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1、 毕业论文HPLC法测定龙芪柔肝胶囊中丹参酮A的含量 系 别：生物技术系 班 级：中药制药2班 姓 名： 学 号： 指导老师： 目录 摘要1. 前言 1.1龙芪柔肝胶囊简介（3） 1.2处方分析（3） 1.3中药药理学分析（3） 1.4 小结（3）2.正 文 2.1.仪器与试药（3） 2.1.1仪器(3) 2.1.2试药(3) 2.2.方法与结果 (3) 2.2.1 对照品溶液的制备 (3) 2.2.2供试品溶液的制备 (4) 2.2.3色谱条件(4) 2.2.4线性关系的考察(4) 2.2.5精密度试验 (4) 2.2.6重复性试验 (4) 2.2.7稳定性试验 (4) 2.2.8加样回收率
2、试验(4) 2.2.9样品的含量测定（4）3.讨 论3.1 检测波长的选择（4） 3.2 色谱条件的选择（4） 3.3 提取方法的选择（4） 3.3.1 药品预处理（5） 3.3.2 供试品溶液的提取（5） 3.3.3 供试品的筛选（5）4.参考文献（5）5.致谢（5） HPLC法测定龙芪柔肝胶囊中丹参酮A的含量摘 要 目的：建立HPLC法测定龙芪柔肝胶囊中丹参酮A含量的方法。方法：选用Anjilent C18柱（250mm4.6mm,5um）,以甲醇：水（20:80）为流动相，流速1.0mlmin-1,检测波长270nm,柱温25。结果：丹参酮IIA 在16.96152.64ugml间呈良好
3、的线性关系(R2=0.99969),平均加样回收率为101.32%（RSD=2.8n=5）；结论：该方法快速、准确、精密，可用于龙芪柔肝胶囊的质量控制。关键字：HPLC法；龙芪柔肝胶囊；丹参酮IIADetermination of TanShinone Tong A in the LongQi Capsules by HPLCABSTRACT Objective: To establish an HPLC method for the TanShinone Tong A in the LongQi Capsules. Method :The analysis was performed on
4、a column of Anjilent C18 （250mm4.6mm,5um）.The mobile phase consisted of methanol and water （20:80）with the flow rate of 1.0mlmin-1.The detection wavelength was 270nm and the column temperature was 25 . Result: Promising linearity was obtained within the range of 16.96152.64ugml for TanShinone Tong A
5、 . The average recovery of TanShinone Tong A was R2=0.99969. Conclusion :This method is rapid and accurate and can be used to control the quality of TanShinone Tong A.KEY WORDS : HPLC ; TanShinone Tong A ; LongQi Capsules1. 前 言1.1龙芪柔肝胶囊简介 龙芪柔肝胶囊为信阳市中医院院内制剂，由黄芪、丹参、党参、 生地黄、北沙参、当归、地龙、醋白芍、鳖甲、黄精、五味子、灵芝、桃
6、仁、红花、炒穿山甲共15位中药制备而成。主治慢性病毒性肝炎，肝纤维化、肝硬化等症。具有益气养阴，活血柔肝的功效。方中地龙有较强的异味，穿山甲属名贵药材以打粉入药。因胶囊剂具有能够掩盖药物不良臭味，载药量大的特点，故选用胶囊剂4。1.2处方分析方中以黄芪、地龙为君药，以丹参、当归、生地黄、北沙参、党参为臣药。方中黄芪甘温入脾肺经，补中气、升清阳，益肺气、实皮毛，以扶正；地龙同入肝脾经，息风止痉，通络，以开血脉阻滞，二者共为君药。丹参、当归并用，生血、活血且化瘀、通络而不伤血；生地、北沙参并用，滋阴而又养阴；党参补气以行血；五者共为臣药。取君二臣五，奇之制之意。五味子、醋白芍共同辅助君药抑阳敛阴，
7、以柔肝；鳖甲、黄精、灵芝共用助君药滋补肝阴。五者共为佐药。桃仁、红花活血祛瘀，穿山甲消肿排脓，三者共同引药归经，均为使药。本方为补中益气汤（脾胃论）和补阳还五汤（医林改错）的复合方。一为补气，一为活血祛瘀，二者并用以达到益气养阴、活血柔肝的功效5。1.3 中药药理学分析 黄芪主含多糖类和皂苷类成分，能增强非特异性免疫功能，包括增加WBC和中性粒细胞、M吞噬功能。地龙提取物口服，对小鼠S180和H22均有抑瘤作用，并可增强5-Fu受体活化，从而增强免疫细胞的活性。丹参中主含丹参酮A ，丹参酮A 磺酸钠可抑制心肌收缩力，降低窦房结自律性，能促进肝、骨、皮肤等多种组织的修复与再生，其中促进肝组织的修
8、复与再生尤为显著3。因此丹参酮A 也是本药的重要和关键性成份。1.4 小结本文重点探索了HPLC法测定龙芪柔肝胶囊中丹参酮A含量时方法的建立及优化，为全面评价该制剂质量和完善本复方制剂的质量提供实验依据。2.正 文2.1.仪器与试药2.1.1仪器Agilent-1200液相色谱仪(美国Agilent公司，Agilent-1200检测器，Agilent工作站)；Waters-1525液相色谱仪（Waters公司， Waters2489柱温箱 Breeze工作站）；普利赛斯双量程电子天平(美国塞利普斯公司)；超纯水机（基因型185OD重庆摩尔制水设备有限公司）；超声仪（宁波新芝生物科技有限公司）。
9、2.1.2试药丹参酮A对照品（规格：20mg支，110766-200518，中国药品生物制品检定所）；甲醇（色谱纯，美国Agilent公司）；龙芪柔肝胶囊（信阳市中医院制剂室，规格：60粒瓶，批号：20110410 、20110512 、20110823）；水（信阳市药检所中药实验室制水机，一级水）；其他试剂均为分析纯。2.2.方法与结果2.2.1 对照品溶液的制备 取丹参酮A对照品10.6mg置25ml容量瓶中，精密称定，加甲醇定容。用1ml移液管移取配置好的对照品溶液，另置25ml容量瓶中，加甲醇定容，即得。配得的对照品溶液浓度为16.96ugml.2.2.2供试品溶液及阴性样品的制备 取
10、本药品5份，每份3.2g，精密称定。分别置同型号250ml具塞锥形瓶中，各加入25ml甲醇。精密称定。超声提取30min。放至室温，精密称定，用甲醇补足损失的量。过滤，取续滤液，即得。模拟处方的制备方法，制备不含丹参的阴性样品，按供试品制备方法制备成阴性样品溶液。表1 取样量 超声前 超声后 补足后1号实验 3.1873 116.3690 116.3269 116.36422号实验 3.1770 112.2992 1123.2871 112.29313号实验 3.1933 94.3075 94.2945 94.30214号实验 3.2188 104.3507 104.3348 104.3520
11、5号实验 3.1842 88.1713 88.1548 88.17482.2 .3色谱条件 色谱柱：Agilent C18柱（250mm4.6mm,5um）；流动相：以甲醇：水（20:80）为流动相；流速：1.0mlmin-1；检测波长：270nm；柱温：25。理论板数按丹参酮A峰计算应不低于2000。分离度1.5；龙芪柔肝胶囊中其他成分对丹参酮A含量的测定无影响。 1.对照品 2.供试品 3.缺丹参对照品2.2.4线性关系的考察精密吸取配置好的丹参酮A对照品溶液1ul、3ul、5ul、7ul、9ul注入高效液相色谱仪，依法测定，以峰面积积分值为纵坐标（Y），以进样量（ug）为横坐标（X）,绘
12、制标准曲线。结果表明丹参酮A在16.96152.64ugml范围内呈良好的线性关系。回归方程为：Y=5759589X-101938;R2=0.99969.进样量 进样量（g） 保留时间 峰面积 %面积 1微升 15.511 2573.0000 75.463微升 15.537 183679.0000 82.315微升 15.511 383743.0000 91.797微升 15.504 580916.0000 97.889微升 15.496 781003.0000 91.912.2.5精密度试验取中间上述2.5对照品注入高效液相，重复进样6次，每次进样5ul。记录丹参酮A峰面积，结果丹参酮ARS
13、D=1.69(n=5)2.2.6重复性试验 取同一批号供试品，按2.3项下方法制备5份供试液，分别进样，测定峰面积，计算丹参酮A的平均含量为0.081g-1，其RSD=2.67 （n=5）。2.2.7稳定性试验取同一供试品溶液，分别在0、3、6、9h按上述色谱条件试验，记录丹参酮A峰面积积分值，结RSD=3；表明供试品溶液在9h内基本稳定。2.2.8加样回收率试验精密称定已测定含量的样品（16.96 ugml），共取5份，每份3.2g，按2.2项下方法制备供试品溶液。分别精密加入丹参酮A对照品储备液1ml，进样。计算丹参酮A含量并计算回收率为101.32%RSD=2.8(n=5)。2.2.9样
14、品的含量测定取3批龙芪柔肝胶囊样品，按上述供试品溶液的制备方法制备，并按上述色谱条件测定丹参酮A含量。结果=0.081g-13.讨 论3.1 检测波长的选择经过Agilent-1200 三维图谱分析，发现在270nm,275nm处均有吸收峰，且吸收系数均较大，考虑到龙芪柔肝胶囊药味比较复杂，对丹参酮A的检测容易产生干扰，因此选择检测波长为270nm。3.2 色谱条件的选择曾用甲醇：水（25:75）作为流动相1，但丹参酮A峰形有拖尾，用于定量分析不准确。经过试验，调整流动相为甲醇：水（20:80）。峰形明显改善。影响峰形的因素是否还与其他因素（如pH）有关，尚需进一步研究。3.3 提取方法的选择
15、3.3.1 药品预处理取龙芪柔肝胶囊4份，每份3.2g，精密称定。分别置250ml具塞锥形瓶中。编号为回1、回2、超1、超2。各瓶精密加入甲醇50ml,称定重量。 3.3.2 供试品溶液的提取 对回1进行30min回流提取，对回2进行45min回流提取。对超1进行超声30min超声提取，对超2进行45min超声提取1。3.3.3 供试品的筛选将上述四瓶供试品放至室温，精密称定，补足损失的量，过滤。取续虑液，用HPLC进行检定。发现30min时即提取完全。且超声提取优于回流提取。4.参考文献1国家药典委员会.中华人民共和国药典.一部s.北京;中国医药科技出版社,2010：2张德钦.中药分析制剂技术.北京.中国中医药出版社3方泰惠.吴清和.中药药理学.北京.科学出版社4陈琼.中药制剂技术.北京.中国农业大学出版社5王均宁.薛建国.方剂学.北京.科学出版社6凌一揆.中药学.上海.上海科学技术出版社7唐丽琴，张善堂，陈象青，等.HPLC法测定不同来源补骨脂中补骨脂素和异补骨脂素的含量m.中国药师，2011，(3):377378