SN-0295-1993.pdf

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1、SN 中华人民共和国进出口商品检验行业标准 s N 0 2 9 5 一 9 3 出口禽肉中杆菌肤残留量检验方法 杯碟法 M e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u l t r y me a t f o r e x p o r t -C y l i n d e r - p l a t e m e t h o d 1 9 9 3 一 1 2 一 2 8 发布1 9 9 4 一 0 5 一 0 1 实施 中华人民共和国国家进出口商品检验局发布 中华

2、人民共和国进出口 商品检验行业标准 出口 禽肉中 杆菌肤残留量检验方法 杯碟法 S N 0 295 一 93 M e t h o d f o r t h e d e t e r m i n a t io n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u l t r y m e a t f o r e x p o r t -Cy l i n d e r - p l a t e me t h o d 主题内容与适用范围 本标准规定了出口禽肉中杆菌肤残留量的抽样、 制样和杯碟测定法。 本标准适用于出口冻鸡中杆菌肤残留量的检验. 引用标准 S N

3、0 1 7 9 出口食品中四环素族抗生素残留量检验方法 抽样和制样 3 . 1 检验批 以不超过 2 5 0 0 件商品为一检验批. 同一检验批的商品应具有相同特征， 如包装、 标记、 产地、 规格和等级等。 3 . 2 抽样数量 批量， 件最低抽样数， 件 1 2 5 1 2 6 1 0 0 5 1 0 1 - 2 5 0 1 0 2 5 1 5 0 0 1 5 5 0 1 - 1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 - 2 5 0 0 2 0 3 . 3 抽样方法 按 3 . 2 规定的抽样件数随机抽取， 逐件开启。每件至少取一袋作为原始样品， 原始样品总量不少于 2 k g ， 放人清洁

4、容器内， 加封后， 标明标记， 及时 送交实 验室。 3 . 4 样品制备 从每袋原始样品中取出部分有代表性祥品， 将可食部分放人绞碎机中绞碎均匀， 充分混匀。 用四分 法缩分不少于 1 k g试样。装入清洁容器内， 加封后， 标明标记。 I5 样品保存 将试样于一1 8 0C冷冻保存。 注:在抽样及制样过程中 必须防止样品受到污染或发生残留物含量的变化。 中华人民共和国国家进出口商品检验局1 9 9 3 - 1 2 - 2 8 批准1 9 9 4 一 0 5 一 0 1 实施 I s N 0 295 一 93 4 测定方法 4 . 1 方法提要 用3 3 %毗吮 溶液 提取试 样中 杆菌肤，

5、 将提取液再用甲 醉提取， 经减 压浓缩至干， 用磷酸盐 缓冲液溶 解残留物， 调整 p H后用杯碟法测定。 4 . 2 设备和材料 4 . 2 . 1 培养皿: 内径 9 0 mm， 底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿， 并应配有陶瓦盖。 4 . 2 . 2 牛 津杯: 外径7 . 8 4 - 0 . 1 m m， 内 径6 . 0 士 。 . 1 m m， 高1 0 1 0 . 1 m m， 不锈钢管。 4 . 2 . 3 游标卡尺: 测量范围。 2 0 0 mm， 精度 。 . 0 2 m m， 或使用抑菌圈测量仪测量。 4 . 2 . 4 离心机: 转速 3 0 0 0 r / mi n ,

6、 4 . 2 . 5 旋转式真空浓缩器。 4 . 2 . 6 恒温培养箱: 3 6 士1 C。 4 - 2 . 7 高压灭菌器， 4 . 2 . 8 其他: 玻璃板， 吸管， 滴管， 茄形瓶等. 4 . 3 试剂和培养基 4 . 3 . 1 试剂 4 . 3 - 1 - 1 毗陡: 分析纯。 4 . 3 . 1 . 2 毗吮溶液: 3 3 Y . 。取毗lt 3 3 mL， 用蒸馏水定容至 1 0 0 mL , 4 . 3 . 1 . 3 甲醇: 分析纯。 4 . 3 . 1 . 4 磷酸盐缓冲液: 5 % , p H 6 . 5 ,称取2 2 . 1 5 g 无水磷酸氢二钾和2 7 . 8

7、5 g 无水磷酸二氢钾溶解 干 蒸馏水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 . 3 . 15 氢氧化 钠溶液: 1 m o l / L , 4 . 3 . 1 . 6 磷酸盐缓冲湾: 1 %, p H 6 . 0 ,称取2 . 0 g 无水磷酸氢二钾和8 . 0 g 无水磷酸二氢钾溶解于蒸 馏水中， 定容至1 0 0 0 m L , 4 . 3 . 1 . 7 杆菌肤标准品: 5 8 I U / m g ( 卫生部药品 生物制品 检定所提供) 。 4 . 3 . 1 . 8 试验菌种: 藤黄微球菌C Mi c r o r o r c u s L u t e u s ? , 菌种号 2 8

8、 0 0 8 ( 卫生部药品生物制品检定所提 供) 。 4 . 3 . 2 培养基 4 . 3 . 2 . 1 增菌用培养基; 见附录 A第Al 章。 4 . 3 - 2 . 2 基层用培养基: 见附录 A第A2 章。 4 . 3 - 2 . 3 菌种层用培养基: 见附录A第A3 章。 4 . 4 测定步骤 4 . 4 . 1 工作液制备 4 . 4 . 1 . 1 杆菌肤标准贮备液 准 确称 取适量的杆菌肤标准品， 用1 0 o p H 6 . 0 磷酸盐缓冲液配制成1 0 0 l U / m L的 标准贮备液， 于 冰箱中保存， 可使用一周。 4 . 4 - 1 . 2 杆菌肤标准工作液

9、吸取一定量杆菌肤标准贮备液， 用1 % p H 6 . 0 磷酸盐缓冲 液稀释成0 . 1 5 和0 . 6 I U / m i的工作标 准液， 以 及。0 2 5 , 0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 2 0 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 I U / m L的稀释液， 作为制备标准曲线的标准浓度 溶液， 0 . 1 0 0 I U / m L 的稀释液为 参考浓度溶液。以 上稀释液均须当日 配制。 4 . 4 . 1 . 3 菌种培养及菌液的制备 将试验菌种安瓶瓶上部消毒后敲碎， 加入少量增菌用培养基( 4 . 3 . 2 . 1 ) 溶解后， 移入以

10、上培养基中， 混匀后于3 6 士1 培养 2 4 h ， 再转接至琼脂试管斜面( 4 . 3 . 2 - 3 ) ， 培养 1 6 - 1 8 h ， 然后加入适量生理盐 2 S N 0 2 9 5 一 9 3 水， 将菌苔洗下， 备用。 4 . 4 . 2 试液制备: 准确称取经绞碎混匀的试样1 0 . 0 g 于 均质 器内， 加人1 7 m L 毗咤溶液( 3 3 0 o ) ， 均质 3 m i n后， 移入离心管中离心2 0 min ( 3 0 0 0 r / m i n ) 。 取上清液 1 0 mL, 置于另一个离心管内， 加入3 0 m L 甲 醇充分振摇2 m i n ， 再

11、离心2 0 m i n ( 3 0 0 0 r / m i n ) 。 将上清液移入茄形瓶中， 减压 浓缩至干， 加入3 m L 磷酸盐缓冲液( 5 %) 溶解即为样液.此样液中相当 于禽肉 试样浓度为1 . 9 6 g / m L . 4 . 4 . 3测定 4 . 4 - 3 . 1 平板制备 于无菌平皿中加入2 0 m l , 熔化的基层用培养基( 4 . 3 . 2 . 2 ) ， 保持水平， 待其凝固备用。 然后， 将锥形 瓶中菌种层用培基( 4 . 3 . 2 . 3 ) 经熔化并冷却至 5 0 5 5 0C， 加人适量的试验菌液( 4 . 4 . 1 . 3 ) 使之充分混合 后

12、， 取 4 ml , 注入上述基层培养基上 保持水平， 待其凝固。 在测定前应先用。 . 1 5 川 / m L标准工作液对 该菌液浓度的平板进行预测试， 经培养后其标准工作液所呈现的抑菌圈直径在1 0 mm以上， 则该菌液 浓度的平板即可使用， 否则须调整其菌液浓度， 制成合于检定用的平板。 4 . 4 . 3 . 2 标准曲线的制备 可参 照S N 0 1 7 9 -9 2 中 的6 . 1 4 . 4 - 3 . 3 检测 每个样品用三个检定平板， 在每个平板上， 如不需定量时， 置 4只消毒的牛津杯， 对角 2只注满样 液， 剩余的 2 只杯里分别注满0 . 6 I U/ mL和 。

13、. 1 5 I U / m L杯菌肤标准工作液; 如需定量时， 须置6只消 毒的牛津杯， 间隔注满样液和。 . 1 I U/ mL杆菌肤标准工作液， 于3 6 士1 培养 1 7 士1 h o 4 . 5 结果计算和表述 4 . 5 . 1 结果计算和表述 在三个检定平板上， 如样液呈出与 。 . 6I U/ m L和 0 . 1 5 I U/ mL标准工作液相同的清晰抑菌圈时， 可用游标卡尺或测量仪进行测量， 其抑菌圈平均直径在 1 0 mm以上者为阳性。 对于需定量的实验结果， 将分别算出三个检定平板上 。 . II U / m L和样液的抑菌圈直径的平均值， 经校正后， 于标准曲线上查出

14、其抑菌圈直径的平均值所对应的标准浓度值， 通过式( 1 ) 计算可得出祥品 中抗生素的含量: (1 ) c-阴 - X 式中: X 样品中杆菌肤的含量, I U / g ; c 从标准曲线上查出祥液所对应的抗生素浓度， I U/ mL ; m 最终试液所代表的禽肉试样的 浓度， g / m L , 4 . 5 . 2 结果换算 如果样品中杆菌肤含量的单位 要采用m g / k g 表示时， 可将I U / g 按照下述方法进行 换算: 标准品中 杆菌肤含量=A I U / m g 样品中杆菌肤含量=B I U/ g 1 I U=1 / A m g 二1 / AX1 0 j g (2 ) B I

15、 U/ g =B / AX 1 0 j g / g =B / AX 1 0 mg / k g 。 (3 ) 式中: A标准品中杆菌肤含量的数值; B 依据式( 1 ) 计算所得到的样品中杆菌肤的数值。 S N 0 2 9 5 一9 3 测定低限、 回收率 测定低限 本方法测定低限为。 . 0 2 5 I U / g , 回收率 回 收率的 数据: 杆菌肤添加 浓度在。 . 0 2 5 0 . 1 0 0 I U / g 范围内， 回收 率为7 4 . 8 0 0 1 0 8 . 8 0 x , s N 02 95 一 9 3 附录A 培养墓成分及制备方法 ( 补充件) A l 增菌用培养墓 蛋

16、白 陈1 0 . 0 g 牛肉 浸膏5 . 0 g 氯 化钠2 . 5 9 蒸馏水1 0 0 0 mL 将上述各成分于蒸馏水中加热溶解， 用 1 mo l / L氢氧化钠溶液或 1 0 %盐酸调节 p H， 使其灭菌后 p H为 7 . 0 士。 . 1 ， 分装于小试管中， 每管约3 m L， 于 1 2 1 0C1 5 m i n高压灭菌。 A 2 基层用 培养墓 蛋白 陈6 . 0 9 牛肉 浸膏1 . 5 g 醉母浸膏3 . 0 g 琼脂1 5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将上述各成分于蒸馏水中加热溶解， 用 1 m o l / L氢氧化钠溶液或 1 0 %盐酸调节 p

17、H， 使其灭菌后 p H为6 . 5 士0 . 1 ， 分装于锥形瓶内， 于 1 2 1 0C 1 5 mi n高压灭菌， 备用。 A 3 菌种层用培养 墓 蛋白 陈6 . 0 g 牛肉浸 膏1 . 5 9 酵母浸膏3 . 0 g 葡萄糖1 . 0 9 胰酪蛋白4 . 0 g 琼脂1 5 . 0 g 蒸馏水1 0 0 0 m L 将上述各成分于蒸馏水中 加热溶解， 用1 m o l / L氢氧化钠溶液或1 0 % 盐酸调节p H， 使其灭菌后 p H为6 . 5 士 。 . 1 ， 分装于锥形瓶和大试管内， 于1 2 1 0C 1 5 m i n 高压灭 菌。灭菌后将 试管制备成所需斜面 备

18、用。 S N 0 2 9 5 一 9 3 附录B 检 验 程 序 图 ( 补充件) 标准 贮 备液试 验 菌 培养 于均质杯内加入 1 7 m L 3 3 %毗 咤 移入离心管 离心2 0 m i n ( 3 O O O r /m i n )标 准工 作 液菌 液 制 备 取上清液( l O mL ) 加入 3 0 m L甲醉 振 摇 2 m i n 检 定 用平 板 制 备 离心2 0 mi n 制 备 标 准 曲线 取 上 清液 入 茄 形 瓶 蒸 干 加入 3 ml . 5 % 碑酸 盐 缓 冲液 样 液 ( P H 6 . 5 ) 检 测 结果计算和表述 附加说明: 本标准由中华人民共

19、和国国家进出口商品检验局提出。 本标准由中华人民共和国天津进出口商品检验局负责起草; 本标准主要起草人袁而森、 王素琴、 李剑影。 本 标准等同采用日 本厚生省检验 方法， 畜水产 食品中内 残留物质检查法( 1 9 9 0 ) , P r o f e s s i o n a l S t a n d a r d o f t h e P e o p l e s R e p u b l i c o f C h i n a f o r I mp o r t a n d E x p o r t C o mm o d i t y I n s p e c t i o n S N 0 295 一 9 3 M

20、 e t h o d f o r t h e d e t e r mi n a t i o n o f b a c i t r a c i n r e s i d u e s i n p o u l t r y me a t f o r e x p o r t -C y l i n d e r - p l a t e me t h o d 1 S c o p e a n d f i e l d o f a p p l i c a t io n T h i s s t a n d a r d s p e c i f i e s t h e m e t h o d o f s a mp l in

21、g , s a mp l e p r e p a r a t i o n a n d d e t e r mi n a t i o n b y c y l i n - d e r - p l a t e me t h o d o f b a c i t r a c in r e s i d u e s i n p o u l t r y me a t f o r e x p o r t . T h i s s t a n d a r d i s a p p l ic a b l e t o t h e d e t e r m i n a t i o n o f b a c i t r a c

22、i n r e s i d u e s i n c h ic k e n me a t f o r e x p o r t . 2 S t a n d a r d c i t e d S N 0 1 7 9 Me t h o d f o r d e t e r m i n a t io n o f t h e r e s id u e o f t e t r a c y c l i n e s e r i e s a n t i b io t i c s i n f o o d f o r e x p or t 3 S a m p l e a n d s a mp l e p r e p a

23、r a t i o n 3 . 1 I n s p e c t i o n l o t T h e q u a n t i t y o f a n in s p e c t i o n l o t s h o u l d n o t b e m o r e t h a n 2 5 0 0 p a c k a g e s . T h e c h a r a c t e r i s t i c s o f t h e c a r g o wit h i n t h e s a m e i n s p e c t i o n l o t , s u c h a s p a c k i n g , m

24、 a r k , o r i g i n , s p e c i f i c a t io n a n d g r a d e , s h o u l d b e t h e s a m e 3 . 2 Q u a n t i t y o f s a m p l e t a k e n N u mb e r o f p a c k a g e s Mi n i mu m n u m b e r o f in e a c h i n s p e c t io n l o t p a c k a g e s t o b e t a k e n 1 - 2 5 1 2 6 - 1 0 0 5 1 0

25、 1 - 2 5 0 1 0 2 5 1 - 5 0 0 1 5 5 0 1 - 1 0 0 0 1 7 1 0 0 1 - 2 5 0 0 2 0 3 . 3 S a m p l i n g p r o c e d u r e A n u m b e r o f p a c k a g e s s p e c if i e d i n 2 . 2 a r e t a k e n a t r a n d o m a n d o p e n e d o n e b y o n e . F r o m e a c h a t le a s t o n e b a g s h a l l b e t

26、 a k e n a s p r i m a r y s a mp l e . Th e t o t a l w e i g h t o f a l l p r ima r y s a mp l e s s h o u l d n o t b e le s s t h a n 2 k g , w h i c h s h a l l b e p l a c e d i n a c le a n c o n t a i n e r , s e a le d ， l a b e l e d a n d s e n t t o l a b o r a t o r y i n t ime A p p r

27、 o v e d b y t h e S t a t e A d m i n i s t r i t i o n o f I mp o r t I m p l e me n t e d f r o m Ma y . 1 , 1 9 9 4 a n d E x p o r t C o mm o d i t y I n s p e c t i o n o f t h e P e o p l e s R e p u b l i c o f C h i n a o n D e c . 2 8 , 1 9 9 3 7 S N 029 5一 93 3 . 4 P r e p a r a t io n o

28、f t e s t s a m p l e P a r t o f r e p r e s e n t a t iv e s a mp l e i s t a k e n f r o m e a c h b a g o f t h e p r i ma r y s a mp l e , t h e e d i b l e p o r t i o n s a r e h o m o g e n i z e d b y g r i n d i n g i n a m e a t g r i n d e r . T h e h o mo g e n iz e d s a mp l e i s t h

29、 o r o u g h t l y mix e d a n d r e d u c e d t o a t l e a s t 1 k g b y q u a r t e r i n g a s t e s t s a mp l e . T h e t e s t s a mp le is p l a c e d i n a c l e a n c o n t a i n e r w h i c h s h a l l b e s e a l e d a n d l a b e l e d 3 . 5 S t o r a g e o f t e s t s a m p l e Th e t

30、e s t s a mp le s h o u l d b e f r o z e n a n d s t o r e d a t 一1 8 0C . N o t e : I n t h e c o u r s e o f s a mp l i n g a n d s a mp l e p r e p a r a t io n , p r e c a u t io n mu s t b e t a k e n t o a v o i d c o n t a mi n a t io n o r a n y fa c t o r wh ic h ma y c a u s e t h e c h a

31、 n g e o f r e s id u e c o n t e n t . 4 Me t h o d o f d e t e r mi n a t i o n 4 . 1 P r i n c i p l e o f m e t h o d T h e b a c i t r a c i n i s e x t r a c t e d f r o m t h e me a t s a m p l e wit h 3 3 % p y r i d i n e s o l u t i o n , t h e n e x t r a c t e d i n t o m e t h a n o l .

32、 A f t e r e v a p o r a t io n t o d r y n e s s , t h e r e s i d u e s a r e d is s o l v e d i n p h o s p h a t e b u f f e r , w h ic h s h a l l b e d e t e r min e d b y c y l i n d e r - p l a t e m e t h o d a f t e r a d j u s t i n g p H 4 . 2 Ap p a r a t u s a n d e q u i p me n t 4 .

33、2 . 1 C u l t u r e d is h : 9 0 m m( i d ) g l a s s d i s h o r p l a s t ic d i s h w i t h s m o o t h b o t t o m, o r p l a s t i c d i s h a n d c l a y c o ve r . 4 . 2 . 2 O x f o r d c u p : 7 , 8 士0 . 1 m m ( o d ) , 6 . 0 士0 . 1 m m( i d ) ， h e ig h t 1 0 士0 . 1 mm, s t a i n l e s s s

34、t e e l . 4 . 2 . 3 V e r n i e r c a l i p e r : me a s u r in g r a n g e 0 -2 0 0 m m, p r e c i s i o n 0 . 2 mm o r u s e me a s u r e r 4 . 2 . 4 C e n t r i f u g e r : 3 0 0 0 r / m i n 4 . 2 . 5 R o t a r y e v a p o r a t o r . 4 . 2 . 6 I n c u b a t o r ; 3 6 士1 0C 4 . 2 . 7 Au t o c l a

35、 v e s t e r i l iz e r 4 . 2 . 8 O t h e r : g l a s s p l a t e , p i p e t s , d r o p p e r , Mo j o n n e r - t y p e f l a s k , e t c . 4 . 3 R e a g e n t s a n d me d i a 4 . 3 . 1 R e a g e n t s 4 . 11 . 1 P y r i d i n e : A n a l y t i c a l g r a d e . 4 . 3 . 1 . 2 P y r i d i n e s o

36、 l u t i o n ; 3 3 %. T a k e 3 3 m L p y r id i n e a n d d i l u t e w i t h d i s t i l l e d w a t e r t o 1 0 0 mL . 4 . 3 . 1 . 3 Me t h a n o l : A n a l y t i c a l g r a d e . 4 . 3 . 1 . 4 5 % P h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 5 ) : D i s s o l v e 2 2 . 1 5 g a n h y d r o u s K , H

37、P O , a n d 2 7 . 8 5 g a n h y - d r o u s KH, P O, i n wa t e r a n d d i l u t e t o 1 L. 4 . 3 . 1 . 5 S o d i u m h y d r o x i d e s o l u t i o n : l mo l / L . 4 . 3 . 1 . 6 1 % P h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 0 ) , D i s s o l v e 2 . 0 g a n h y d r o u s K 2 HP O , a n d 8 . 0 g a

38、 n h y d r o u s KH: P O, i n wa t e r a n d d i l u t e t o 1 L . 4 . 3 . 1 . 7 B a c i t r a c i n s t a n d a r d ; 5 8 I U / m g ( P r o v i d e d b y D r u g a n d B i o lo g i c a l P r o d u c t I n s p e c t i o n I n s t i t u t e o f t h e S t a t e Mi n is t r y o f P u b l ic He a l t h

39、) . 4 . 3 . 1 . 8 T e s t s t r a i n : Mi c r o c o c c u s l u t e u s N o . 2 8 0 0 8 ( P r o v i d e d b y t h e D r u g a n d B i o l o g i c a l P r o d u c t I n - s p e c t io n o f t h e S t a t e Mi n i s t r y o f P u b l i c He a l t h ) . 4 . 3 - 2 M e d i a 4 . 3 . 2 . 1 Gr o wt h me d

40、 i u m ( S e e Ap p e n d i x A1 ) . 4 . 3 . 2 . 2 Me d i u m f o r b a s e ( S e e A p p e n d ix A2 ) . 4 . 12 . 3 S t r a in me d i u m ( S e e A p p e n d i x A 3 ) . 8 S N 02 95 一 9 3 4 . 4 . 1 Pr o c e d u r e o f d e t e r mi n a t io n P r e p a r a t i o n o f w o r k i n g s o l u t i o n

41、4 . 4 . 1 . 1 B a c i t r a c i n s t a n d a r d s t o c k s o l u t i o n ; Ac c u r a t e l y we i g h a p r o p e r q u a n t i t y o f b a c i t r a c i n s t a n - d a r d a n d d is s o l v e i n 1 0 o p H 6 . 0 p h o s p h a t e b u f f e r t o m a k e 1 0 0 I U/ mL s t a n d a r d s t o c k

42、 s o l u t io n . S t o r e i n a r e f r ig e r a t o r , w h i c h c a n b e u s e d w i t h i n a w e e k . 4 . 4 . 1 . 2 B a c it r a c i n s t a n d a r d w o r k i n g s o l u t i o n P i p e t a c e r t a i n a m o u n t o f b a c i t r a c i n s t a n d a r d s t o c k s o l u t i o n , a n

43、d d i lu t e wi t h 1 % p H 6 . 0 p h o s - p h a t e b u f f e r t o ma k e 0 . 1 5 I U/ m L a n d 0 . 6 I U/ mL s t a n d a r d w o r k in g s o l u t io n a n d 0 . 0 2 5 , 0 . 0 5 0 , 0 . 1 0 0 , 0 . 2 0 0 , 0 . 4 0 0 , 0 . 8 0 0 I U/ m L d i l u t i o n a s s o l u t i o n f o r p r e p a r i n

44、 g s t a n d a r d c u r v e , 0 . 1 0 0 I U/ mL s o - l u t i o n a c t s a s r e f e r e n c e , a l l o f a b o v e s o l u t i o n s h o u l d b e p r e p a r e d a t t h e s a me d a y . 4 . 4 . 1 . 3 C u l t u r e a n d p r e p a r a t io n o f s t r a in A f t e r s t e r i l i z a t io n o f

45、 t h e a mp o u l e o f t h e s t r a in , c u t o f f t h e t o p a n d a d d a s m a l l a mo u n t o f g r o w t h me d i u m ( 4 . 3 . 2 . 1 ) i n i t t o d i s s o l v e t h e c o n t e n t . Tr a n s f e r i n t o t h e a b o v e me n t i o n e d me d i u m, mix we l l a n d i n c u b a t e a

46、t 3 6 士1 0C f o r 2 4 h . Tr a n s f e r t h e i n c u b a t e d c u l t u r e t o s l a n t s ( 4 . 3 . 2 . 3 ) a n d i n c u b a t e i t f o r U s e - 4 . 4 . 2 P r e p a r a t i o n o f s a mp l e s o l u t io n We i g h 1 0 . 0 g o f t h e c h o p p e d a n d m i x e d s a m p l e i n h o m o g

47、e n i z e r , a d d 1 7 mL p y r i d i n e s o l u t i o n ( 3 3 o o ) , h o m o g e n i z e f o r 3 mi n t h e n t r a n s f e r i n t o a c e n t r i f u g a l t u b e a n d c e n t r if u g e a t 3 0 0 0 r / m i n f o r 2 0 m i n . P i p e t 1 0 m L o f t h e s u p e r n a t e i n t o a n o t h e

48、 r c e n t r if u g a l t u b e , a d d 3 0 m L me t h a n o l a n d s h a k e t h o r o u g h l y f o r 2 mi n , c e n t r if u g e a g a i n a t 3 0 0 0 r / mi n f o r 2 0 mi n . P i p e t s u p e r n a t e i n t o a Mo j o n n i e r - t y p e f l a s k , e v a p o r a t e t o d r y n e s s a t r

49、e d u c e d p r e s s u r e a n d a d d 3 mL p h o s p h a t e b u f f e r ( 5 %) t o d i s s o v e t h e r e s i d u e s . I n t h i s s o l u t i o n , t h e c o n c e n t r a t i o n o f p o u l t r y me a t s a mp l e i s e q u iv a l e n t t o 1 . 9 6 g / mL . 4 . 4 . 3 D e t e r m in a t i o n