编码鸡CD8α链无信号肽基因片段的克隆与表达.pdf

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1、安徽农业大学学报， 2006， 33 （1） ： 56-60 Journal of Anhui Agricultural University 编码鸡 CD8链无信号肽基因片段的克隆与表达* 谢国化1， 鲍 鸣1， 仲大莲2， 余为一 1* ， 李槿年1 （1. 安徽农业大学动物科技学院， 合肥 230036； 2. 中国科学技术大学生命科学学院， 合肥 230026） 摘 要： 应用 RT-PCR 技术， 通过自行设计的 1 对引物以 ConA 诱导的鸡胸腺淋巴细胞 RNA 为模板， 扩增出编 码鸡 CD8 链的无信号肽基因片段， 大小为 651 bp。该片段经酶切初步鉴定后， 被插入 pM

2、D18-T 载体进行测序， 发 现与已发表的鸡 CD8 链基因序列的同源性达 98%。进一步将该片段插入原核表达质粒， 构建 pGEX-4T-1-CD8， 并转化大肠杆菌 BL21。经 IPTG 诱导培养并提取表达蛋白质。在 SDS-PAGE 电泳图谱中可见大小约为 50 000 的 蛋白带， 表明所克隆的编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段在原核细胞中得到表达。 关键词： CD8； 鸡； 克隆； 原核表达 中图分类号： S831. 2； S852. 4文献标识码： A文章编号： 1672-352X （2006） 01-0056-05 Cloning and expression of the

3、gene fragment encoding chicken CD8 chain without signal peptide XIE Guo-hua1， BAO Ming1， ZHONG Da-liang2， YU Wei-yi1， LI Jing-nian1 （1. College of Animal Science and Technology，Anhui Agricultural University，Hefei 230036； 2. College of Life Science，Science and Technology University of China， Hefei 23

4、0026） Abstract： The total RNA was prepared from ConA stimulated thymocytes of a 5-week-old chicken according to the instructions of the trizol reagent. The CD8 alpha chain cDNA without its singal peptide sequence was amplified by reverse transcription polymerase chain reaction（RT-PCR）using a pair of

5、 gene specific primers. The obtained 651 bp fragment was identified by restriction enzyme digestion， the fragment was cloned to the pMD18-T vector and sequenced（the sequence has been deposited in GenBank with accession number of DQ202314） . The sequence showed 98% homology with that of published chi

6、cken CD8 alpha chain. Subsequently，the verified fragment was digested with EcoR and Sal and ligated to the pGEX-4T-1 vector using T4DNA ligase. The recombinant pro- karyotic expression plasmid， namely pGEX-4T-1-CD8， was transformed into Escherichia coli strain BL21 （DE3） and expressed as a GST fusio

7、n protein. The products were analyzed by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and a protein about 50 000 was observed. These suggest that the cloned gene encoding chicken CD8 alpha chain without signal peptide was expressed in prokaryotic system. Key words： CD8； chicken； cloning； prokaryotic expre

8、ssion CD8 分子是一种表达在成熟 T 细胞表面的 I 型 跨膜糖蛋白， 通常为细胞毒 T 细胞的表面标志 1。 研究发现， CD8 分子还是免疫细胞间互相作用的功 能蛋白， 比如在与 TCR-MHC I 类分子共同参与递呈 抗原中的细胞间识别作用。此外在恶性肿瘤及慢性 感染性疾病的免疫反应中也有作用 2， 3。CD8 分子 *收稿日期： 2005-10-06 基金项目： 国家自然科学基金 （30270974） 资助。 作者简介： 谢国化 （1979 - ） ， 男， 硕士研究生； 余为一 （1952 - ） ， 男， 博士， 教授， 博导。 * 通讯作者 （Corrresponding

9、 author） E-mail： yuweiyi sohu. com 以 CD8 同型二聚体或 CD8 异型二聚体的形式 存在 3， 4。T 细胞表面 CD8 链与 MHC I 分子的 Ig- SF 区域结合， 辅助 TCR 识别 Ag-MHC 复合体， 而 CD8 分子 链的胞内区 p56lck与酪氨酸激酶一起具 有调节 CD3/ TCR 复合体的机能， 在转导 T 细胞增 殖和分化信号中起重要作用 1， 3-6。CD8 链的羧基 端不具有 p56lck结构域， 目前认为 CD8 链仅仅起到 协助 CD8 链发挥其生物学活性的作用 3。鸡和哺 乳动物的 CD8 分子在生物化学和功能上的相似性

10、 很明显， 在鸡的免疫防御中起重要作用 3， 4。为进 一步研究鸡 CD8 分子在免疫中的作用机理， 作者克 隆编码鸡 CD8 链无信号肽片段基因， 并在大肠杆 菌中进行表达， 为制备其相应抗体及研究功能奠定 基础。 1 材料和方法 1. 1 试验材料 1. 1. 1 试验动物 SPF 鸡由安徽某鸡厂提供。 1. 1. 2 菌株和质粒 pMD18-T vector 购自 Takara 公司， DH5、 BL21 和原核表达质粒 pGEX-4T-1 由安 徽农业大学动物科技学院保存。 1. 1. 3 工具酶及试剂 DNA Marker DL 2000、 限制 性内切酶、 T4连接酶、 Taq 酶

11、和 dNTP 购自大连宝生 物工程有限公司； Trizol reagent 购自美国 Invitrogen 公司； 琼脂糖 （电泳纯） 购自上海生工生物工程公 司； 质粒纯化试剂盒、 DNA 清洁/ PCR 产物清洁试剂 盒、 DNA 提取试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限 公司； DNA/ Hind + EcoR、 EB、 氨卞青霉素、 蛋 白质低分子量参照物、 二硫苏糖醇 （DTT） 购自华美 生物工程公司； 胰蛋白胨、 酵母提取物为 OXID 产 品， ConA 购自南京生兴生物公司； 异丙基-D-硫代 半乳糖苷 （IPTG） 和 RNA 反转录试剂盒为 Promega 公司产品。 1.

12、1. 4 引物 根据 GenBank 报道的鸡 CD8 基因 mRNA 序列和原核表达质粒 pGEX-4T-1 多克隆位点 序列用 Primer Premier5. 0 软件辅助设计一对引物： CD8 链上游引物： 5-cccgaattcgcccagggacagaggaaca-3； CD8 链下游引物： 5-gcgtcgactcatatgtgtcgggttggca-3。 两条引物的 5端分别含有 EcoR和 Sal 酶 切位点， 预期扩增片段长度为 651 bp。引物由上海 生工生物工程有限公司合成。 1. 2 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的克隆与 鉴定 1. 2. 1 鸡胸腺淋巴细胞的

13、诱导培养及其总 RNA 的 提取 将 5 周龄的 SPF 鸡心脏采血处死， 无菌取其 胸腺， 在冷 Hanks 液中剪碎， 尼龙网过滤， 用淋巴细 胞分离液分离。洗涤后调整细胞终浓度为 8. 0 106个mL -1， 置无血清、 含 10 gmL-1 ConA 的 RPMI1640 培养液于 40， 5%CO2条件下孵育。7 h 后收集胸腺细胞， 使用 Trizol reagent 提取胸腺细胞 总 RNA。 1. 2. 2 RT-PCR 扩增 将上述抽提的总 RNA 置 42水浴反转录 1 h， 合成 cDNA 第一链， 并以其为 模板， 用 PCR 扩增 CD8 基因片段。PCR 扩增参照

14、 鲍鸣等 7方法进行。PCR 循环参数为： 94 1 min， 58 1 min， 72 2 min， 共 30 个循环， 最后 72 延 伸 8 min。反应产物用琼脂糖凝胶电泳检测。 1. 2. 3 RT-PCR 产物单酶切鉴定 反应产物经 Hind在37水浴3 h 后， 用琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1. 2. 4 感受态细胞的制备 参照 分子克隆实验 指南 8进行操作。 1. 2. 5 目的基因片段的克隆与鉴定 RT-PCR 产 物经 0. 8%的琼脂糖凝胶电泳后， 切下约为 651 bp 的 DNA 凝胶片段， 用 DNA 凝胶回收试剂盒回收产 物。回收的 PCR 产物用 EcoR和 Sa

15、l 双酶切， 再 经 DNA 清洁试剂盒纯化； 以同样方法处理 pGEX- 4T-1。纯化的 PCR 产物与 pGEX-4T-1 经 T4连接酶 连接， 构建成原核表达重组质粒 pGEX-4T-1-CD8， 进一步转化大肠杆菌 BL21， 具体操作参照 分子克 隆实验指南 8。以菌液为模板进行 PCR 鉴定， 提 取重组质粒进行双酶切鉴定。同时构建重组质粒 pMD18-T-CD8， 经 PCR 鉴定后送博亚公司测序。 测序结果用 Blast 和 DNAStar 软件进行同源性分析。 1. 3 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的表达与 鉴定 1. 3. 1 细菌的培养和蛋白质的提取 按照 分子

16、 克隆实验指南 8进行细菌培养和细菌蛋白提取。 1. 3. 2 表达产物的 SDS-PAGE 鉴定 蛋白提取物 用 SDS-PAGE 鉴定， 其浓缩胶为 3%， 分离胶 10%， 其他染色脱色等均参照 分子克隆实验指南 8进行。 2 结果与分析 2. 1 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的扩增和 单酶切鉴定 以 ConA 活化 7 h 鸡胸腺细胞总 RNA 为模板， 经 RT-PCR 得到的产物在琼脂糖凝胶电泳图谱中， 可见预期的目的基因条带大小约为 651 bp。应用 Primer premier 5. 0 软件分析鸡 CD8 链基因序列， 在146 bp 处有一 Hind酶切位点， 将

17、Hind与 RT- PCR 产物进行反应， 获得两条 DNA 片段 （图 1 泳道 7533 卷 1 期谢国化等 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的克隆与表达 2） ， 大小分别约为 146 bp 和 505 bp。 2. 2 编码鸡 CD8 无信号肽基因片段的克隆与序 列测定 用 Blast 和 DNAStar 软件分析比较测序结果， 表 明所克隆的基因片段序列 （图 2-C） 与 Tregaskes 等 9和胡青海等10发表的编码鸡 CD8 无信号肽 DNA 片段序列基本一致， 同源性为 98%。其中， 胞 外区的核苷酸序列有15 个碱基 （图2-A， B） 的差异， 分别导致 9 个氨

18、基酸 （Tregaskes 等 9， 图 3-A） 和 8 个氨基酸 （胡青海等 10， 图 3-B） 的改变； 跨膜区序 列完全相同； 胞内区序列则有一处碱基变化， 使第 191 位氨基酸由 R#G。 2. 3 原核表达质粒的鉴定 重组菌株的菌液 PCR 反应产物在琼脂糖电泳 图谱中， 可见 650 bp 处一特异性条带 （图 4 泳道 5） 。提取的重组质粒 pGEX-4T-1-CD8 经 EcoR 和 Sal 双酶切， 在琼脂糖电泳图谱中分别出现约 5 000 bp和 651 bp 两个片段 （图 4 泳道 4） 。 1： DNA Marker DL2000； 2： Products o

19、f RT-PCR/ Hind ； 3： Products of RT-PCR 图 1 RT-PCR 扩增产物及其单酶切鉴定结果 Figure 1 Identification of the RT-PCR product and its frag- ments by endonuclease A： 摘自 Tregaskes 9； B： 摘自胡青海10； C： 本文作者所克隆基因片段 （GenBank No. DQ202314） 。 A： Quoted from Tregaskes 9； B： Quoted from HU10； C： The DNA sequence of gene fragme

20、nt cloned by authors （GenBank No. DQ202314） . 图 2 不同来源鸡 CD8链基因核苷酸序列比较 Figure 2 Comparison of the nucleotide sequence of CD8 gene from different sources 2. 4 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段在大肠杆 菌中的表达 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段目为 651 bp， 预期表达的蛋白质大小约为 24 000， 胱甘肽 （GST） 大小为 26 000， GST- CD8 融合蛋白约为 50 000。含 pGEX-4T-1-CD8 的重组菌

21、BL21， 经诱 85安徽农业大学学报2006 年 导后的表达产物在 SDS-PAGE 中可见一浓染融合蛋 白条带 （图 5 泳道 5、 6） ， 而对照 pGEX-4T-1 转化菌 提取物只有 GST 条带 （图 5 泳道 2） ， 而未经诱导的 细菌提取物中没有相应蛋白条带 （图5 泳道1、 4） 。 A. 摘自 Tregaskes 9； B. 摘自胡青海10； C. 本文作者所克隆基因片段氨基酸序列。 A： Quoted from Tregaskes 9； B： Quoted from HU10； C： Amino acid sequence of gene fragment clone

22、d by authors. 图 3 不同来源鸡 CD8链基因氨基酸序列比较 Figure 3 Comparison of the amino acid sequence of CD8 gene from different sources 1：DNA/ Hind + EcoR marker；2：pGEX-4T-1； 3： pGEX-4T-1-CD8；4：pGEX-4T-1-CD8/ EcoR + Sal ； 5： Products of PCR； 6. DNA Marker DL2 000 图 4 pGEX-4T-1-CD8双酶切鉴定结果 Figure 4 Identification of

23、pGEX-4T-1-CD8 by endonuclease 1： Not induced pGEX-4T-1； 2： Induced by pGEX-4T-1 for 3 h； 3： Protein MW marker；4： Not induced by pGEX-4T-1-CD8； 5， 6： Induced by pGEX-4T-1-CD8 for 2 h， 3 h， respectively. 图 5 表达产物的 SDS-PAGE 图谱 Figure 5 SDS-PAGE map of expression products 3 讨论 鸡 CD8 cDNA ORF 全长为 708 bp，

24、 前 57 个碱 基为信号肽序列。由于该信号肽不是成熟 CD8 链 所必需， 为便于在 E. coli 中表达和制备抗体 11， 所 以本研究在克隆 CD8 基因时删除了该片段。 如图 1 所示， RT-PCR 扩增出一条长约 651 bp 的 DNA 片段， 并经内切酶 Hind酶切后， 形成两个 与预期大小相符的片段。图 2 测序结果也证明， 所 克隆的是编码 CD8 链无信号肽基因片段。重组质 粒 pGEX-4T-1-CD8 经双酶切后， 得到两段相应大 小 DNA 片段 （图 4） ， 而且在大肠杆菌中也能很好表 达 （图 5） 。所有这些均说明了 CD8 链基因片段的 成功克隆和表达

25、。 CD8 分子是 T 淋巴细胞表面跨膜糖蛋白， 也是 T 淋巴细胞重要的表面标志。比较本研究克隆的鸡 CD8 与 Tregaskes 9和胡青海10克隆登录的鸡 CD8 DNA 序列， 尽管同源性高达 98%， 但是差异 主要存在胞外区 （15 个碱基） ， 胞内区只有 1 个。与 GenBank 中 其 他 登 录 的 相 应 序 列 Luhtala 4， 12、 Chan 13比较， 也发现有数量相近的核苷酸差别， 这 说明鸡 CD8 链基因高度保守， 在胞外区存在一定 的可变性。此外， 鸡的 CD8 链与人和鼠相比， 该区 段的同源性却分别只有 14. 9%和 13. 7%， 种间差异

26、 明显。但是， 这种差异并不影响动物 CD8 在功能上 的一致性 9。 参考文献： 1 金伯泉. 细胞和分子免疫学 M . 2 版 . 北京： 科学出版 社， 2001. 2 Cantor H， Boyse E A. Functional subclasses of T-lympho- cytes bearing different Ly antigens. I. The generation of functionally distinct T-cell subclasses is a differentiative process independent of antigen J . J

27、Exp Med， 1975， 141： 1376-1389. 9533 卷 1 期谢国化等 编码鸡 CD8 链无信号肽基因片段的克隆与表达 3 David K C，George F G. CD8： adhesion molecule， co-re- ceptor and immuno-modulator J . Cellular & Molecular Immunology， 2004， 1 （2） ： 81-88. 4 Luhtala M. Chicken CD4，CD8 and CD8 T cell co- receptor molecules J . Poultry Science， 1

28、998， 77： 1858- 1873. 5 Dieter Naeher， Immanuel F L， Palmer E D. A role for the -chain connecting peptide motif in mediating TCR-CD8 cooperation J . J Immunol， 2002， 169： 2964-2970. 6 Akihiro Konno， Kanae Okada， Kazunori Mizuno， et al. CD8 memory effector T cells descend directly from clon- ally expa

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30、 and analysis of the expression of CD8 alpha beta and CD8 alpha alpha isoforms in chickens reveals a major TCR- gamma delta CD8 alpha beta subset of intestinal intraepi- thelial lymphocytes J . J Immunol， 1995， 154 （9） ： 4485- 4494. 10 胡青海， 焦新安， 徐耀辉， 等. 鸡 CD4 和 CD8 基因 cD- NA 的克隆及其真核表达质粒的构建 J . 扬州大学学

31、 报： 农业与生命科学版， 2004 （4） ： 56-60. 11 郑斌， 詹希美. 信号肽序列及其在蛋白质表达中的应用 J . 生物技术通讯， 2005， 16 （3） ： 296-298. 12Luhtala M， Tregaskes C A， Young J R， et al. Polymorphism of chicken CD8-alpha， but not CD8-beta J . Immunogenet- ics， 1997， 46 （5） ： 396-401. 13Chan M M， Chen C L， Ager L L， et al. Identification of t

32、he avian homologues of mammalian CD4 and CD8 antigens J . J Immunol， 1988， 140 （7） ： “ 2133-2138. 安徽农业大学学报 征稿简则 1.安徽农业大学学报 为国内外公开发行的综合性学术刊物， 面向国内外征稿， 主要刊登农学、 林学、 畜牧、 兽医、 水产、 茶叶、 蚕桑、 园艺、 植保、 农业工程、 生物技术、 环境科学、 农业经济以及相关基础学科的学术论文、 研究报告等。 2. 来稿要论点明确， 数据可靠， 论证严谨， 文字简炼， 标点准确。按下列顺序行文： 题名、 作者姓名、 作者单位 （地址、 邮政

33、编 码） 、 中文摘要 （100 300 字符） 、 关键词、 中国图书馆分类法分类号、 正文、 参考文献、 英文题名、 作者姓名的汉语拼音、 作者 单位英文名称、 英文摘要 （500 1500 字符） 和英文关键词。全文一般不超过 8000 字。 3. 动植物的拉丁学名排斜体。文中量、 单位和符号必须以最新颁布的 中华人民共和国国家标准量和单位 为准。组合单 位一律用负指数表示。外文字母必须分清英文或希腊文正斜体、 大小写、 黑白体和上下角标。 4. 论文中的所有数字请按 关于出版物上数字用法的规定 的要求书写。凡是可能使用阿拉伯数字而且又很得体的地方均须 使用阿拉伯数字。 5. 正文的标题

34、层次用阿拉伯数字编号， 不同层次的数字之间用下圆点 “. ” 相隔， 如 “1” ，“2. 1” ，“3. 1. 2” ， 并一律左顶格。 6. 应在篇首页的地脚处注明论文产出自何种基金资助项目或科技攻关项目。 7. 表要简明， 采用三线表， 应有表序与表题。图要精选， 应有图序与图题。插图要求布局合理， 比例适当， 大小适中， 线条精细 均匀， 主副线分明。照片要求黑白清晰， 层次分明。图、 表均应插放在文中第一次提到该图、 表的正文下面。表、 图内容均 须用中、 英文双重表达。图表中参数应标明量和单位的符号。数据应有必要的统计分析。 8. 参考文献只择最主要的、 最新的、 公开发表的列入，

35、 其序号按文中出现先后为序编排。著录格式按 GB/ T 7714 -2005 编排。 9. 来稿请务必附第一作者的出生年份、 性别、 职称 （职务） 、 学位和联系方式等个人信息。 10. 来稿如不符合上述要求， 则退还作者修改。编辑部有权对采用稿件作非思想性的文字修改、 删节。 11. 来稿一经发表， 即酌致稿酬。请勿一稿两投。稿件经审查同意发表， 即通知作者支付版面费和交定稿电子文档。如 3 个 月内接不到通知， 作者可自行处理稿件。未采用的稿件一般不退， 请作者自留底稿。 12. 请在投稿时交电脑打印稿一式两份及稿件审理费 50 元。来稿请寄： 合肥市长江西路 130 号安徽农业大学学报编辑部收， 邮政编码： 230036。也可通过本刊电子信箱投稿。联系电话：（0551） 2810205。E-mail： ahnydxxb mail. hf. ah. cn 06安徽农业大学学报2006 年