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1、暨南大学本科生毕业论文壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究摘 要硒代胱氨酸(SeC)是一种天然的含硒氨基酸，研究证明，SeC作为一种新型高效的抗肿瘤药物在肿瘤化学预防与治疗中发挥着重要的作用。然而，SeC进入肿瘤细胞与其作用需要较长一段时间，细胞渗透性较差。高分子载药纳米粒子是近年来发展起来的新剂型，药物经其包裹后，不仅可以提高药物稳定性，而且还可以大大提高药物的生物利用率。壳聚糖(CS)是一种优良的天然药物载体，具有良好的生物相容性，生物可降解性和无毒性,被广泛地用作医药载体。本文以壳聚糖为载体，戊二醛为交联剂，液体石蜡为乳化体系，制备出粒径小，分散性好，载药率及包封率
2、较高的SeC壳聚糖纳米粒子。最后通过细胞毒性实验，表明以壳聚糖纳米粒子为药物载体能够增强SeC对MCF-7乳腺癌细胞的抑制作用，并增强其体外抗肿瘤活性。关键词：壳聚糖纳米粒子；乳化交联法；硒代胱氨酸；体外抗肿瘤活性Preparation and in vitro anticancer activity of Selenocystine-loaded chitosan nanoparticlesAbstractSelenocystine (SeC), a naturally occurring selenoamino acid, has been shown to be a novel comp
3、ound with broad-spectrum anticancer activity. However, it takes a long time for SeC to interact with cancer cells due to its poor solubility and stability. Polymer, a new drug carrier, is widely used in pharmaceutical field. The encapsulation of drug helps to improve drug stability as well as antica
4、ncer activity. Chitosan is a popular drug carrier due to its biocompatible, biodegradable and nontoxic properties. In this paper, Chitosan loaded SeC nanoparticles were prepared in emulsion by using glutaraldehyde as crossing agent, span80 as emulsifier and paraffin as oil phase. Lastly, its proved
5、that chitosan nanoparticles loaded SeC had greater toxicity and antitumor activity to MCF-7.Key words: Chitosan nanoparticles; cross-linking emulsification; Selenocystine; in vitro anticancer activity 目 录摘 要IAbstractII第一章 绪论31.1 硒抗癌药物的研究进展31.2 硒代胱氨酸的研究现状31.2.1 硒代胱氨酸的性质31.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用31.3 纳米药物载体在肿瘤
6、治疗中的应用31.3.1 纳米技术的研究进展31.3.2 纳米药物载体的研究进展31.4 壳聚糖纳米粒子在纳米药物载体领域的制备和应用31.4.1 壳聚糖的结构与性质31.4.2 壳聚糖纳米粒子的制备31.4.4 壳聚糖纳米粒子的应用31.5 课题的研究意义与创新点31.5.1 课题的研究意义31.5.2 创新点3第二章 空白壳聚糖纳米粒子的制备32.1 实验部分32.1.1 材料与试剂32.1.2 实验仪器32.1.3 实验方法32.2 实验结果与讨论32.4.1 油相体系对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.2 油水比对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.3 表面活性剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响32.
7、4.4 壳聚糖浓度对壳聚糖纳米粒子的影响32.4.5 交联剂用量对壳聚糖纳米粒子的影响32.5 本章小结3第三章 壳聚糖纳米粒子负载硒代胱氨酸的制备33.1 实验部分33.1.1 实验材料33.1.2 实验仪器33.1.3 实验方法33.2 实验结果与讨论33.2.1 粒径分布及其稳定性的分析33.2.2 TEM分析33.2.2 包封率与载药率的计算33.3 本章小结3第四章 细胞毒性的研究34.1 实验部分34.1.1 实验试剂34.1.2 实验仪器34.1.3 实验原理34.1.4 实验步骤34.2 结果与讨论34.2.1 粒径分布34.2.2 TEM分析与EDX分析34.2.3 载药率与
8、包封率34.2.4 细胞存活率34.3 本章小结3第五章 总结与展望35.1 总结35.2 展望3致 谢3参考文献3IV壳聚糖负载硒代胱氨酸纳米粒子的制备及其体外抗肿瘤活性的研究第一章 绪论1.1 硒化学的研究进展硒是机体生命活动不可缺少的一种微量元素，被称为“生命奇效元素”1。1817年，硒由瑞典学者Berzelius发现，并命名为Selenium。但由于毒性，硒曾被认为是一种对高级生物有害的元素。1957年美国营养学家Schwarz和Foltz首次用硒治疗动物肝坏死取得成功后，硒逐渐明确为动物体内必需的微量元素2 。1973年，Rotruck等人发现硒是谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px的活性
9、成分后3，已经陆续有25种含硒蛋白被发现。1975年Awasthi等人首次明确指出，硒是人体必需的微量元素4。此后，硒与硒化合物的生理作用受到普遍关注。1988年，我国已经把硒列为膳食营养素之一。近年来研究发现，硒与人类40种疾病有关，如大骨节病、克山病、白内障、癌症等。硒可以保护心脏、肝脏等免受损伤，对癌症、心血管疾病、艾滋病等起到治疗和控制作用5-7。微量元素硒具有防癌，抗癌，抗氧化，拮抗重金属，抗逆境等多种生物学活性8 。 硒具有抗氧化作用，它是谷胱甘肽过氧化酶（GSH-Px）的活性中心，常以硒代半胱氨酸形式存在，GSH-Px能减轻或阻断自由基所致的脂质过氧化连锁反应，保护蛋白质、清除自
10、由基和DNA及生物膜的完整性，修复损伤分子部位；同时能提高机体免疫能力，抵抗疾病9。近年来，硒与硒化合物的抗肿瘤活性受到普遍关注，人们一直致力于设计和改造含硒化合物，以寻找抗肿瘤活性强，抗肿瘤谱广，毒副作用低，适用于临床的含硒抗肿瘤药物1。根据硒在自然界的存在形态，硒化合物可分为无机硒和有机硒化合物10。无机硒主要包括硒，硒酸盐(亚硒酸钠,亚硒酸锌等)，氧化硒，硫化硒，氯化硒以及硒化物（硒化氢，硒化钠，硒化钾等）等。有机硒主要包括硒多糖，含硒蛋白质，烷基硒，甲基硒酸以及人工合成的具有生物活性的有机硒化合物。硒在生物体内主要以有机硒化合物的形式存在，一类是含硒氨基酸，另一类是含硒蛋白质。无机硒具
11、有较好的抗癌活性，但无机硒化合物脂溶性差，不易进入细胞，且具有蓄积毒性和致突变作用，限制了它在临床上的应用。而相比之下，有机硒化合物吸收率高，生物活性强，毒性低和环境污染小，不仅能够更好地发挥硒的作用，而且在激发免疫反应上也比无机硒显著，抗癌作用更强11。其中含硒氨基酸-硒代半胱氨酸（selenocysteine）是生物合成和掺入到蛋白质分子中的第21种氨基酸12。从此有机硒化合物的研究引起了广泛关注，Shahd等人在2005年报道了有机硒化合物Methylseleninic acid (MSA)和它莫西芬一起可以治疗子宫内膜癌和乳腺癌13。1.2 硒代胱氨酸的研究现状1.2.1 硒代胱氨酸的
12、性质硒代氨基酸在有机硒化合物中，有特殊的重要性。在哺乳动物组中，硒代氨基酸是硒的主要存在形式，包括硒代胱氨酸(SeCys) 和硒代蛋氨酸(SeMet)。硒代胱氨酸是胱氨酸分子中S被Se所取代后的含硒氨基酸14。结构式如图1.1。图1.1 硒代胱氨酸的结构式1.2.2 硒代胱氨酸的抗癌作用SeC，是一种天然存在的含硒氨基酸，在化学预防与治疗方面具有巨大的潜力。Chen等15通过实验比较几种含硒化合物对八种人类癌症细胞的抗癌活性，实验证明，SeC与亚硒酸盐对A375，MCF-7，HepG2，SW620等癌细胞的细胞毒性比硒代蛋氨酸，硒甲基硒氨酸，硒酸盐等强。且SeC对人类正常纤维原细胞Hs68的细
13、胞毒性很小，IC50400 ，毒性远小于亚硒酸盐。因此，SeC具有更广谱高效的抗肿瘤活性，且对正常细胞的毒性较小。因此，SeC是一种新型高效的抗肿瘤药物。虽然SeC作为抗肿瘤药物具有较强的抗肿瘤活性，但是从Chen等16实验结果表明，SeC的水溶性与稳定性较差，进入MCF-7细胞发挥作用的时间比较长，36 h之后才观察到明显的细胞凋亡的现象，且72 h后的IC50=16.25.2 ，说明SeC不易进入肿瘤细胞，对细胞的渗透性不强。因此，希望借助纳米药物载体来提高细胞吸收，减少它进入肿瘤细胞的时间。1.3 纳米药物载体在肿瘤治疗中的应用1.3.1 纳米技术的研究进展早在1959年，著名物理诺贝尔
14、奖获得者Feynman就预言了纳米科技的出现及前景。1990年7月，在美国巴尔的摩召开了第一界国际纳米科技会议，标志着纳米科技的正式诞生。纳米，是尺寸度量单位，1纳米=10-9 米，相当于4个原子并列的直径。所谓纳米技术则是指0.1-100 nm内的物质或结构的构造技术，即纳米级材料的设计，制造，测量和控制技术17。纳米材料具有小尺寸效应、量子尺寸效应，表面效应和宏观量子隧道效应四大效应。当物体达到纳米级后，纳米粒子在热学、光学、磁学力学及电化学方面表现出独特的优势18。进入21世纪，纳米技术迅速发展，作为一个多学科交叉领域，涉及面广应用十分广泛。纳米技术与材料已经在航天，汽车，消费日用品，生
15、物医学领域获得应用，并取得一些列举世瞩目的成果19。随着纳米技术向医学界不断渗透，纳米技术在生物医药方面的应用，特别在肿瘤的诊断和治疗方面，受到了广泛的关注17。纳米技术在肿瘤治疗中的应用主要表现在一下几个方面：控释载药微粒，靶向载药微粒，磁导航靶向载药微粒，基因载体20。其中，纳米药物载体在医学领域中控释缓释的应用极为广泛，提高药物的利用率疗效和减少药物的副作用已成为医药研究领域的一项重要课题。1.3.2 纳米药物载体的研究进展理想的纳米粒载体应是无毒和可生物 的。一种理想的纳米药物载体应具备以下特征21 ：具有较高的载药量具有较高的包封率 制备和纯化方法简便，容易放大到工业化生产 载体材料
16、可生物降解，毒性较低或没有毒性 具有适当的粒径与粒型 具有较长的体内循环时间纳米药物载体的种类有以下几种（如图1.2所示）：纳米聚合物药物载体 ，包括：聚合物纳米粒（纳米囊和纳米球）纳米树突状聚合物和聚合物胶束纳米脂质体药物载体，纳米病毒药物载体，碳纳米管22。虽然，纳米药物载体作为载药系统有诸多优点，但仍存在一些问题，如生物相容性以及细胞毒性等。因此，寻找生物相容性好，低毒性的纳米药物载体成为了近年来研究的目标。图1.2 纳米药物载体的类型目前，用于纳米药物载体研究的生物可降解聚合物主要有合成聚合物和天然高分子聚合物。合成聚合物主要有聚乳酸（PLA）、聚乙醇酸（PGA）、聚乳酸共聚乙醇酸（P
17、LGA）、聚已内酯（PCL）、聚氰基丙烯酸烷基酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚酐等。天然高分子聚合物主要包括天然多糖，多肽以及其他亲水性生物可降解聚合物23。但是，通过化学方法合成得到的大部分药物载体在生物相容性，可降解性以及细胞毒性等方面还存在不尽如意的地方24。近年来，生物大分子材料由于其可再生性，无毒性以及良好的生物相容性，生物可降解性和黏膜粘附性等优点成为药物载体研究的热点，于是利用生物大分子材料来制备纳米药物载体的研究应运而生。用于纳米药物载体的生物大分子主要包含蛋白质和多糖两大类。蛋白质一般包括如明胶，白蛋白，丝蛋白等物质，多糖类一般包括如壳聚糖，海藻酸钠，环糊精，果胶等物质。由于生物
18、大分子可以从自然界的动植物中获得，生物相容性良好，并且可被生物体内的酶降解，毒副作用较小，且分子上带有的羟基，氨基，羧基等大量可反应的官能团，可作为化学修饰的位点，因此它们作为药物载体材料具有广阔的应用前景25。1.4 壳聚糖纳米粒子在纳米药物载体领域的制备和应用1.4.1 壳聚糖的结构与性质壳聚糖也称为甲壳胺或几丁聚糖壳聚糖，是一种天然的生物高分子线性多氨基多糖，为甲壳素的脱乙酰化产物。在自然界中，壳聚糖广泛存在于低等植物菌类，藻类的细胞，节肢动物虾，蟹，蝇蛆和昆虫的外壳，贝类，软体动物（如鱿鱼，乌贼）的外壳和软骨，高等植物的细胞壁等，每年生物合成的资源量高大100亿t，是地球上仅次于植物纤
19、维的第二大生物资源26。壳聚糖的化学名称为 (1-4)2-氨基-2脱氧-D-葡聚糖，甲壳素的化学名称为(1-4)2-乙酰胺基-2脱氧-D-葡聚糖27。结构式如图1.3所示。图1.3 壳聚糖与甲壳素的结构(A) 甲壳素 (B)壳聚糖壳聚糖的每个C6单元均含有一个氨基，两个自由羟基。由于氨基的存在，它是自然界中唯一带正电荷的碱性多糖。它不溶于水和有机溶剂，但是能溶于PH90 % MW=60000上海伯奥生物科技有限公司戊二醛(25%)AR天津市百世化工有限公司甲苯AR天津市百世化工有限公司无水乙醇AR天津市百世化工有限公司石油醚AR天津市百世化工有限公司冰醋酸AR天津市百世化工有限公司实验用水均为
20、二次蒸馏水，药品称量均使用德国Sartorius 公司的电子分析天平，误差为0.1 mg。玻璃仪器均经超声清洗40分钟，所有反应均在室温中（25 ）进行。2.1.2 实验仪器表2-2 实验仪器Table 2-2 Apparatus used in experiment仪器名称型号产地电子天平BP301S德国Sartorius 公司离心机Centrifuge 5804REppendorf超声破碎仪JY92-IIDN宁波新芝生物科技股份有限公司纳米粒度仪Nano-ZS英国马尔文(Malvern)公司透射电子显微镜TECNAI-10荷兰Philips相关仪器原理（1）Nano-ZS型纳米粒度仪英国马
21、尔文公司(Malvern) Nano-ZS型纳米粒度仪，入射光为氦氖激光，波长 = 633 nm，入射角90，测量温度(25.0 0.1) ；常用的纳米粒度仪均采用激光作光源，故纳米粒度仪也称激光纳米粒度仪或激光粒度仪。激光粒度分析法是根据激光照射到颗粒后，颗粒能使散射的激光产生衍射或散射的现象来测试粒度分布的。其依据的光学原理为Fraunhofer衍射和Mie散射理论，因此相应的激光粒度分析仪分为激光衍射式和激光动态散射式两类。但是很多研究证明对于粒径小于1 m的颗粒，必须用Mie散射理论求解粒径分布。散射式纳米粒度分析仪基于动态光散射（DLS）技术，与激光散射仪中动态光散射测量粒径分布的原
22、理一样，是借助光子相关原理（PCS)检测因布朗运动及多普勒效应产生的散射光的微小频移而得到散射质点动态行为的信息技术。测试范围下限可达到1 nm，可测悬浮液、乳浊液、微乳液等体系。本论文中，利用纳米粒度仪来快速、准确方便地对纳米溶胶样品中颗粒的大小及分布、形态等进行测定。(2) 透射电子显微镜透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM），型号TEANAI-10型透射电子显微镜philips，或高分辨透射电子显微镜（High resolution transmission electron microscope，HRTEM)，它是把经加速和聚集的电子
23、束投射到非常薄的样品上，电子与样品中的原子碰撞而改变方向，从而产生立体角散射。散射角的大小与样品的密度、厚度相关，因此可以形成明暗不同的影像。本论文研究中以TEM观察壳聚糖纳米材料的结构。2.1.3 实验方法称取CS溶于2%乙酸溶液中，搅拌使其溶解后备用。取500 L CS溶液缓慢滴加到含有表面活性剂span80的的液体石蜡中，经超声处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后滴加一定量的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液（CSNPs）。由于采用乳液交联法制备壳聚糖纳米粒子的影响因素有以下几个：壳聚糖溶液
24、浓度，油水比，表面活性剂用量，pH值，搅拌速率，乳化时间，交联剂用量，交联时间和交联温度等。本实验将选取不同壳聚糖溶液浓度，不同油水比，不同的表面活性剂用量以及不同的交联剂用量，不同的油相体系，筛选出制备壳聚糖纳米粒子的最佳工艺条件，用以后续的载药制备。(1)不同油相体系的选择水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。油相：分别选用液体石蜡，甲苯各25 mL，加入占其体积5%(1.25 g)的Span80,搅拌均匀后备用。取500 L CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2
25、h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。(2)不同油水比的选择水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/ml的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。油相：分别量取液体石蜡5 mL，10 mL，15 mL，20 mL，25 mL，加入占其体积5%的Span80,搅拌均匀后备用。取500 L CS溶液缓慢滴加到不同体积的油相溶液中，经超声2 h
26、处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%3 ml的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。(3)不同表面活性剂用量的选择水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D90%）的壳聚糖500 mg，溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成20 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积2%，3%，4%，5%，6%的Span80，搅拌均匀后备用。取500 L CS溶液缓慢滴加到含不同量Span80的油相溶液中，经超声2 h
27、处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。(4)不同壳聚糖浓度的选择水相：分别称取分子量为60000的壳聚糖（D.D90%）的壳聚糖250 mg, 375 mg, 500 mg, 625 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成浓度分别为10 mg/mL，15 mg/mL，20 mg/mL，25 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积3%(0.75 g)的Span80,搅拌
28、均匀后备用。取500 L 不同浓度的CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后逐渐滴加1%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。(5)不同交联剂用量的选择水相：称取分子量为60000的壳聚糖（D.D90%）的壳聚糖375 mg溶于25 mL 2% 醋酸溶液中配制成浓度为15 mg/mL的壳聚糖溶液，搅拌至完全溶解备用。油相：量取液体石蜡25 mL，加入占其体积3% (0.75 g)的Span80,搅拌均匀后备用。取500 L
29、CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后分别逐渐滴加2 mL，3 mL，4 mL，5 mL，6 mL 1 %的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白色溶液。（CSNPs）。取500 L CS溶液缓慢滴加到油相溶液中，经超声2 h处理后形成稳定的W/O型微乳液，然后分别逐渐滴加0.5%，1%，3%，5%，7%的戊二醛作为交联剂进行化学交联，超声分散后在室温下搅拌3 h，8000 r/min离心，然后用无水乙醇和石油醚洗涤并离心，最后用蒸馏水清洗，得到乳白
30、色溶液。（CSNPs）。2.2 实验结果与讨论2.4.1 油相体系对壳聚糖纳米粒子的影响(1)粒径分布及其稳定性的分析表2-3 和图2.1是不同的油相体系对壳聚糖纳米粒子粒径的影响.从图中可以看出，甲苯作为油相制备所得的纳米粒子粒径与PdI明显比液体石蜡制得的粒子大，这可能与油相体系的粘度有关。表2-3 油相体系比对纳米粒子粒径的影响Table 2-3 Effect of different oil phase on nanoparticles sizesNo.size(d.nm)PdIparaffintolueneparaffintoluene1169.0 205.7 0.200 0.345
31、 2247.4 276.4 0.294 0.436 3186.5 225.6 0.193 0.507 4204.2 495.1 0.154 0.778 图2.1 油相体系对纳米粒子粒径的影响Fig. 2.1 Comparison of different oil phase on nanoparticles size2.4.2 油水比对壳聚糖纳米粒子的影响(1)粒径分布及其稳定性的分析表2-4与图2.2是不同油水比对壳聚糖纳米粒子粒径的影响。从表跟图中可以看出，粒子粒径在油相体积较小时粒径随油相体积增加而增加，当油相体积增加到一定量时，则随着油相体积的增加而减少。这可能是由于在油相体积较小时，
32、水相纳米粒子分散不均匀，存在纳米粒子粘连现象，而交联剂的加入使得这些纳米粒子粘连现象加重，从PdI和粒径分布图看出，油相体积比小时PdI较大，分散不均匀。随着油水相体积比增大，水相纳米粒子能够被较厚的油相膜隔离开，降低了在超声分散过程中纳米粒子粘连的几率，从PdI和粒径分布图看出，油水相体积比增大，粒径分布更加均匀，粒径减小。表2-4 油水比对纳米粒子粒径的影响Table 2-4Effect of the ratio of paraffin to CS on nanoparticles sizesNo.O/W(V/V)Paraffin(ml)Size(d.nm)PdIA-110:15140.7
33、0.244 A-220:110157.20.195 A-330:115 167.80.130 A-440:120 160.70.207 A-550:125 150.80.121 图2.2 油水比对纳米粒子的影响Fig. 2.2 Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles sizes 图2.3 不同油水比纳米粒子的粒径分布Fig. 2.3 Comparison of different ratio of paraffin to CS on nanoparticles sizes(A-1) O/W=10:1 (A-2) O/W=20:1 (A-3) O/W=30: 1 (A-4) O/W=40:1 (A-5) O/W=50:1 (2) TEM分析TEM（TEANAI-10型透射电子显微镜，philips）观察形貌：将样品分散均匀，用铜网蘸取样品后用磷钨酸进行染色，以确定所得样品微粒的大小、形貌和均匀性，并拍摄有代表性的电镜照片。结果与纳米粒度仪测得的平均粒径大约相符。从TEM图中可