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1、第十章 微生物的进化、系统发育和分类鉴定,进化(evolution)：生物与其生存环境相互作用过程中， 其遗传系统随时间发生一系列不可逆的改变，在大多 数情况下，导致生物表型改变和对生存环境的相对适应。,今天仍生存在地球上的生物种类， 彼此之间都有或远或近的历史渊源。,最原始的生命,漫长的进化历程,千姿百态的生物种类,系统发育(phylogeny)：各类生物进化的历史。,分类(classification)：根据生物特性的相似程度 将其分群归类。,地球上的物种估计大约有150万，其中微生物超过10万种， 而且其数目还在不断增加。,生物分类的二种基本原则：,a）根据表型(phenetic)特征的
2、相似程度分群归类，这种 表型分类重在应用，不涉及生物进化或不以反映生 物亲缘关系为目标；,b）按照生物系统发育相关性水平来分群归类，其目标 是探寻各种生物之间的进化关系，建立反映生物系 统发育的分类系统。,从进化论诞生以来，已经成生物学家普遍接受的分类原则,生物系统学(systematics),第一节 进化的测量指征,70年代以前，生物类群间的亲缘关系判断的主要根据：,形态结构、,生理生化、,行为习性，等等,少量的化石资料,表型特征：,一、进化指征的选择,原核生物的特点：,形体微小、,结构简单、,缺少有性繁殖过程，,化石资料凤毛麟角,b）形态特征在不同类群中进化速度差异很大，仅 根据形态推断进
3、化关系往往不准确；,根据形态学特征推断微生物之间的亲缘关系的缺点：,a）由于微生物可利用的形态特征少，很难把所有 生物放在同一水平上进行比较；,虽然根据少量表型特征来推测各类微生物的亲缘 关系而提出的许多分类系统，都随着时间的推移 而不断地被否定了。,六、七十年代：,分析和比较生物大分子的结构特征，特别是 蛋白质、RNA和DNA这些反映生物基因组特征 的分子序列，作为判断各类微生物乃至所有 生物进化关系的主要指征。,分子计时器(molecular chronometers),进化钟(evolutionary clock),蛋白质、RNA和DNA序列进化变化的显著特点是进化 速率相对恒定，也就是
4、说，分子序列进化的改变量 (氨基酸或核苷酸替换数或替换百分率)与 分子进化的时间成正比。,1. 生物大分子作为进化标尺依据,a）在两群生物中，如果同一种分子的序列差异很大时，,-进化距离远，进化过程中很早就分支了。,b）如果两群生物同一来源的大分子的序列基本相同，,-处在同一进化水平上。,2. 作为进化标尺的生物大分子的选择原则,1）在所需研究的种群范围内，它必须是普遍存在的。,2）在所有物种中该分子的功能是相同的。,3）为了鉴定大分子序列的同源位置或同源区，要求所 选择的分子序列必须能严格线性排列，以便进行进 一步的分析比较。,4）分子上序列的改变（突变）频率应与进化的测量尺 度相适应。,大
5、量的资料表明：功能重要的大分子、或者大分子中功能重要 的区域，比功能不重要的分子或分子区域进化变化速度低。,二、RNA作为进化的指征,16S rRNA被普遍公认为是一把好的谱系分析的“分子尺”：,1）rRNA具有重要且恒定的生理功能；,2）在16SrRNA分子中，既含有高度保守的序列区域，又有中度 保守和高度变化的序列区域，因而它适用于进化距离不同的 各类生物亲缘关系的研究；,3）16SrRNA分子量大小适中，便于序列分析；,4）rRNA在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%)，也易于提取；,5）16SrRNA普遍存在于真核生物和原核生物中(真核生物中其同 源分子是18SrRNA)。因此它可
6、以作为测量各类生物进化的工具。,利用16SrRNA建立分子进化树的美国科学家 Carl Woese,三、rRNA和系统发育树,1. rRNA的顺序和进化,培养微生物,提取并纯化rRNA,rRNA序列测定,分析比较,微生物之间的系统发育关系,2. 特征序列或序列印记（signature sequence）,通过对r RNA全序列资料的分析比较（特别是采用 计算机）发现的在不同种群水平上的特异特征性寡 核苷酸序列，或在某些特定的序列位点上出现的单 碱基印记。,特征序列有助于迅速确定某种微生物的 分类归属，或建立新的分类单位。,3. 系统发育树(phylogenetic tree),通过比较生物大分
7、子序列差异的数值构建的系统树称为 分子系统树，其特点是用一种树状分枝的图型来概括各 种(类)生物之间的亲缘关系。,分枝的末端和分枝的连结点称为结(node)， 代表生物类群，分枝末端的结代表仍生存的种类。系 统树可能有时间比例，或者用两个结之间的分枝长度 变化来表示分子序列的差异数值。,16 S r RNA系统发育树,1）生命的第三种形式古生菌,动物界和植物界,原核生物和真核生物（20世纪60年代）,古细菌(archaebacteria) 真细菌(Eubacteria) 真核生物(Eukaryotes),（1977，Carl Woese）,Bacteria(细菌) Archaea(古生菌) E
8、ukarya(真核生物),（1990，Carl Woese）,原核生物,界（Kingdom）,域（domain）,3）三（界)域生物的主要特征,三界理论虽然是根据16SrRNA序列的比较提出的，但其他特征的比较研究结果也在一定程度上支持了三界生物的划分。,第二节 细菌分类,分类是认识客观事物的一种基本方法。我们要认识、 研究和利用各种微生物资源也必须对它们进行分类。,分类(classification)：根据一定的原则(表型特征相似性或系统发育 相关性)对微生物进行分群归类，根据相似性或相关性水平排列成 系统，并对各个分类群的特征进行描述，以便查考和对未被分类的 微生物进行鉴定；,(根据现有数
9、据建立系统的过程),分类学涉及三个相互依存又有区别的组成部分：,鉴定,分类、,命名、,命名(nomenclature)：是根据命名法规，给每一个分类群一个专有 的名称；,(分类系统建立过程中的步骤之一),鉴定(identification或determination)：借助于现有的微生物分类 系统，通过特征测定，确定未知的、或新发现的、或未明确分类 地位的微生物所应归属分类群的过程。,(根据现有系统确定未知微生物分类归属的过程),主要以细菌为例介绍微生物分类、命名和鉴定的有关知识,一、分类单元及其等级,界,门,纲,目,科,属,种,常用的细菌分类学术语：,1）培养物(culture)：一定时间一
10、定空间内微生物的细胞群或生长 物。如微生物的斜面培养物、摇瓶培养物等。,2）菌株(strain)：从自然界中分离得到的任何一种微生物的纯培养 物都可以称为微生物的一个菌株；用实验方法(如通过诱变) 所获得的某一菌株的变异型，也可以称为一个新的菌株， 以便与原来的菌株相区别。,菌株是微生物分类和研究工作中最基础的操作实体,（参见P321）,3）型(form或type)：常指亚种以下的细分。当同种或同亚种不同菌 株之间的性状差异，不足以分为新的亚种时，可以细分为不同的型。,例如抗原特征的差异分为不同的血清型；对噬菌体裂解反应的 不同分为不同的噬菌型等,4）种（species）： 物种，生物分类中基
11、本的分类单元和分类等级。,高等生物中，“生殖隔离”被看作是区分物种的标准,微生物的种：具有高度特征相似性的菌株群，这个菌株群与其 他类群的菌株有很明显的区别。,（参见P321）,二、微生物的命名,双名法，由二个拉丁字或希腊字或拉丁化了的其它文字组成， 一般用斜体表示,（参见 P 323）,属名在前，一般用拉丁字名词表示，字首字母大写,种名在后，常用拉丁文形容词表示，全部小写,若所分离的菌株只鉴定到属，而未鉴定到种，可用sp来表示，,例如 Bacillus sp,伯杰氏手册,伯杰氏鉴定细菌学手册 (Bergeys Manual of Determinative Bacteriology),美国宾
12、夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(1860-1937),1957年第七版后，由于越来越广泛地吸收了国际上细菌 分类学家参加编写(如1974年第八版，撰稿人多达130多位 ，涉及15个国家；现行版本撰稿人多达300多人，涉及近 20个国家)，所以它的近代版本反映了出版年代细菌分类学 的最新成果，因而逐渐确立了在国际上对细菌进行全面分 类的权威地位。,伯杰氏系统细菌学手册 (Bergeys Manual of Systematic Bacteriology),伯杰氏手册是目前进行细菌分类、鉴定的最重要 依据，其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属 种的特征及进行鉴定所需做的实验的具
13、体方法。,（20世纪80年代末期）,第三节 微生物分类鉴定的特征和技术,血清学试验、噬菌体分型、生态特性、氨基 酸顺序和蛋白质分析、对细胞壁等细胞成分 的分析比较、通过原核生物的转化、转导、接合来判断原核生物的亲缘关系等等。,参见 P 330-334,核酸的碱基组成和分子杂交,特点：,与形态及生理生化特性的比较不同，对DNA的碱基 组成的比较和进行核酸分子杂交是直接比较不同微 生物之间基因组的差异，因此结果更加可信。,（参见P 332）,1. DNA的碱基组成(G+Cmol%),DNA碱基因组成是各种生物一个稳定的特征，即使个别 基因突变，碱基组成也不会发生明显变化。,分类学上，用G+C占全部
14、碱基的分子百分数(G+Cmol%) 来表示各类生物的DNA碱基因组成特征。,（参见P 332）,1）每个生物种都有特定的GC%范围，因此后者 可以作为分类鉴定的指标。细菌的GC%范围 为25-75%，变化范围最大，因此更适合于细 菌的分类鉴定。,2）GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌 作出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性， 从分子水平上判断物种的亲缘关系。,3）使用原则：,G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定,每一种生物都有一定的碱基组成，亲缘关系近的生物， 它们应该具有相似的G+C含量，若不同生物之间G+C含 量差别大表明它们关系远。,但具有相似G+C含量的生物并不一定表明它们
15、之间具有近的亲缘关系。,同一个种内的不同菌株G+C含量差别应在45%以下； 同属不同种的差别应低于1015%； G+C含量已经作为建立新的微生物分类单元的一项 基本特征，它对于种、属甚至科的分类鉴定有重要意义。,若二个在形态及生理生化特性方面及其相似的 菌株，如果其G+C含量的差别大于5%，则肯定 不是同一个种，大于15%则肯定不是同一个属。,在疑难菌株鉴定、新种命名、建立一个新的 分类单位时，G+C含量是一项重要的，必不 可少的鉴定指标。,其分类学意义主要是作为建立新分类 单元的一项基本特征和把那些G+C含 量差别大的种类排除出某一分类单元。,G+C含量的比较主要用于分类鉴定中的否定,2.
16、核酸的分子杂交,不同生物DNA碱基排列顺序的异同直接反映生物之间 亲缘关系的远近，碱基排列顺序差异越小，它们之间 的亲缘关系就越近，反之亦然。,直接分析比较DNA的碱基排列顺序,核酸分子杂交(hybridization)间接比较不同微生物DNA,碱基排列顺序的相似性,（参见P 333）,核酸分子杂交：,a）DNA-DNA杂交；,（亲缘关系相对近的微生物之间的亲缘关系比较）,b）DNA-rRNA杂交；,（亲缘关系相对远的微生物之间的亲缘关系比较）,c）核酸探针；,（利用特异性的探针，用于细菌等的快速鉴定）,（参见P 333-334）,第四节 微生物的快速鉴定和自动化分析,1. 微量多项试验鉴定系统 （1）API 20 系统：法国 Bio-梅里埃公司生产，有 20 种不同的生化反应，可鉴定 700 多种细菌，分不同系列，如 20A厌氧菌，20E肠道菌 （2）Enterotube 系统：罗氏公司生产，有 15 种生化反应，专门鉴定肠道菌 （3）Biolog 系统：美国安普公司生产，可自动化鉴定，可鉴定 1140 种细菌,本章小结,进化、菌株、模式菌株、培养物、 种（微生物）、 蛋白质和核酸被用作微生物进化谱系分析的原因； 16S rRNA被认为是谱系分析的“分子尺”的原因；,