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1、I CS 0 7 . 1 0 0 . 3 0 C 5 3 荡黔 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准 G B / T 1 9 9 1 5 . 9 -2 0 0 5 猪链球菌 2 型溶血素基因P C R 检测方法 De t e c t i o n me t h o d o f t h e S t r e p t o c o c c u s s u i s h e m o l y s i n g e n e f o r t y p e 2 b y P C R 2 0 0 5 - 0 9 - 2 7发布2 0 0 5 - 1 1 - 0 1 实施 中 华人民 共和 国国家 质量 监督 检验 检
2、疫总 局 中 国 国 家 标 准 化 管 理 委 员 会 发 布 G B/ T 1 9 9 1 5 . 9 -2 0 0 5 前言 猪链球菌 2型是链球菌属的成员， 其致病菌株可致猪链球菌病， 引起猪败血症、 脑膜炎等近年来， 随着我国养猪业的发展， 该病流行日趋严重， 给养猪业带来巨大损失。人可通过伤口感染该菌， 并导致 死亡。溶血素是猪链球菌 2 型一种重要毒力因子。通过检测猪及其产品中分离菌株是否含有猪链球菌 2 型溶血素基因， 可以作为区分猪链球菌 2 型无毒菌株与致病菌株的一个指标， 特制定本标准。 本标准的附录A为规范性附录。 本标准由国家标准化管理委员会提出。 本标准由全国动物防
3、疫标准化技术委员会归口。 本标准主要起草单位: 中华人民共和国江苏出人境检验检疫局、 中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人: 陈国强、 唐泰山、 张敬友、 姜众、 王凯民、 张常印、 林祥梅、 吴绍强、 刘建、 韩雪清、 贾广乐 、 梅琳 。 GB / T 1 9 91 5 . 9 -2 0 0 5 猪链球菌 2型溶血素基因 P C R 检测方法 范 围 本标准规定了猪链球菌2型溶血素基因 P C R检测的操作方法。 本标准适用于猪及其产品中分离菌株的猪链球菌 2 型溶血素基因的检测。 规范性 引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件， 其随后所
4、有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2 分析实验室用水规格和试验方法 术语和定 义 下列术语和定义适用于本标准。 3 . 1 猪链 球菌2 型 S t r e p t o c o c c u s s u i s t y p e 2 猪链球菌是属于链球菌属的 一种细菌， 根据其英膜多糖抗原的差异， 可分为1 -3 4 及1 / 2 共3 5 个 血清型。猪链球菌2型是猪链球菌的一个血清型， 不仅对猪致
5、病性很强， 而且可以感染特定的人群， 是 一种重要 的人 畜共患病病原菌 。 缩略语 P CR DN A d NTP b y p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n , 聚 合酶 链式反应 d e o x y r i b o n u c l e i c a c id ， 脱氧核糖核酸 d e o x y r i b o n u c l e o s i d e t r i p h o s p h a t e ， 脱氧核昔酸三磷酸 b a s e p a i r ， 碱基对 测定方法 5 . 1 方法提要 以可疑细菌培养物提取的核酸， 作为D N
6、 A模板进行P C R扩增， 琼脂糖凝胶电泳检测P C R产物， 与 标准分子量标记比较， 来确定扩增产物的大小。 5 . 2 试荆和材料 除另有规定， 所用试剂均为分析纯， 水为符合 G B / T 6 6 8 2 -1 9 9 2的灭菌双蒸水。 5 . 2 . 1 猪链球菌 2型溶血素基因 P C R反应混合物: 1 0 X P C R缓冲液 2 . 5 ti L , 2 5 mm o l / L Mg C l , 2 . 0 p L , 2 . 5 m m o l / L d N T P 2 p L 、 上下游引物各1 p L ， 用双蒸水补至2 0 I L 。 引物序列如下， 其目 的
7、片 段长度为 4 9 5 6 p , s l y 1 : 5 0 0 0 , A A G, T T C , A A G , C C G , C A T , T T A 3 ( 1 5 4 2 ) s I y 2 : 5 G A A , G A T , T G C , G A G , C A T , T T C , C T G 3 ( 2 0 3 6 ) 5 . 2 . 2 T a q D N A聚合酶。 GB / T 1 9 9 1 5 . 9 - 2 0 0 5 5 . 2 . 3 琼脂糖: 电泳级。 5 . 2 . 4 澳化乙锭 5 . 2 . 5 酚: T r i s 饱和。 5 . 2
8、 . 6 三氯甲烷。 5 . 2 . 7异戊 醇。 5 . 2 8 异 丙醇。 5 . 2 . 9 7 0 %乙醇。 5 . 2 . 1 0分子量标记 : DL 2 0 0 0 5 . 2 . 1 l 十六烷基三甲基嗅化按( C T AB ) 提取液: 0 . 1 mm o l / L T r i s - HC 1 ( p H 7 . 5 ) , 1 0 m mo l / L E D T A ( p H 7 . 5 ) , 2 % C T A B , 0 . 7 m m o l / L N a C l , I %日 一 琉基乙醇。 5 . 2 . 1 2 TE缓冲液: 1 0 m mo l/
9、L T r i s - H C I ( p H 8 . 0 ) , 1 mm o l / I . E D T A( p H 8 . 0 ) . 5 . 2 . 1 3 1 0 X P C R 缓冲液: 1 0 0 mm o l / L K C I , 1 6 0 m mo l/ L ( NH 4 ) 2 S 0 2 0 mm o l / L Mg S 0 , 2 0 0 mm o l / L Tr i s - HC I ( p H 8 . 8 ) , 1 %T r i t o n X - 1 0 0 , 1 mg / m L B S A. 5 . 2 . 1 4 电泳缓冲液: 2 4 2 g
10、T r i s , 5 7 . 1 ml 一 冰乙酸， 1 0 0 ml - 0 . 5 m o l / L E D TA( p H8 . 0 ) ， 加蒸馏水至 1 0 0 0 m l - ; 使用时1 0 倍稀释 5 . 2 . 1 5 加样缓冲液: 0 . 2 5 %澳酚蓝， 4 0 %蔗糖。 5 . 3仪器和设备 5 . 3 . 1离心机 。 5 . 3 . 2 D NA热循环仪。 5 . 3 . 3 核酸电泳仪。 5 . 3 . 4 p H计。 5 . 3 . 5 移液器: 1 0 p L , 2 0 VI-,100 p L , 1 0 0 0 I r L a 5 . 3 . 6 紫
11、外线透射仪或凝胶成像系统。 5 . 3 . 7恒温水浴锅 5 . 4 操作步骤 5 . 4 .1 样品处理和基 因组 DNA的提取 取可疑细菌的培养物 1 . 0 ml , , 1 0 0 0 0 r / mi n 离心 1 mi n ， 沉淀用 5 6 0 p L T E缓冲液悬浮， 或挑取可 疑细菌菌落， 用 5 6 0川一 T E缓冲液悬浮， 加人3 0 川 1 0 %十二烷基硫酸钠( S D S ) 和3 p L 2 0 g / L蛋白酶 K, 3 7 0C水浴 6 0 mi n 后 ， 再加人1 0 0 p L 5 mo l / L N a C l 和8 0 p L C TA B /
12、 N a C l , 6 5 0C水浴 1 0 mi n ， 加人体 积比为 2 5， 2 4，1 的酚+三氯甲烷+异戊醇混合液 7 7 0 p L , 混匀， 4 0 C 1 2 0 0 0 r / mi n离心 5 m i n ， 取 4 0 0川 上清液; 加人体积比2 4 : 1的三氯甲烷+异戊醇混合液 4 0 0 V L , 混匀， 4 0C 1 2 0 0 0 r / mi n离心 5 m i n ， 取 2 0 0 u l上清液加人等体积的异丙醇沉淀; 4 0 C 1 2 0 0 0 r / mi n 离心 1 5 mi n ， 弃上清; 7 0 %乙醇洗 涤一次， 晾干; 加人
13、5 0 p L双蒸水溶解沉淀。 也可用等效的D NA提取试剂盒提取 D NA模板。 5 . 4 . 2 P C R扩增 取比待检菌株数多两只的猪链球菌 2型溶血素基因 P C R反应混合物的P C R管， 2 0 0 0 r / min 离心 1 0 s 后各加人 T a y酶( 2 . 5 U / p L ) 0 . 3川 ， 分别加人待检菌株 D N A提取物和阴性、 阳性核酸对照5 . 0 V L 到 P C R管中， 2 0 0 0 r / mi n 离心 1 0 s ， 立即进行P C R扩增扩增条件为: 9 5 预变性5 m i n ; 9 4 0C 1 m i n , 5 6 0
14、 C 1 mi n , 7 2 0C 1 m i n , 3 5 个循环; 7 2 0C延伸 1 0 min , 4 0 C 保存。 5 . 4 . 3 P C R扩增产物电泳检测 取1 . 5 g 琼脂糖， 于1 0 0 m L电 泳缓冲液中加热， 充分溶化， 制胶。 在电 泳槽中加人电 泳缓冲液， 使 液面刚刚没过凝胶 。取 2 0川 P C R扩增产物分别和适量加样缓冲液混合后加样， 进行电泳。电压大小 根据电泳槽长度来确定， 一般控制在 3 V / c m-5 V/ c m， 电泳时间为3 0 m i n -3 5 mi n 。将电泳好的凝胶 2 GB / T 1 9 91 5 . 9
15、 -2 0 0 5 放人终浓度为1 k g / mL的澳化乙锭染色缓冲液中染色 1 5 m i n -2 0 m i n ， 在紫外线透射仪或凝胶成像系 统上观察结果， 并做好试验记录和样品位置。 6 结果及判断 6 . 1 试验结果成立条件 阳性对照的 P C R产物电泳后在 4 9 5 b y的位置上出现一条特异性条带， 阴性对照 P C R产物电泳后 没有条带， 试验结果成立; 否则， 结果不成立 6 . 2 结果判断 6 . 2 . 1 在试验结果成立的前提下， 如果样品中 P C R产物电泳后在 4 9 5 b y的位置上出现一条特异性条 带， 判为该菌株含有猪链球菌 2 型溶血素基
16、因 6 . 2 . 2 在试验结果成立的前提下， 如果样品中 P C R产物电泳后在 4 9 5 b y的位置上未出现一条特异性 条带， 判为该菌株不含有猪链球菌 2 型溶血素基因。 7 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物， 应收集后高压灭菌处理。 检测过程中防止交叉污染的措施见附录 A, G B/ T 1 9 9 1 5 . 9 -2 0 0 5 附录A ( 规范性附录) 检测过程中防止交叉污染的措施 A. 1 抽样和制样过程 抽样和制样工具， 应清洗干净， 1 2 1 0C, 1 5 mi n -2 0 mi n 灭菌， 一套清洁工具限于一个样品使用。存 放样品的容器应该经过清
17、洗、 灭菌， 或为一次性灭菌容器。 A . 2 检测过程 A . 2 . 1 P C R实验室应分为样品制备区、 前 P C R区、 P C R区、 后 P C R区。将模板提取、 P C R反应液配 制、 P C R循环扩增及P C R产物的鉴定等步骤分区或分室进行。实验室的运作应从“ 净区” 到“ 脏区” 单 方 向进行 。 A . 2 . 2 实验过程中， 应穿实验服和戴手套， 手套要经常更换。各区要有专用实验服， 经常清洗。 A . 2 . 3 各区所有的试剂、 器材( 尤其是移液器) 、 仪器都应专用， 不得带出该区。 A . 2 . 4 所有溶液、 水、 耗材和器具要1 2 1 0
18、C, 1 5 mi n -2 0 mi n 灭菌， 避免核酸和( 或) 核酸酶污染。每种 溶液应使用高质量的成分和新蒸馏的双蒸水。在2 0 0C-2 5 0C 贮存的试剂中， 可加 0 . 0 2 5 %的叠氮钠 所有试剂应该以大体积配制， 然后分装成仅够一次使用的量进行贮存。 A . 2 . 5 装有 D N A模板或引物的离心管打开之前， 要简短离心， 离心管不能用力崩开， 以免产生气 溶胶 。 A . 2 . 6 前 P C R区中， 最好能在 P C R操作箱中加人 P C R反应各组分。 A . 2 . 7 实验前后， 实验室用紫外线消毒以破坏残留的D NA, A. 2 . 8可伸
19、用 UDG和 d UTP系统控制污染 。 *草庐一苇草庐一苇*提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 提供优质文档， 如果 你下载的文档有缺页、 模糊等现象或 者遇到找不到的稀缺文件， 请发站内 信和我联系！我一定帮你解决！ 本人有各种国内外标准 20 余万个， 包括全系 列 GB 国标国标及国内行业行业及部门标准部门标准，全系列 BSI EN DIN JIS NF AS NZS GOST ASTM ISO ASME SSPC ANSI IEC IEEE ANSI UL AASHTO ABS ACI AREMA AWS ML NACE GM FAA TBR RCC 各国船级 社 船级 社 等大量其他国际标准。豆丁下载网址：豆丁下载网址： http:/