P L G A ) 等。M o o n e y 等 19 为了 探讨 用于组织工程支

17、架的P G A纤维网的合适条件进行了一系列 实验研究。非编织的 P G A纤维网有以下特征: ( 1 ) 高孔隙 率， 允许再生组织的新生血管形成; ( 2 ) 保证了营养物质的弥 散; ( 3 ) 易于制成各种几何形状; ( 4 ) 体内易降解， 安全无毒。 P G A是种植细胞的良好材料， 但抗压力强度不够， 结构不稳 考虑到缺少足够的血供是限制组织再生的主要原因， H o r i 等 1 4 在支架中加人碱性成纤维细胞生长因子( b E G F ) 以促进新生组织的血管形成。他们制作了两种支架: ( 1 ) 以 1 %盐酸胶原溶液通过离心、 冻干、 真空热交联制成胶原海绵 支架， 基底部

18、以带状P G A加强; 将b E G F以2 5 p g / m l 的浓 度溶于 P B S溶液中， 于移植前吸收到胶原海绵上; ( 2 ) 以 0 . 5 %盐酸胶原溶液与 D ME M液按 1: 4 混合， 调节 p H值 至7 . 4 ， 加人2 5 p g / m l b E G F 溶液( P B S ) 倒人底层铺有P G A 的模具中， 3 7 下 1 5 m i n 形成凝胶。将分别覆盖有这两种 支架( 含或不含 b E G F ) 的硅酮管植人狗颈段食管， 1 个月后 取出。在凝胶组， 加人 b E G F可以显著增加新生血管的数 量， 在明胶海绵组无显著差异。G r i

19、k s c h e i t 等 1 5 构建的人工 食管更加接近真正意义上的组织工程食管。其种子细胞参 照组织工程小肠的方法， 取新生或成年大鼠食管经过切碎、 清洗、 消化等步骤获得食管类器官单位( o r g a n o i d u n i t , O U ) 在体外进行培养。支架采用非编织 P G A纤维( 纤维直径 1 5 p m ， 厚度2 m m ， 密度6 0 m g / c m ， 孔隙率9 5 %) ， 制成1 c m 长管状( 外径0 . 5 c m， 内径。 . 2 c m ) o以5 % P L A氯仿溶液进 行封闭， 经灭菌、 清洗处理后， 将含绿色荧光蛋白的水泡性口

20、炎病毒( G F P - V S V ) 转染到O U中， 将O U种植于其上制成组 织工程食管种植于大鼠腹腔 内。4周后取 出已经形 成 3 c m X 2 c m X 2 c m至4 c m X 3 c m X 2 c m的囊状物， 其组织 学结构与天然食管相似。其腔内充满稀薄的私液， 内层覆盖 有类似正常食管的复层鳞状上皮细胞， 某些地方可以观察到 腺体， 平滑肌 。 一 肌动蛋白免疫组化染色阳性， 但仅间断存在， 少于正常食管。之后将改组织工程食管制成片状或管状植 人同源大鼠体内修补或替换部分大鼠腹段食管。2 周后处 死， 行组织学及 X线观察。大部分存活， 体质量增加， 无吞咽 困难

21、。补片组管腔无梗阻狭窄， 完全替换组上端吻合口狭 窄， 吻合口以上无扩张。下端吻合口无狭窄。无溃疡及组织 损伤。组织工程食管 G F P阳性， 正常食管阴性。 5展望 为使组织工程取得成功和发展， 有许多关键性领域需要 深人研究: ( 1 ) 细胞生物学方面， 是什么控制着细胞的分化和 万方数据 第 3 期.鲍春荣， 等. 组织工程食管的研究进展 3 3 3 生长?细胞或基质成分是怎样影响细胞功能的?免疫学和 分子基因学的研究将有助于细胞的设计或对不受免疫系统 干扰的细胞转移。( 2 ) 细胞来源方面， 移植的细胞可以来 自 细胞系或原始的组织， 从患者自己、 别人或来自动物或胎儿 组织。(

22、3 ) 冷冻保存虽已成功地被用于一些细胞， 但需要加 以扩大， 增加细胞库中细胞种类， 以适应不同组织的移植。 ( 4 ) 大规模的细胞培养系统需要用生物反应器， 以保证在移 植前体外所需细胞的增殖和解决体外培养中营养的运输问 题。( 5 ) 用于组织工程的材料方面， 天然材料含有信息如特 殊的氨基酸排列有利于细胞附着或保存分化功能的信息， 但 许多天然材料每批都不一样; 化学合成的聚合物， 则可精确 控制分子质量、 降解性、 亲水性和其他属性。目前的策略是 将天然的和化学合成的聚合物两者的优点加以结合， 即将天 然聚合物的氨基酸排列植人到化学合成的聚合物上。( 6 ) 材 料的加工是另一个关

23、键问题， 许多植人物是由合成的材料或 高度多孔的结构制成的， 制作这种能再生的植人物的方法可 能是取得成功的决定性因素。加人某些组织诱导因子、 生长 因子和血管生成刺激因子将有助于细胞和组织的生长。( 7 ) 细胞与材料之间的界面和表面活性问题， 与细胞接种后的贴 附、 生长、 增殖和存活有密切关系。( 8 ) 组织工程学的研究领 域、 应用方式将有所扩大， 其定义将有所修改或增补。在人 工食管替代物的研究中， 如何减轻癖痕增生、 预防狭窄的发 生仍是关键问题。组织工程化食管在具体临床应用中的效 果尚未可知， 但它是今后的发展趋势。进一步的研究包括: 上皮细胞与肌细胞的同时种植; 新生食管的神

24、经丛的再生; 如何促进新生血管的形成， 加快组织结构的重塑等。相 信随着研究的深人， 人工食管替代物将会有良好的应用前 景 。 6 Y a m a m o t o Y , N a k a m u r a T, S h i m i z u Y, e t a l . I n t r a t h o r a c i c e - s o p h a g e a l r e p l a c e m e n t i n t h e d o g w i t h t h e u s e o f a n a r t i f i c i a l e - s o p h a g u s c o m p o s e

25、d o f a c o l l a g e n s p o n g e w i t h a d o u b l e - l a y e r e d s i l i c o n e t u b e J . J T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g ， 1 9 9 9 , 1 1 8 ( 2 ) : 2 7 6 - 2 8 6 . 7 L a n g e r R , V a e a n t i J P . T i s s u e e n g i n e e r i n g J . S c i e n c e , 1 9 9 3 , 2 6 0 ( 5 1

26、1 0 ) : 9 2 0 - 9 2 6 . 8 T a o Z I .B i o m e c h a n i c p r o b l e m s i n t i s s u e e n g i n e e r i n g J . J Me d Bi o me c h，2 0 0 0 , 1 5 ( 2 ) : 6 7 . 9 Y a m a m o t o Y , N a k a m u r a T , S h i m i z u Y, e t a l . I n t r a t h o r a c i c e - s o p h a g e a l r e p l a c e me n

27、t w i t h a c o l l a g e n s p o n g e - s i l i c o n e d o u b l e l a y e r t u b e : e v a l u a t i o n o f o m e n t a l - p e d i c l e w r a p p i n g a n d p r o - lo n g e d p l a c e m e n t o f a n i n n e r s t e n t J . A S A I O J , 2 0 0 0 , 4 6 ( 6 ) : 7 3 4 - 7 3 9 . 1 0 S a t o M

28、, A n d o N, O z a w a S , e t a l . A h y b r i d a r t i f i c i a l e s o p h a - g u s u s i n g c u l t u r e d h u m a n e s o p h a g e a l e p it h e l ia l c e l l s 仁 J . AS AI O J , 1 9 9 3 , 3 9 ( 3 ) : M5 5 4 - M5 5 7 . 仁 1 1 N a g a s h i m a A, A n d o N , S a t o M, e t a l . B a s i

29、c s t u d ie s o n t h e a p - p l i c a t i o n o f a n a r t i f i c i a l e s o p h a g u s u s i n g c u l t u r e d e p i d e r m a l c e l l s J . S u r g T o d a y ， 1 9 9 7 , 2 7 ( 1 0 ) : 9 1 5 - 9 2 3 . 参 考 文 献 仁 1 2 Mi k i H, A n d o N , O z a w a S , e t a l . A n a r t i f i c i a l e s

30、 o p h a g u s c o n - s t r u c t e d o f c u l t u r e d h u m a n e s o p h a g e a l e p i t h e l i a l c e l l s , f i b r e - b l a s t s , p o l y g l y c o l i c a c i d m e s h , a n d c o l l a g e n J . A S A I O J ， 1 9 9 9 , 4 5 ( 5 ) : 5 0 2 - 5 0 8 . 1 3 S a t o M, A n d o N , O z a

31、w a S , e t a l . A n a r t i f ic ia l e s o p h a g u s c o n - s i s t i n g o f c u l t u r e d h u m a n e s o p h a g e a l e p i t h e l i a l c e l l s , p o l y g l y - c o l i c a c id m e s h , a n d c o l l a g e n J . A S A I O J ， 1 9 9 4 , 4 0 ( 3 ) : M3 8 9 - M3 9 2 . 1 4 H o r i Y ,

32、 N a k a m u r a T, K i m u r a D , e t a l . E f f e c t o f b a s i c f i b r o - b l a s t g r o w t h f a c t o r o n v a s c u l a r i z a t i o n i n e s o p h a g u s t i s s u e e n g i - n e e r i n g J . I n t J A r t i f O r g a n s , 2 0 0 3 , 2 6 ( 3 ) : 2 4 1 - 2 4 4 . 1 5 G r i k s c

33、h e i t T , O c h o a E R , S r in i v a s a n A, e t a l . T i s s u e - e n g i- n e e r e d e s o p h a g u s : e x p e r i m e n t a l s u b s t i t u t i o n b y o n l a y p a t c h o r i n t e r p o s i t i o n J . J T h o r a c C a r d i o v a s c S u r g ， 2 0 0 3 , 1 2 6 ( 2 ) : 5 3 7 - 5 4

34、 4 . 1 6 秦雄， 徐志飞， 史宏灿， 等. 组织工程构建人工食管的初步实 验研究 J 第二军医大学学报， 2 0 0 2 , 2 3 ( 1 0 ) : 1 1 3 4 - 1 1 3 7 . 1 7 史宏灿， 徐志飞， 秦雄， 等.生物材料人工气管的设计与动物 实验研究 J . 第二军医大学学报， 2 0 0 2 , 2 3 ( 1 0 ) : 1 1 4 2 - 1 1 4 5 1 8 B a d y l a k S , Me u r l i n g S , C h e n M, e t a l . R e s o r b a b l e b i o s c a f f o l d

35、 f o r e s o p h a g e a l r e p a i r i n a d o g m o d e l J . J P e d i a t r S u r g ， 2 0 0 0 , 3 5 ( 7 ) : 1 0 9 7 - 1 1 0 3 . 1 9 Mo o n e y D J , Ma z z o n i C L , B r e u e r C , e t a l . S t a b i l i z e d p o l y g l y - c o l i c a c i d f i b r e - b a s e d t u b e s f o r t i s s u

36、 e e n g i n e e r i n g J . B i o m a t e - r i a l s , 1 9 9 6 , 1 7 ( 2 ) : 1 1 5 - 1 2 4 . 收稿日 期 2 0 0 4 - 0 8 - 1 9 修回日期 2 0 0 4 - 1 2 - 1 5 本文编辑 曹静 jl|1 1今妇 厂L工|L 3 1 S c h e t t i n i S T, P i n u s J . G a s t r i c - t u b e e s o p h a g o p l a s t y i n c h i l d r e n J . P e d i a t r

37、S u r g I n t , 1 9 9 8 , 1 4 ( 1 - 2 ) : 1 4 4 - 1 5 0 . A h m a d S A, S y l v e s t e r K G, H e b r a A, e t a l . E s o p h a g e a l r e - p l a c e m e n t u s i n g t h e c o l o n : i s i t a g o o d c h o i c e J ? J P e d i a t r S u r g ， 1 9 9 6 ， 3 1 ( 8 ) : 1 0 2 6 - 1 0 3 0 . F u k u

38、 s h i m a M, K a k o N, C h i b a K, e t a l . S e v e n - y e a r f o l l o w - u p s t u d y a f t e r t h e r e p l a c e m e n t o f t h e e s o p h a g u s w i t h a n a r t i f i c i a l e s o p h a g u s i n t h e d o g J . S u r g e r y , 1 9 8 3 , 9 3 0 P t 1 ) : 7 0 - 7 7 G i u l m a m e

39、d o v P F . D i s e a s e s a n d p a t h o l o g i c a l s t a t e s o f a r t i f i c i a l e s o p h a g u s J . K l i n K h i r ， 1 9 9 8 , ( 4 ) : 7 - 9 . Y a m a m o t o Y, N a k a mu r a T, S h i m i z u Y, e t a l . E x p e r i m e n t a l r e p l a c e m e n t o f t h e t h o r a c i c e s o p h a g u s w i t h a b i o a b s o r b a b l e c o l - l a g e n s p o n g e s c a f f o l d s u p p o r t e d b y a s i l i c o n e s t e n t i n d o g s J . AS A I O J， 1 9 9 9 , 4 5 ( 4 ) : 3 1 1 - 3 1 6 . 11，es J件厂 一|仁厂 万方数据