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1、 淮北师范大学 2013 届学士学位论文 不同培养条件对雪莲果愈伤组织中不同培养条件对雪莲果愈伤组织中 低聚果糖的影响低聚果糖的影响 学院学院、专专业业 生命科学学院 生物科学 研研 究究 方方 向向 药用植物培养技术 学学 生生 姓姓 名名 学学 号号 指导教师姓名指导教师姓名 指导教师职称指导教师职称 2013 年 5 月 25 日 不同培养条件对雪莲果愈伤组织中低聚果 糖的影响 董小英 (淮北师范大学，生命科学学院) 指导教师：张爱民 摘要摘要 目的：研究糖的种类(蔗糖、葡萄糖） 、糖的含量（30 gL- 1、50 gL-1、70 gL-1)和 pH（5.5、6.0、6.5)对雪莲果愈伤
2、组织中低 聚果糖的影响。方法：以愈伤继代培养基 MS+2.0 mgL-16-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5 gL 琼脂为基本培养基，采用正交试 验，研究糖的种类（蔗糖、葡萄糖） ，糖的含量（30 gL-1、50 gL- 1、70 gL-1）和 pH（5.5、6.0、6.5）对雪莲果愈伤组织中低聚果糖 的影响。结果与结论：葡萄糖显著影响雪莲果愈伤组织中低聚果糖 的含量，适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖积累的最优组合为： MS+2.0 mgL-16-BA +0.2 mgL-1NAA +1.0 mgL-1KT +7.5 gL-1琼脂 +30 gL-1蔗糖+50 gL-1葡
3、萄糖，pH=6.0，培养时间为 15d, 15C。 关键词关键词 不同培养条件；雪莲果愈伤组织；低聚果糖；正交试验 Effects of different culture conditions on the oligosaccharide in yacon callus DONG Xiao-ying (College of Life Science, Huaibei Normal University) Tutored by ZHANG Ai-min Abstract objective: To study effects of type (came sugar、glucose) of su
4、gar, content (30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1) of sugar and pH (5.5、6.0、6.5) on the oligosaccharide in yacon callus. Methods: On the basis of callus subculture medium: MS+2.0mgL-16-BA+0.1mgL- 1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5gL-1agar, the type (cane sugar、glucose) of sugar ,content (30 gL-1、50 gL-1、70 gL-1) of sugar and
5、 pH (5.5、6.0、6.5)on the oligosaccharides in the yacon callus were studied by using orthogonal experiment. Results and Conclusions: Glucose played a significant role on the amount of the oligosaccharides in the yacon callus. The optimal combination for oligosaccharides accumulation in callus was: MS+
6、2.0 mgL-16-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-1KT+7.5 gL-1Agar+30 gL-1Sucrose+50 gL-1Glucose under the temperature of 15 C and the pH was6.0.The appropriate time of culturing yacon callus was 15 days. Keywords Different culture conditions; yacon Callus; Oligosaccharide; Orthogonal experiment 目录目录 引言1 1 材料和方法 1
7、 1.1 材料.1 1.2 方法.1 1.2.1 获取愈伤组织 .1 1.2.2 培养基和培养条件.1 1.2.3 材料处理 .2 1.2.4 雪莲果愈伤低聚果糖的提取 .2 1.2.5 总糖标准曲线的制作(苯酚-硫酸法) 2 1.2.6 还原糖标准曲线的制作(DNS 比色法)3 1.2.7 低聚果糖含量的测定 .4 1.2.8 数据统计分析 .4 2 结果与分析 4 3 讨论 9 参考文献.10 致谢.11 1 引言引言 雪莲果(Smallanthus sanchifalius)学名 Yacon（亚贡，或者阿贡）即“神果” 之意1,2，原产于南美洲安第斯山脉，是当地印第安人的一种传统根茎食品
8、，属 菊科，葵花属植物，又称为菊薯3,4，别名为地参果，亚贡。雪莲果果肉晶莹如 玉，香甜脆爽，富含多种维生素，属低热量食品5,6。 雪莲果块根中所含有的果寡糖（低聚果糖）是干物质的 60-70%为所有植物 中最高7，该糖在人体中不被分解消化，其低聚果糖并不为人体所吸收，因此 非常适合于糖尿病病人及减肥者食用8。此外，雪莲果还可以促进消化，调理 胃肠道，调理血液，清除高血脂，有效地控制胆固醇和糖尿病，对老年人的心 脑血管病有明显的保健作用。另外，它还能降火清毒，防治面部暗疮，对皮肤 美容及改善体质效果显著，雪莲果是集药、果、菜三位一体的营养保健品9。 当前，由于雪莲果的种植面积有限，市场上雪莲果
9、供不应求，雪莲果中低 聚果糖的开发才刚刚起步。且低聚果糖的代谢被认为环境胁迫的一种调节机制 10，本试验通过正交试验研究糖的种类、糖的含量和 pH 对雪莲果中低聚果糖 含量的影响，以期获得高产量低聚果糖的愈伤，为低聚果糖的工业化生产奠定 基础。 1 材料和方法材料和方法 1.1 材料材料 雪莲果无菌苗由资源植物生物学安徽省重点实验室提供，经薛建平教授鉴 定为向日葵属植物雪莲果(Smallanthus sanchifalius)。 1.2 方法方法 1.2.1 获取愈伤组织获取愈伤组织 取雪莲果无菌幼苗的茎段，在无菌水下反复冲洗干净。在超净工作台上先 用 70%的酒精消毒 30 s，然后用 0.
10、1%氯化汞溶液消毒 3 min，用无菌水冲洗 3-4 次并用无菌滤纸吸干，转接至培养基 MS+2.0 mgL-1 2,4-D+1 mgL-1 NAA 进行 愈伤组织的诱导，经多次继代培养，获得大量的愈伤组织。 1.2.2 培养基和培养条件培养基和培养条件 2 选用 MS 基本培养基，用 0.75%琼脂固化，pH5.8-6.0，添加 2.0 mgL-1 6- BA，1.0 mgL-1KT 和 0.2 mgL-1 NAA，分装于 100-150 mL 锥形瓶中，121 C 湿 热灭菌 15-20 min。选用 L9(34)正交表研究糖的种类含量和 pH 对雪莲果愈伤 组织中低聚果糖含量的影响。 表
11、1 L9 ( 34 )正交设计表 Table 1 Orthogonal table of L9( 34) 因素（Factor） 水平（Level） 蔗糖（gL-1）葡萄糖（gL-1）pH 值 1 30 30 5.5 2 50 50 6.0 3 70 70 6.5 1.2.3 材料处理材料处理 按照正交试验表配制 3 批 9 种培养基，每瓶培养基接种愈伤 2.0 g，置于 15 C 恒温培养箱中培养 5、10、15 d 后取出 60 C 烘干待用11。整体试验重复 3 次。 1.2.4 雪莲果愈伤低聚果糖的提取雪莲果愈伤低聚果糖的提取 准确称取 1 g 不同处理烘干后的雪莲果愈伤，分别研磨成粉末
12、形状放入圆 底烧瓶，加入适量蒸馏水混均,按 1:40 料液比，80C 水浴提取 4 h，后低速离心， 合并上清液即为所需要的低聚果糖提取液，最后放入冰箱低温保存待用12,13。 1.2.5 总糖标准曲线的制作总糖标准曲线的制作(苯酚苯酚-硫酸法硫酸法) 总糖标准曲线的制作：称取葡萄糖样品 20 mg 定容至 500 mL 容量瓶中， 摇匀。精密吸取 0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL 述溶液加入到具塞 试管中，补水至 2 mL，加入 1.0 mL 6%苯酚溶液，摇匀，迅速加入 5.0 mL 浓硫 酸，盖上塞，摇匀，在室温显色 20 min，以空白校正零点，于
13、490 nm 处测定其 吸光度14。以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，做出总糖的标准曲线 见下图 1，并得回归方程 y=15.789x-0.0605，R2 =0.9991 3 图 1 总糖标准曲线 Fig.1 Standard curve of the total sugar 1.2.6 还原糖标准曲线的制作还原糖标准曲线的制作(DNS 比色法比色法) DNS 溶液的配制：称取酒石酸钠 18.2 g，溶于 50 mL 蒸馏水中，加热（温度不宜 超过 50 C） ，于热溶液中先加入 NaOH 2.1 g，后加入 3，5-二硝基水杨酸 0.63 g，苯酚 0.5 g，搅拌至溶解，冷却后用蒸馏
14、水定容至 100 mL，贮于棕色瓶中，室温保存。 还原糖标准曲线的制作：取 6 支 25 mL 具塞试管，编号为 0 号、1-5 号。精密吸 取 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 葡萄糖标准溶液(1mg mL-1)加入到已编号的具塞试 管中，补水至 2 mL，精密加入 2 mL DNS 试剂。将各试管摇匀，在沸水浴中加热 2 min 后立即流水冷却至室温，蒸馏水定容至 15 ml，混匀。在 540 nm 波长下，用 0 号 校零，分别读取 1-5 号试管的吸光度。以光密度值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标， 做出还原糖的标准曲线见下图 2，并得回归方程 y=1.8623x+0.00
15、28，R2=0.9991 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 00.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04 y = 15.789x-0.0605 R2 = 0.9991 总糖质量浓度(mg/mL) 光密度值(D=490 nm) 光度值 线性 (光度值) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 00.10.20.30.40.50.6 y = 1.8651x+0.0070 R2 = 0.9941 还原糖质量浓度(mg/mL) 光密度值(D=540 nm) 光度值 线性 (光度值) 4 图 2 还原糖标准曲线 Fig.2 Standard
16、curve of the reducing sugar 1.2.7 低聚果糖含量的测定低聚果糖含量的测定 分别取 5 l 提取液，稀释 40 倍，按上述方法分别测定其中总糖和还原糖吸 光度值，并计算出总糖和还原糖含量，按下式计算出不同处理愈伤中低聚糖含 量。 雪莲果愈伤中低聚果糖含量(%)= 总糖含量(g)-还原糖含量(g)*100% 原料(g) 1.2.8 数据统计分析数据统计分析 定期观察记录，待 5 d、10 d、15 d 后将其烘干准确称重，并测定低聚果糖 含量，用 Minitab15 软件分析数据。 2 结果与分析结果与分析 雪莲果愈伤中低聚糖积累的正交试验雪莲果愈伤中低聚糖积累的正
17、交试验 最终统计试验结果见表 5，比较蔗糖的均值 K 可知 K1K2K3，说明低聚糖 含量随蔗糖浓度增大而减少即 30 gL-1的蔗糖较适合低聚果糖的积累。比较葡 萄糖的均值 K 可知 K2K3K1，说明低聚果糖的含量随葡萄糖浓度增大先增后减 即 50 gL-1的葡萄糖较适合低聚果糖的积累。比较 pH 的均值 K 可知 K2K3K1，说明低聚果糖含量随 pH 值增大先增后减即 pH 为 6.0 较适合低聚果 糖的积累。比较三者 R 值可知葡萄糖对低聚果糖含量影响较大，进一步方差分 析可知葡萄糖对低聚果糖含量的影响极显著（见表 6） 。 5 表 2 低聚果糖含量正交试验结果(5d) Table.
18、2 Results of orthogonal experimental on content of oligosaccharides in suspended cells of yacon (5d) 因素 Factors 固体培养基编 号 蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL- 1） pH（gL-1） 低聚糖含量 /% 130305.52.63 230506.0 6.13 330706.53.21 450306.0 5.12 550506.5 5.80 650705.5 5.64 770306.5 3.15 870505.5 5.95 970706.0 4.53 K1 3.99 3.63 4.74
19、 K2 5.52 5.96 5.26 K3 4.54 4.46 4.05 R 1.53 2.33 1.21 6 表 3 低聚果糖含量正交试验结果(10 d) Table.3 Results of orthogonal experimental on content of oligosaccharides in suspended cells of yacon (10 d) 固体培养基编 号 因素 Factors低聚糖含量 /% 蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL- 1） pH 130305.512.80 230506.0 18.95 330706.5 13.78 450306.0 15.34 55
20、0506.5 15.15 650705.5 15.01 770306.5 13.96 870505.5 15.85 970706.0 14.73 K1 15.17 14.03 14.55 K2 15.16 16.65 16.34 K3 14.84 14.50 14.29 R 0.33 2.62 2.05 7 表 4 低聚果糖含量正交试验结果(15 d) Table.4 Results of orthogonal experimental on content of oligosaccharides in suspended cells of yacon (15 d) 因素 Factors 固体
21、培养基编 号 蔗糖（gL-1） 葡萄糖（gL- 1） pH 低聚糖含量 /% 130305.517.12 230506.032.73 330706.522.20 450306.020.23 550506.519.56 650705.519.06 770306.517.73 870505.519.50 970706.018.50 K124.0118.3618.56 K219.6123.9323.82 K318.5719.9219.83 R5.445.575.26 8 综合 5 d，10 d，15 d 三组数据的均值 K 来看，可得下表： 表 5 雪莲果愈伤组织中低聚果糖含量的极差分析 Table
22、.5 Range analysis on content of oligosaccharides in callus from Smallanthus sanchifalius 表 6 雪莲果愈伤中的低聚果糖含量方差分析 Table.6 Variance analysis on the content of oligosaccharides from yacon 注：*表示在 0.05 水平上差异显著 Note:*means significant difference at P=0.05 因素 K 蔗糖（gL-1）葡萄糖（gL-1）pH K114.3911.9112.62 K213.4315
23、.5115.14 K312.6512.9612.72 R 1.743.62.52 来源偏差平方 和 自由度均方FP 值显著性 培养天数3541.08121770.540370.3580.000* 蔗糖36.890218.4453.8580.026* 葡萄糖183.952291.97619.2390.000* pH92.983246.4929.7250.000* Error344.205724.781 Total18992.59081 9 由表 2、3、4 直观分析可知，适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖积累的最优 组合为：MS+2.0 mgL-1 6-BA+0.2 mgL-1NAA+1.0 mgL-
24、1KT+7.5 gL-1 琼脂+30 gL-1的蔗糖+50 gL-1的葡萄糖，pH=6.0，培养时间为 15 d，15 C。配制该培养 基，转接愈伤，15 培养，进行验证该组合较适合雪莲果愈伤组织中低聚果糖 的积累。 3 讨论讨论 低聚果糖具有与普通食糖迥然不同的消化过程和代谢途径，并具有许多的 生理功能。植物中低聚果糖的代谢是植物调节环境胁迫的一种重要机制，它的 积累能够使植物在多种环境胁迫下的抗逆性增强，如低温和干旱引起的缺水、 缺氧、贫瘠等11。本试验发现，葡萄糖显著影响雪莲果愈伤组织中低聚果糖的 积累。30 gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量积累 较低，70
25、gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量积累 居中，50 gL-1的葡萄糖培养条件下，雪莲果愈伤组织中低聚果糖单位含量最高。 可见 50 gL-1葡萄糖含量可明显增加低聚果糖积累，而随葡萄糖含量进一步升 高或降低至超过它的耐受范围其含量明显呈下降趋势。可能因为耐受范围内适 宜低葡萄糖胁迫，低聚果糖的积累和植物的细胞代谢显著相关。可能因为耐受 范围内适宜低葡萄糖浓度控制。本试验中，70 gL-1葡萄糖含量培养条件下雪莲 果愈伤生长较慢，此时细胞代谢缓慢，因而低聚果糖含量积累较低；而 50 gL-1 葡糖糖含量培养条件下为其耐受范围内的胁迫，可能低葡萄糖浓度信号引起细 胞内相关
26、基因高水平表达，进而增加低聚果糖合成相关酶的分泌，引起低聚果 糖含量的增高，从而应答低葡萄糖浓度环境。 目前，雪莲果愈伤中低聚糖含量的变化研究还处于初级阶段，本试验仅仅 研究了糖的种类、糖的含量和 pH 对其含量的影响，而其它胁迫条件还未研究， 因而有必要进一步研究多因素对低聚糖积累的影响，进而获取更高产低聚糖的 愈伤，为低聚糖的工业化生产奠定基础。总之，随着低聚果糖这类新型功能性 的出现和生理功能作用的研究，其作为一种功能性食品的应用也将不断得以扩 展，也将有力的推动医药、食品、保健等相关行业的发展，提高人们的生活水 平和促进国民经济的发展具有现实和深远的意义。 10 参考文献参考文献 1吴
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30、愈伤组织总黄酮含量的影响J. 安徽农业科学, 2010, 38(11):5633-5635. 12王照波, 周文美, 徐子婷等. 匀浆辅助水浴法提取雪莲果低聚糖的工艺研究 J. 贵州大学学报, 2009, 26(4):100-101. 13王照波, 周文美, 徐子婷等. 雪莲果水浴性低聚糖的提取工艺J. 贵州农业 科学, 2010, 38(2):173-176. 14饶之坤, 封良燕, 张虽栓. 雪莲果营养成分分析研究J. 云南化工, 2007, 34(1): 52-54. 11 致谢致谢 本论文即将完成之际,我的心情久久无法平静。岁月如梭, 我大学的四年时 光也即将敲响结束的钟声。离别在即,
31、站在人生的又一个转折点上,心中难免思 绪万千,一种感恩之情油然而生。回顾四年来的学习学习经历,面对现在的收获, 我感到无比欣慰。为此,我向热心帮助过我的所有老师和同学表示由衷的感谢！ 感谢淮北师范大学生命科学学院提供的实验器材和实验药品。非常感谢薛 建平教授和张爱民高级实验师给我提供开放实验室这个宝贵的平台，使我的实 验动手能力有了很好的提高。同时感谢他们在我论文工作中的指导和督促。 感谢薛老师实验室里的各个成员,正是由于他们的帮助和支持,我才能一个 个克服困难解明疑惑,直至实验论文顺利完成。特别感谢我的实验搭档张婷同 学，她对本课题做了不少工作，给予我不少帮助。非常感谢朱秀云学姐在我论 文中
32、的热心帮助和耐心的解答。同时我还要感谢实验室里郭朝阳师兄雷婷学 姐等在我论文实验环节中的帮助。没有他们的帮助是没有办法完成论文的。同 时在实验室里也很庆幸能够认识这么多的同学,是他们让我懂得了团结互助的力 量,很开心,也很感激。 论文做到这才明白，做学问搞研究，真的不是一件容易的事情，但我们必 须学会在苦中作乐，把它变成一件快乐的事情。从论文选题到今天顺利完成， 我经历了人生的一次考验，学到的远远超过论文本身，这样的经历也让我更加 充满自信去面对未来的生活。在这个过程中，还有许多可敬的师长、同学朋 友给了我无言的帮助，在这里无法一一提及，谢谢！在此,我再一次真诚的向帮 助过我的老师、师兄师姐和同学表示感谢！ 董小英 2013 年 5 月 25 号 12