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1、甘肃省部分地区马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗药性的测定 李俊杰本科毕业论文论文题目 甘肃省部分地区马铃薯晚疫病 菌对甲霜灵抗药性的测定 学 院 草 业 学 院 专 业 植 物 保 护 毕业届别 2010 届 姓 名 李俊杰 指导教师 李惠霞 职 称 副教授 甘肃农业大学教务处制二一年六月甘肃省部分地区马铃薯晚疫病菌对甲霜灵抗药性的测定李俊杰（甘肃农业大学草业学院植物保护专业，兰州 730070）摘要:马铃薯晚疫病是世界马铃薯生产上一种毁灭性病害。甲霜灵属苯基酰胺类杀菌剂, 是防治卵菌类病害的特效药。本试验在2008-2009年采集定西、通渭、临洮、天水、陇东、陇西等地的马铃薯晚疫病病叶,共分离得80
2、 株致病疫霉。用生长速率法测定其对甲霜灵的抗药性,结果表明:63.75 %的菌株表现为抗性,21.25 %的菌株表现为中抗,15%的菌株表现为敏感；各地菌株抗性表现与菌株来源地的施药水平有密切关系,并对抗药性不同的地区提出了用药建议。关键词:致病疫霉,甲霜灵,抗药性马铃薯是粮菜兼用的作物，是世界第四大粮食作物。甘肃省马铃薯栽培面积居全国第二，产量居全国第一，是区域优势产业。马铃薯晚疫病是由致病疫霉(Phytophthora infestans)引起的病害，是马铃薯生产上的一种毁灭性病害。该病害在我国的马铃薯产地均有发生, 一般年份使马铃薯减产20%-30%, 发病较重的年份达50%以上,严重威
3、胁着我国马铃薯的生产1。近年来, 由于晚疫病菌生理小种的变化, 60年代培育的抗晚疫病品种的抗性在各薯区相继衰退或丧失, 使马铃薯晚疫病的危害变得越来越重。1956年 Niederhauser首次证实了在墨西哥存在A2交配型2,1984年又报道了在瑞士发现A2交配型之后, 引起各国植物病理学家的重视3。因此, 很多国家的植病学者纷纷在本国展开调查研究。目前, 世界上许多国家都已发现了A2交配型菌株,1996 年我国张志铭等首次报道了内蒙、山西存在A2交配型, 河北、云南、四川等省份也相继发现A2交配型,但尚未见报道福建省是否存在致病疫霉A2交配型4。该病原菌主要是以无性繁殖为主，近年来各地区相
4、继报道发现致病疫霉A2交配型，这预示着该病菌可能出现有性繁殖，其侵染能力和存活能力都将增强。生产上，马铃薯晚疫病的防治主要是以化学防治为主，甲霜灵(Metalaxyl) 是苯基酰胺类杀菌剂,是防治该病的特效药剂， 对卵菌纲真菌有很高的活性, 可有效预防并控制晚疫病的流行, 并可提高薯块的产量和品质5。随着A2交配型在世界各地传播，对甲霜灵具有抗性的小种也在晚疫病病原群体中不断出现6、7。1980年夏，首先在荷兰、爱尔兰发现抗甲霜灵的晚疫病菌株，随后在欧洲其它国家、美洲及中东等地区也相继发现了抗性菌株。随着甲霜灵大面积及长时期使用，抗甲霜灵群体不断扩大。据统计8，1986-1988年间，英国抗甲
5、霜灵群体由41%上升到60%，1987-1989年间，波兰抗甲霜灵群体由0上升到58.5%。张志铭等9（1999）对我国马铃薯主产区晚疫病菌株抗药性试验表明，90年代后期使用过甲霜灵的地区普遍存在抗药性菌株，此后我国河北、内蒙、云南和黑龙江等地陆续报道发现甲霜灵抗药性菌株10。甘肃省作为马铃薯的主要生产地区，致病疫霉是否存在甲霜灵抗药性菌株，抗性程度有多高尚未见报道。本试验拟采集和分离甘肃省马铃薯主产区的致病疫霉菌株，测定其对甲霜灵的抗药性，了解抗性水平，为甘肃省马铃薯晚疫病的有效防治提供理论依据。1 材料与方法1.1材料1.1.1 病样的采集在马铃薯生长期，采集晚疫病时选取新鲜发病的叶片。采
6、集后，装入自封袋中，分别编号，并在自封袋上标上采集地点和日期。田间每丛采集的病叶作为一个病样。1.1.2 供试菌株2008-2009年先后从甘肃省的定西、通渭、临洮、榆中、红古、天水、陇东、陇西等马铃薯产区的大田或试验田中采集具有典型症状的前期病叶。共分离出80个菌株用于甲霜灵抗性测定。1.1.3 培养基在此实验过程中用两种方法制的黑麦培养基5 (RSA) ：（1）黑麦60 g、蔗糖20 g、琼脂13 g、蒸馏水1 000 ml 。（2）50-60 g黑麦、新鲜西红柿汁100ml、琼脂15-16g、碳酸钙0.4 g、蒸馏水1000 ml。1.1.4 供试药剂 97.3%甲霜灵(Metalaxy
7、l ,Ridomil又名瑞毒霉)原药，先用少量的灭菌二甲基亚砜溶解，待甲霜完全溶解之后，再用灭菌水稀释成5g/ ml 和100g/ ml的两个浓度作为母液备用。1.2 方法 1.2.1 病叶的采集采集新鲜的、刚发病或发病时间不长的叶片，病健交接处有明显的白色霉层，并且较纯净的病叶用于分离。1.2.2 病菌的分离纯化病菌的分离纯化方法参照朱杰华11、12和国立耘13等，将具有典型症状的病叶经自来水冲洗，洗去病叶表面的污物，孢子囊，菌丝等，再用灭菌水冲洗两遍，放在干净的滤纸吸去水。用灭过菌的解剖剪剪去受害严重的部分，取病健交界的叶片5cm 5cm左右，背面朝上置于经高压灭菌的1.6%2.0%琼脂培
8、养基上保湿培养， 24小时后，叶片背面长出孢囊梗，在无菌条件的解剖镜下，用灭菌牙签灭或灭过菌的挑针挑小块黑麦培养基，在成层的孢囊梗上刮取孢子囊。接种在黑麦培养基上。18黑暗的生化培养箱中3-4天后，重新挑取菌丝接种于新鲜培养基中，并放在16-18黑暗的生化培养箱中培养备用。1.2.3 对甲霜灵抗性测定致病疫霉对甲霜灵的抗药性：采用菌落生长速率法，在黑麦培养基上培养10 d 的菌落沿边缘取直径6mm的菌块,分别移到含甲霜灵0g/ ml , 5g/ ml和100g/ ml 的黑麦培养基平板中央,（其中浓度为 0g/ ml的作为对照）置于18 培养,10d 后采用垂直十字交叉法测定菌落直径，每浓度处
9、理3皿。根据抗性测定标准2。在含药5g/ ml， 和100g/ ml 平板上菌落生长量均40 % 对照生长量为高抗；含药5g/ ml， 和100g/ ml 平板上菌落生长量均40 % ,为敏感； 而在含药 5g/ ml 平板上菌落生长量40 %对照生长量含药100g/ ml 的菌落生长量,为中度抗性。2.结果与分析 2.1致病疫霉的分离培养采集的病叶和分离到的致病疫霉孢子囊和孢囊梗见图1。分离到的菌株参照中国真菌志（第六卷）14进行鉴定。致病疫霉经2008-2009年2个马铃薯生育期的采集和分离培养，从定西分离到17个菌株、天水11个菌株、临洮20个菌株、陇西6个菌株、陇东8个菌株、榆中6个菌
10、株、临夏4个菌株及中川8个菌株，共收集到80个菌株。CADB图1 晚疫病菌侵染的病叶及致病疫霉孢子囊和孢囊梗注：A. 晚疫病菌侵染马铃薯叶片的症状B.在叶片上生长的晚疫病菌的白色霉层 C.晚疫病菌的孢子囊D.晚疫病菌的孢子囊和孢囊梗2.2致病疫霉对甲霜灵抗药性测定了80个菌株对甲霜灵的抗性,测定的结果如表1所示。在待测菌株中,敏感菌株为12株,占总数的15% ,中抗性菌株为17 株,占21.25 % ,抗性菌株为51 株,占63.75 %。通过对各地菌株的测定，各地致病疫霉对甲霜灵敏感性、抗性分布并不一致，在所有采集的地区都存在甲霜灵抗药性菌株。其中以天水、临洮和定西等3个市县致病疫霉抗药性菌
11、株比例最高，分别占当地菌株的90.9%、80%和58.5%。而其它地区致病疫霉对甲霜灵抗性菌株的比例均在所收集菌株的1/3以上。由此可见，不同的生态环境和用药水平下致病疫霉对甲霜灵抗性发展的速度不同，但对甲霜灵抗药性的问题在甘肃省马铃薯主栽区已经非常普遍。表1 致病疫霉对甲霜灵抗药性测定结果采集地菌株数敏感菌株中抗菌株抗性菌株菌株数百分比（%）菌株数百分比（%）菌株数百分比（%）定西1700741.21058.8天水1119.1001090.9临洮20420.0001680陇西6116.6233.3350陇东8225225450榆中6233.3233.3233.3临夏400250250中川82
12、25225450总计8012151721.255163.753 讨论不同来源的菌株对甲霜灵抗药性差异表现的非常明显,分离各地的病叶所得的菌株表明：抗性菌株占绝对优势,并且抗性水平达到相当高的程度,临洮地区抗性菌株最高,这一结果与分离地的施药水平完全一致,这也说明抗药性菌株的产生是由于长期多次施用甲霜灵类杀菌剂而形成选择压力的结果。在榆中、陇东、定西等地相继表现中度抗性。其中,各地菌株的甲霜灵抗性测定结果与菌株来源地的用药水平密切相关。例如，临洮县峡口乡马家村，由于晚疫病等病害发生严重,每季的施药水平均很高(一般57 d 施1 次药,每季施58 次,所用药剂为杀毒矾、雷多米尔、甲霜灵锰锌等) ,
13、形成对病菌的高选择压力,因此抗性菌株占绝对优势。同样, 红古病样的采集地为马铃薯晚疫病常发区,每年施药23次(常施用药剂为甲霜灵、甲霜灵锰锌等) ,并且采集时已是当地晚疫病发生后期,因此抗性菌株比例高达63.75 %。其余几个采集地当年未施药或施药量较少,采集时为当地晚疫病的零星发病期,因而敏感菌株占优势。因此可见抗性的发生是伴随着甲霜灵等苯基酰胺类杀菌剂的施用而产生的8。总之,为科学有效地防治晚疫病,应在各地区加强田间抗药性监测及药剂之间的交抗关系研究,根据监测和研究结果合理进行杀菌剂的轮换和使用,加强病害短期预测预报,减少用药次数,指导农民科学用药,降低抗药性产生风险,延长药剂使用寿命,同
14、时也减少了环境污染,降低生产成本,增加农民收入12。因此推测抗性的发生, 有3种可能：杀菌剂选择压力的结果，从邻近发病的田间风传所致和引进用药地区带菌的种薯。因此在不施甲霜灵的田间, 也有可能发现抗性菌株。从总的情况来看,采集的菌株有较高频率的抗性发生, 与集中在用药地区及用药地区多次用药的田间采集有关10。但是, 甲霜灵虽然是一个防治晚疫病特效的杀菌剂,抗药性的产生使其防效降低甚至丧失。建议今后在防治晚疫病时采用与保护性杀菌剂复配或混配使用单剂只限于土壤施用和种子处理, 且每季作物要限制使用次数同时, 采用其它药剂与甲霜灵交替使用防治病害2。参考文献:1.郑小波. 疫霉菌及其研究技术. 中国
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19、2-114。13.国立耘,王英华,梁德霖. 马铃薯晚疫病菌在内蒙古和甘肃的交配型分布及对几种杀菌剂的敏感性. 中国农业大学学报, 2003,8 (1) : 788214.Groves C T, Ristaino J B. Commercial fungicide formulations induce in vitro oospore formation and phenotypic change in mating type in Phytophthora infestans. Phytopathology, 2000, 90: 1201-1208 Determination of resi
20、stance of Phytophthora infestans to metalaxyl in Some areas of Gansu provinceLi Jun-jie(College of Grassland Science, Gansu Agricultural University, Lanzhou 730070)Abstract: Potato late blight is a devastating disease in potato production in the world. Metalaxyl is phenyl amide fungicide, used to pr
21、event the diseases caused by Phytophthora species. 80 strains of Phytophthora infestans were isolated from potato late blight disease leaves in Dingxi, lintao,Tian Shui, Linxia, Yuzhong, Zhochuan and Longxi, in 2008-2009 in this test. The resistance to metalaxyl of these strains were determined by m
22、easuring radial growth on rye agar medium. The results showed that 63.75% of the isolations were resistant, 21.25% showed intermediate level of resistance and 15% appeared sensitive to metalaxyl. The resistance levels were closely related with frequence of Metalaxyl application in the region and sug
23、gestions to fungycides application were done in this paper.Key words: Phytophthora infestans, metalaxyl, resistance致 谢在此，谨向热心帮助我的老师、耐心教导我的师长，同学和朋友、默默关怀和支持我的亲人致以最诚挚的谢意!首先要感谢我的指导教师李惠霞老师，是她的指引、帮助与教诲才使我有机会对马铃薯晚疫病及其抗药性有一个更深刻的认识和学习，是她那孜孜不倦的精神来手把手的教我从认识晚疫病菌侵染的病叶到以后对该种病的初步研究，我不但从向恩师学到了知识，而且她那种一丝不苟的精神和严谨治学的态度使我难以忘却。在实习期间，恩师渊博的专业知识、开阔敏捷的思维方式和活跃的学术思想给我以深刻的教益和启迪，学术上的教诲和生活上的关怀，将令我终身难忘。在做实验的过程中也得到了师哥吕伟等人的热心帮助和虚心指导，学习期间和论文撰写过程中他们给与我无私的支持和帮助，对此感激之情难以言表。多年来，感谢我远在家乡的父母亲及亲戚朋友对我真诚的关心与鼓励，是他们让我没有了后顾之忧从而能够专心致志做学问成为我的精神动力。他们的大力支持是我顺利完成学业的重要保障与坚强后盾，使我在今后的人生旅途中无法忘却。在此毕业之际，特向教育过我、帮助过我、关心过我的所有老师、同学、亲戚和朋友致以诚挚的谢意！谢谢！7