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1、本科毕业论文题 目：植物组织培养褐变产生的因素及对策Plant tissue culture browning production factors and Countermeasures姓 名：学 号专 业：指导教师：职 称 二一二 年 六 月 目录摘 要- 1 -论文关键词- 1 -Abstract- 1 -Key words- 1 -1 褐变原因及危害- 2 -2 褐变产生的机理- 2 -2.1非酶促褐变- 2 -2.2酶促褐变- 3 -3褐变产生的影响因素- 3 -3.1 植物种类及基因型- 3 -3.2 外植体部位及生理状态 - 4 -3.3 培养基的影响- 4 -3.3.1 抗氧化
2、剂- 4 -3.3.2 培养基的硬度- 4 -3.3.3 培养基中水的硬度的影响- 4 -3.3.4 培养基的pH值- 5 -4 其它因素- 5 -4.1 培养条件- 5 -4.1.1 光照- 5 -4.1.2 温度- 5 -4.1.3 转瓶周期- 5 -5.1适当外植体的选择- 5 -5.2 对外植体的处理- 6 -5.3 其它- 6 -5.3.1 改变培养基的状态- 6 -5.3.2 选择适宜的接种方式- 7 -5.3.3 通过试验选择适宜的消毒方式- 7 -5.3.4 添加天然附合物- 7 -5.4 添加褐变抑制剂和吸附剂- 7 -5.5 进行细胞筛选和多次转移- 7 -6 抗褐变研究展
3、望- 8 -7 总结- 8 -参考文献- 8 -致 谢- 10 -植物组织培养褐变产生的因素及对策摘 要植物组织培养过程中,褐变问题普遍存在,与菌类污染和玻璃化现象并称为植物组织培养的三大难题。针对褐变难题,本文结合相关资料,对影响褐变的因素作了全面分析，褐变的影响因素是复杂的,随植物种类外植体的部位几生理状况培养基及培养条件的不同而危害的程度有所不同,对这些因素是内因外界影响作用作了分析并针对这些因素提出了相应的解决措施。论文关键词植物组织培养；褐变；酚类物质；多酚氧化酶醌类物质；防治方法AbstractIn plant tissue culture browning problem, pr
4、evalence, and pollution and vitrification and known as the three difficult problems in plant tissue culture. The browning problem, this article unifies the correlation data, to affect the browning factors made comprehensive analysis, browning factors is complex, with plant species explants of parts
5、of several physiological status of culture medium and conditions of different and harm extent is different, these factors are internal cause external effects are analyzed and in view of these factors put forward the corresponding solution measures.Key words plant tissue culture; browning; phenols; p
6、olyphenol oxidase quinone; control methods1 褐变原因及危害 在许多植物组织培养过程中,常遇到褐变问题。褐变主要发生在外植体，在植物愈伤组织的继代悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中也经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。本文探讨植物组织培养中褐变现象的影响因素、机理及防范措施，对我们进行科学研究或工厂生产，包括植物组织的培养,原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养都有着十分重要的现实意义。 褐变是指外植体在培养过程中,自身组织从表面培养基释放褐色物质,以致培养基逐渐
7、变成褐色,外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物数量多少及多酚氧化酶活性有直接关系。很多植物，尤其是木本植物都含有较高的酚类化合物，这些酚类化合物在完整的组织和细胞中与多酚氧化酶分隔存在，因而比较稳定。在切割外植体时，切口附近的细胞受到伤害，其分割状态被打破，酚类化合物外溢。对于外植体本身来讲，酚类物质从外植体切口向外溢出是一种自我保护性反应，可诱导植保素或无物理屏障的形成，以防止微生物侵染组织。但酚类很不稳定，在溢出过程中与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下，迅速氧化成褐色的醌类物质和水，醌类物质又会在酪氨酸酶等的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合
8、，进一步引起其他酶系统失活。从而导致组织代谢活动紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。此外，由于组织的老化病变也会使多酚氧化酶激活而引起褐变。2 褐变产生的机理正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变,当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块,在氧的作用下，生成醌,从而引起褐变。在培养中出现的褐化多是由于细胞的程序化死亡或自然死亡造成的,但也不排除存在少量的酚类物质的褐化。在不同物种对愈伤组织诱导的影响实验中,不同物种之间褐化程度差别较大，这可能是因为褐化与整个发育过程一样受遗传因子的控制。它是遗传因子调控下的主动过程，控制了内部激素的信号转导，诱发了褐化的发生。但在愈伤组
9、织诱导实验中内部激素的信号转导不是可以直接进行人为控制的因素，可以直接进行人为控制的是外界环境因子。如果找到了那些引起褐化的环境因子，就有可能在最大程度上降低褐化。2.1非酶促褐变非酶促褐变是由于细胞受胁迫或其他不利条件影响所造成的细胞程序化死亡或自然发生的细胞死亡，即坏死形成的褐变现象，并不涉及酚类物质的产生1。将生长正常的愈伤组织转移到含NaCl的培养基中，组织周围尤其是接触培养基部分发生褐变，但培养基中没有看到扩散的褐化物质。当温度升高时继代保存时间过长，也会发生此类现象。但这种褐变若采取适当措施或者愈伤组织适应了胁迫环境就不再发生了2。2.2酶促褐变目前认为植物组织培养中的褐变主要是由
10、酶促褐变引起的，培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的3。酶促褐变如同一般的酶促反应，其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物,按其组成可分成3类:第一类是苯基羧酸,包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；第二类是苯丙烷衍生物,包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等），但并非所有的酚类物质都是PPO的底物。在正常发
11、育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。 3褐变产生的影响因素影响植物组织培养褐变的因子是复杂的，因植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等不同，褐变的程度也有所不同。3.1 植物种类及基因型 不同的植物和不同的基因型决定了不同的褐化程度。木本植物, 单宁含量或色素含量高的植物容易发生
12、褐变4。因为酚类的糖苷化合物是木质素、单宁或色素合成前体, 酚类化合物含量高, 木质素单宁或色素形成就多, 而酚类化合物含量高将导致褐变的发生, 因此, 木本植物一般 比草本植物容易发生褐变幼龄材料一般比成龄材料褐变轻, 可能与幼龄材料中酚类化合物含量少有关。在组织培养中，品种褐化难易可能是与该品种中多酚类物质含量的多少及多酚氧化酶(PPO)活性的差异有关。3.2 外植体部位及生理状态 外植体的部位及生理状态不同其褐化程度不同，同时，不同时期和不同年龄的外植体在培养中褐变的程度也不同。用油棕幼嫩器官或组织, 如胚等外植体进行培养, 褐变较轻, 而用高度分化的叶片作外植体, 接 种后则很容易褐变
13、。对濒危植物翅果油树的组织褐变研究也表明, 幼龄的茎段是诱导愈伤组织的最佳材料。植物体内酚类化合物含量和PPO活性呈季节性变化, 植物在生长季节都含有较多的酚类化合物。PPO活性和酶类含量基本是对应的, 春秋季较弱, 随着生长季节的到来性逐渐增强。所以, 一般都选在早春和秋季取材。 3.3 培养基的影响成分中的无机盐、蔗糖浓度、激素水平等对褐变的程度的影响尤为重要，要考虑所选培养基的状态和类型。另外，其pH值也与褐变程度有较大关系。培养防止褐变所进行的试验中，培养基以改良MS(大量元素减半) 和1/2MS的效果最好，MS的效果较差，结果证明低浓度的无机盐可促进外植体的生长与分化，减轻外植体褐变
14、的程度。如Mn、Cu是参与酚类合成与氧化酶类的组成成分或辅因子, 因此盐浓度过高会增加这些酶的活性, 酶进一步促进酚类合成与氧化6 。王异星7在荔枝的组织培养过程中，培养基中添加1 mg/LBA +0.5mg/L 2,4-D时，愈伤组织较坚硬，增殖缓慢，易产生褐变。3.3.1 抗氧化剂 加入抗氧化剂可改变外植体周围氧化还原电势, 从而抑制酚类氧化, 减轻褐变8。如在辣椒中加入9可 明显减轻褐变程度, 但不能长期用于继代培养 。在用不同褐变抑制剂对梨PPO活性抑制研究中发现10,L-半胱氨酸( L- Cys)、抗坏血酸( Vc)、NaHSO对梨翠冠PPO活性抑制效果较佳,而植酸(PA)和EDTA
15、-2Na抑制效果较差。在外植体接种之前, 用抗氧化剂浸泡一定时间, 也能收到一定效果。3.3.2 培养基的硬度 在一定范围内，琼脂用量大，培养基硬度大，这可能是培养基的硬度影响了酚类物质的扩散速度的缘故。采用液体培养基可以有效克服外植体褐变11,12在液体培养基中, 外植体溢出的有毒物质可以很快扩散, 因而对外植体造成的伤害较轻培养基状态。采用液体培养基可以有效克服外植体变 。在液体培养基中, 外植体溢出的有毒物质可以很快扩散, 因而对外植体造成的伤害较轻。3.3.3 培养基中水的硬度的影响 硬度低的蒸馏水褐变率低,而使用硬度较高的自来水,褐变严重,甚至会出现褐变死亡13。这可能是配制培养基的
16、水改变了培养基中无机盐的浓度,间接地影响了植物外植体的褐变。3.3.4 培养基的pH值在水稻体细胞培养中，pH值为4.5-5.0 时MS液体培养基可保持愈伤组织处于良好的生长状态，其表面呈黄白色，而pH值为5.5-6.0时，愈伤组织严重褐变14。一般来说，酸性环境(pH值为4.5-5.0)不利于褐变过程的发生154 其它因素 外植体大小及受伤害程度.为了减轻褐变, 在切取外植体时, 应尽可能减小其伤 口面积, 伤 口剪切尽可能平整些, 接种时各种化学消毒剂对外植体的伤害也会引起褐变 。一般来讲, 外植体消毒时间越长, 消毒效果越好, 但褐变也越严重, 因而消毒时间应掌握在一定范围内, 才能保证
17、外植体存活率较高。4.1 培养条件温度过高或光照过强，均可加速被培养组织的褐变。不利环境条件都能造成细胞的程序化死亡，温度是诱导程序化死亡的主要因素。如温度过高或光照过强，光照会提高PPO的活性，促进多酚类物质的氧化，从而加速被培养的组织褐变。高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，细胞内CO2增多，CO2与细胞膜上的CO2结合，使有效CO2减少，导致内膜系统瓦解，酚类物质与PPO相互接触，产生褐变16。因此，初期培养要在黑暗或弱光下进行。4.1.1 光照 暗处理能控制外植体褐变17 , 是因为在酚类化合物合成和氧化过程中, 需要许多酶系统, 其中一部分酶系统的活性是受光
18、诱导的。 4.1.2 温度 不仅可以抑制褐变 18，19 , 还可以抑制酚类化合物的合成, 降低PPO 的活性, 减少酚类氧化, 从而减轻褐变。4.1.3 转瓶周期 缩短转瓶周期可减轻褐变。反复转移在外植体接种后12d立即转移到新鲜培养基中, 能减轻醌类物质对培养材料的毒害作用, 连续转移56d,可基本解决外植体褐变问题。5 防止外植体产生褐变的对策 从理论上讲,酶促褐变可以通过以下三种方法加以抑制:一是除去引起氧化的物质氧；二是捕捉或减少聚合反应的中间产物；三是抑制有关的酶。实际操作上，下列措施是被认为行之有效的。5.1适当外植体的选择 成功的经验表明，选择适当的外植体并建立最佳的培养条件是
19、克服材料褐变的最主要手段。选择适宜的外植体，材料的年龄、取材部位、材料的大小及外植体受伤害程度等均能对褐变产生影响。外植体材料应有较强的分生能力，在最适宜的细胞脱分化与再分化的条件下，使外植体处于旺盛的生长状态，便可大大减轻褐变。一般情况下，取幼龄树新萌发嫩枝条的带芽茎段、嫩叶或茎尖作为外植体，也可采用幼胚来培养。另外对于某个种的植物进行培养前，在不影响培样目的的情况下，应筛选褐变低的基因型个体。 在培养条件的许多因子中，较为重要的是适宜的元机盐成分、适宜的蔗糖浓度及激素水平。培养早期的培养基中应含较低浓度的元机盐，降低Fe和Cu浓度或不用这两种离子； 在保证正常培养的需求下使用低浓度细胞分裂
20、素；愈伤组织或细胞培养物为异养型，应使培养物获得充足的氧气，以利于分化和生长。 适宜的温度及在黑暗条件下进行培养也可减轻材料的褐变。易发生褐变的外植体，可先于低温(420)预培养数小时，也可于黑暗或弱光照下预培养数日后再转入正常培养条件下培养。外植体受伤害程度直接影响褐变，切割时应尽可能减小伤口面积，并缩短切口在空气中的暴露时间。随着pH增高，多酚被氧化的作用增强，因此培养基pH值应控制在6.0以下。取材时应注意选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。成年植株比幼苗褐变程度厉害，夏季材料比冬季及早春和秋季材料的褐变要严重。冬季的芽不易生长，宜选用早春和秋季的材料作为外植体。王异星20用荔枝无菌苗
21、不同组织的诱导试验表明，茎最容易诱导出愈伤组织，培养2周后长出浅黄色的愈伤组织；叶大部分不能产生愈伤组织或诱导出的愈伤组织中度褐变；而根极大部分不产生愈伤组织，诱导出的愈伤组织全部褐变。5.2 对外植体的处理通过对较易褐变的外植体材料的预处理能减轻醌类物质的毒害作用。处理方法如下：外植体经流水冲洗后，在2-5的低温下处理12-24小时，再用升汞或70%酒精消毒，然后接种于只含有蔗糖的琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。取出外植体用0.1%漂白粉溶液浸泡10分钟，再接种到合适的培养基中。若仍有酚类物质渗出,3-5天后再转移培养基2-3次，当外植体的切口愈合后，酚类物质减
22、少，这样可使外植体褐变减轻或完全被抑制。何琼英等21用抗坏血酸预处理香蕉吸芽外植体，能减轻外植体褐变，从而提高芽丛诱导率。5.3 其它5.3.1 改变培养基的状态 如采用滤纸桥培养可使外植体溢出的有毒物质很快扩散到液体培养基中，对外植体危害较轻；或采用液体培养、半固体培养、液体培养与固体培养交替进行培养等也能减轻褐变的危害。5.3.2 选择适宜的接种方式把培养体切面浸入培养基中，减少了褐化发生的表面积，且组织切块的创伤面积相对较小，有利于保持转培初期切块浅表层细胞或组织处于原来的生长发育状态，从而减轻了因切面褐变带来的毒害作用。5.3.3 通过试验选择适宜的消毒方式可减少对外植体的伤害程度，从
23、而减轻褐化程度。5.3.4 添加天然附合物有试验表明，添加10%椰子水可提高洋兰原球茎的存活率，减少褐变死亡现象。5.4 添加褐变抑制剂和吸附剂褐变抑制剂主要包括抗氧化剂和PPO抑制剂。在培养基中加入偏二亚硫酸钠、L-半胱氨酸、抗坏血酸、柠檬酸、二硫苏糖醇等抗氧化剂都可以与氧化产物醌发生作用，使其重新还原为酚22。由于其作用过程均为消耗性的，在实际应用中应注意添加量，其中L-半胱氨酸和抗坏血酸均对外植体无毒副作用，在生产应用中可不受限制。在水稻细胞的培养基中，添加植酸(PA)，可防止褐变，PA分子中众多的羟基产生抗氧化作用，使生色物质的含量下降或PA与PPO分子中的Cu2 +结合，从而降低了其
24、活力。陈学森等23在对植酸在银杏组织培养中应用的研究中也证实了植酸具有抑制多酚氧化酶活性的作用。 常用的吸附剂有活性炭和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，能吸附培养基中的有害物质，包括琼脂中的杂质、培养物在培养过程中分泌的酚、醌类物质以及蔗糖在高压消毒时产生的5-羟甲基糠醛等, 从而有利于培养物的生长。粉末状的活性炭与颗粒状的活性炭相比吸附性更强，一般在培养基中加入1-4g/L的活性炭。在使用过程中应注意，尽量用最低浓度的活性炭来对抗褐变的产生，因为活性炭的吸附作用是没有选择性的，在吸附物质的同时，也会吸附培养基中的其他成分，对外植体的诱导分化会产生一定的负面影响2
25、4。而聚乙烯吡咯烷酮(PVP)是酚类物质的专一性吸附剂，在生化制备中常用作酚类物质和细胞器的保护剂，可用于防止褐变25。5.5 进行细胞筛选和多次转移 在组织培养过程中，经常进行细胞筛选，可以剔除易褐变的细胞。在外植体接种1-2天后应立即转移到新鲜培养基中，能减轻酚类物质对培养物的毒害作用，降低抑制作用，使外植体尽快分生，连续转移5-6次，可基本解决外植体的褐变问题26,27。 6 抗褐变研究展望 目前对于多酚类物质系统的研究及应用主要集中在植物化学，食品、制革、精细化工领域，集中于对多酚的生产应用，而在活细胞中的生化动态代谢机理及其对细胞的作用研究很少。目前国内植物组织培养关于褐变的研究文献
26、中，多数是针对具体材料进行试验性处理，处理的抗褐变物质种类多样，且各种试剂配比、浓度、及具体作用差别较大。部分研究开始对总酚含量、多酚氧化酶活性、过氧化物酶活性、可溶糖含量、可溶蛋白含量进行测定。测定褐变组织中具体多酚类物质种类及其相关基因研究的报道极少。由于植物种甚至品种，由于基因型不同所产生的酚类物质种类和量都有不同，而不同的酚类物质对细胞的毒害作用机理不一样且比较复杂，从而造成在培养过程中解决办法的多样化。因此，可着手于测定分析引起褐变的多酚类物质的种类，分析其危害细胞的生化原理，从根本上找出合理的解决方法，以形成完整体系。7 总结褐变产生的主要因素有两大类：非酶促褐变，酶促褐变。 非酶
27、促褐变是由于外界条件引起的，酶促褐变是由于内在因素引起的。防止褐变的方法有：选择适当的外植体，对外植体进行处理，使用适宜的培养基，添加褐变抑制剂和吸附剂，进行细胞筛选和多次转移。参考文献 1 徐振彪等.植物组织培养过程中的褐化现象M.国外农学杂粮物,1997(1):55-56.2 傅作申,玉米耐NaCl幼胚愈伤组织的筛选及特性分析M,长春农牧大学硕士论文1996.3 颜昌敏编著，植物组织培养手册M,上海科学技术出版社,1990.4 高国训.植物组织培养中的褐变问题J.植物生理学通讯,1999,35(6):501506.5 张妙霞.柿树组织培养防止外植体褐变的研究J.河南农业大学学报,1999,
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