毕业设计（论文）-精氨酸激酶（AK）的提取与纯化.doc

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1、学号编号研究类型 基础研究 分类号Q51 毕业论毕业论文（文（设计设计） ） Bachelors Thesis 论文题目精氨酸激精氨酸激酶酶（ （AK）的提取与）的提取与纯纯化化 作者姓名 指导教师 所在院系生物系 专业名称生物科学 完成时间2007 年 6 月 6 日 主主 要要 符符 号号 对对 照照 表表 AK 精氨酸激酶 E.coli 大肠杆菌 IPTG 异丙基硫代-D-半乳糖苷 Kanamycin 卡拉霉素 CMC CM-Cellulose S-100 SephacrylTM-100 2-mercaptoethanol 巯基乙醇 Glycine 甘氨酸 PMSF 苯甲基磺酰氟 EDT

2、A 乙二胺四乙酸 NaN3 迭氮钠 Arg 精氨酸 ADP 二磷酸腺苷 ATP 三磷酸腺苷 h 小时 min 分钟 目目 录录 1 引言 1 1.1 精氨酸激酶（AK） 1 1.2 蛋白质的分离与纯化 2 2 实验试剂以及实验仪器： 5 2.1 实验材料 5 2.2 主要实验试剂与仪器 8 3 实验方法 9 3.1 活化菌种 9 3.2 扩大培养 9 3.3 IPTG 诱导 AK 基因的表达 9 3.4 蛋白质提取9 3.5 蛋白质的检测 .10 3.6 蛋白质的纯化 .10 4 结果与分析 .12 4.1 AK 诱导表达电泳图 12 4.2 蛋白质经 CMC 离子交换的层析谱图和电泳图.13

3、 4.3 蛋白质经分子筛 S-100 交换的层析谱图和电泳图 .14 4.4 蛋白质经 QSEPHAROSE阳离子交换的层析谱图和电泳图 16 4.5 AK 经各步纯化后的 SDS-PAGE 电泳图谱.17 5 讨论 .18 参考文献： 20 精氨酸激酶（精氨酸激酶（AK）的提取与纯化）的提取与纯化 摘要摘要：精氨酸激酶（ATP：N-精氨酸磷酸转移酶 EC2.7.3.3）存在 无脊椎动物中，是参与细胞代谢的磷酸激酶。重组有 AK 基因的 E. coli Rosetta，在含有 50 g/ml 的卡纳霉素的 LB 培养基中培养。当 A600达到 0.6-0.8 时，用终浓度为 0.2 mM 的异

4、丙基硫代-D-半乳糖苷（IPTG）诱导培养 3 小时。 加裂解液后用超声破壁离心取上清，得到精氨酸激酶粗提 液。通过 CM-Cellulose 阳离子交换层析，SephacrylTM-100 凝胶过滤层析，Q-Sepharose 阴离子交换层析分离纯化得到 电泳纯的精氨酸激酶。 关键词关键词：精氨酸激酶 提取与纯化 Extraction and Purification of Arginine Kinase Abstract： Arginine kinase（ATP：L-arginine phosphotransferase EC 2.7.3.3） ，plays an important ro

5、le in cellular energy metabolism in invertebrate. E. coli Rosetta which contains recombinant AK gene was grown in LB medium containing kanamycin (Final concentration: 25 g/mL). When absorbance at 600 nm value was between 0.6 with 0.8, isopropyl -D-thiogalactopyranoside was added to 0.2 mM and the in

6、cubation was continued an addition 3 h. The cell was broken and centrifugated, then the crude cell extract was harvested. Furthermore it was purified by following three methods in turn: CM- Cellulose positive ion exchange chromatography, SephacrylTM-100gel filtrate chromatography, and Q- Sepharose a

7、nion exchange chromatography. A purified AK was found to be homogenous by SDS poly - acrylaminde gel electrophoresis. Key words: arginine kinase extraction and purification 1 精氨酸激精氨酸激酶酶（ （AK） ） 的提取与的提取与纯纯化化 1 引言 1.1 精氨酸激酶（AK） 精氨酸激酶1（AK）是一种磷酸原激酶，磷酸原是一种磷酸 化的胍基化合物。AK 在体内催化如下反应： Mg2+ATP+Arg Mg2+ADP+Argi

8、nine phosphate AK 广泛颁布在许多无脊椎动物体内,目前已经研究过的生物 包括：节肢动物、腹足动物、海参、头足类动物，龙虾、海葵、 海湾对虾等，这些生物体内都可以分离得到 AK。 虽然 AK 在无脊椎动物中分布十分广泛，生理功能也大致相 同，但不同来源的 AK 在结构上表现出了非常大的多样性。按照 蛋白质的四级结构和分子量，可以划分为以下三类：1.单亚基 AK，如海湾对虾中 Penaeus aztecrs 中提取的 AK，相对分子量约 为 40KD，单亚基 AK 是目前研究最广泛的，本实验中我们所研 究的 AK 就是单亚基，相对分子量为 40KD。2.海参 Stichopusja

9、ponicus 中提取的 AK 为双亚基的蛋白质，相对分子质 量约为 84KD。3.环节动物 Sabellapavonina 中的 AK 具有四个亚 基，分子量为 150-160KD。 某些物种的精氨酸激酶的晶体结构已经被解析出来，AK 是 由一个小的 螺旋组成的 N 端结构域和一个大的 C 端结构域组成 2 的，C 端结构域与 Glu 合成酶的 C 端结构域相似，8 股串起来的 反平行 折叠被 7 个 螺旋所包绕2。过渡态类似物的结合部位 不在两个结构域之间，而是在 C 端结构域的内部3。如下图所示 4： 图图 1. 结合有过渡态类似物的结合有过渡态类似物的 AK 的晶体结构的晶体结构 我们

10、已经克隆有精氨酸激酶基因的菌株，宿主菌含表达质粒 pET28a, pET28a 含：强启动子序列，两个 lac 操纵序列；精氨酸 激酶基因，核糖体结合位点，多克隆位点，复制起点。 在工程菌株中，导入抗 Kana 青霉素的 pET28a 质粒，菌株中 原有质粒产生阻遏蛋白，这种阻遏蛋白与 pET28a 的 LacO 操纵基 因结合，阻止外源基因的表达。当加入 IPTG 诱导时，IPTG 与阻 遏蛋白结合，解除了阻遏蛋白与 pET28a 操纵基因结合的抑制作 用，使 pET28a 上面的外源基因能够顺利表达5。IPTG 是一种乳 糖类似物，我们的主要目的是诱导表达并纯化精氨酸激酶，为后 续研究其在

11、蛋白质折叠和分子伴侣中的功能做准备 1.2 蛋白质的分离与纯化 1.2.1 细胞的破碎 3 1)高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约 1/3 体积， 盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所 需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2)玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆 来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高 速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3)超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细 胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各 种酶，常选用 50-100 毫克菌体/毫升浓度，在 1KG

12、 至 10KG 频率 下处理 10-15 分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热， 应采取相应降温措施。对超声波敏感和核酸应慎用。 4)反复冻融法：将细胞在-20 度以下冰冻，室温融解，反复几 次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀， 使细胞结构破碎。 5)化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷 基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚， 可采用溶菌酶处理效果更好。 1.2.2 蛋白质（包括酶）的提取 大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与 脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此， 可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白

13、质及酶。 1.2.3 蛋白质的分离纯化 蛋白质的分离纯化方法很多，主要有： 1.2.3.1 根据蛋白质溶解度不同的分离方法 1)蛋白质的盐析 中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随 着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续 升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称 盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水 4 化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶 粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更 好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需 的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中

14、性盐浓度可 使各种蛋白质分段沉淀。 2)等电点沉淀法 蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度 也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达 到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐 析法结合用。 3)低温有机溶剂沉淀法 用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋 白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变 性，应在低温下进行。 1.2.3.2 根据蛋白质分子大小的差别的分离方法 1)透析与超滤 透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。 超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子 通过半透膜，而蛋白质留在膜上，

15、可选择不同孔径的泸膜截留不 同分子量的蛋白质。 2)凝胶过滤法 也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋 白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖 凝胶（Sephadex gel）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。 1.2.3.3 根据蛋白质带电性质进行分离 蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。 5 1)电泳法 各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而 在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳， 这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个 由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定电荷的

16、蛋白质在其 中泳动时，到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分析 和制备各种蛋白质。 2)离子交换层析法 离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素，CM-纤维 素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素，DEAE），当被分 离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反 电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强 度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。 1.2.3.4 根据配体特异性的分离方法亲和色谱法 亲和层析法（af inity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法， 。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子 能特

17、异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是 以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的 蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification） 和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今 还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质从复杂的混 合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。 6 2 实验试剂以及实验仪器： 2.1 实验材料 工程菌种：Ecoli 工程菌株 Rossta LB 培养基：10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10g 氯化钠， 溶于 950ml 中，用 NaOH 调节 pH 至 7

18、.0，补 加蒸馏水至总体积为 1L，分装2后高压蒸汽 灭菌。 缓冲液6： Buffer A 成分 含量 Tris 0.4 M EDTA 1 mM PMSF 25 M 2-mercaptoethanol 10 mM NaN3 5 M 加入浓盐酸调 pH 8.0 7 Buffer B： 贮存贮存 Buffer 成分 含量 Tris 10 mM EDTA 0.1 mM 2-mercaptoethanol 10 mM 加入浓盐酸调 pH 8.0 成分 含量 8 工作工作 Buffer： 测活底物测活底物 2.2 主要实验试剂与仪器 2.2.1 实验试剂 Glycine 0.1 M （NH4）2 SO4

19、 3.2 M 2-mercaptoethanol 10 mM 加入 NaOH 调至 pH8.6 成分 含量 Glycine 0.1M 2-mercaptoethanol 10mM 加入 NaOH 调至 pH8.6 成分 含量 57 mM Arg 2.0 ml 66 mM Mg(AC)2 2.0 ml 指示剂 2.0 ml ATP 0.0532g 蒸馏水 14 ml 加入 NaOH 调至 pH8.2。 9 SephacrylTM-100、 CM-Cellulose、Q-sepharose、Glycine、L- Arg 、Mg(CH3COO)2 4H2O、购自 Sigma 公司，Tris 、Gly

20、cine、ATP、Bis - Acrylamide、2 - mercaptoethanol、IPTG 、PEG (Polymthylene Glycol) - 8000、购自 Amresco 公司, Acrylamide、SDS(Sodium dodecyl sulfate)购自 Biomol 公司,。其余 所用试剂为国产分析纯试剂。 2.2.2 主要实验仪器 紫外分光光度计 U4300（Sweden/GE） YC-1 型层析实验冷柜（北京博医康实验仪器司） CXG-1 型电脑恒温层析柜（上海沪西分析仪器厂有限公司） ORION pH 计（美国 orion 公司） HD-3 紫外检测仪（上海沪

21、西分析仪器厂有限公司） TGL-16LA，GL-2M 型冷冻离心机(湖南星科仪器有限公司） GL-2M 型冷冻离心机（湖南星科仪器有限公司） 超声破壁仪（上海之信仪器厂有限公司） 雪山制冰机（北京长洋科学仪器公司） 超纯水机 AYJ1-0501-U（颐洋企业发展有限公司） 低温恒温槽 DH-2120（上海嘉鹏科技有限公司） 电泳仪 DYY-5（北京市六一仪器厂） 电子天平 TE412-L，TE2101-L，CP64（德国 Satorins 公司） 10 BS-1E 振荡培养箱(江苏省金坛市亿通电子仪器厂) SW-CJ-1FD 单人单面净化工作台（苏州净化设备有限公司） 3FG-01B 电热恒温

22、鼓风干燥箱 高压灭菌锅 YXQ-LS-50S（上海博迅有限公司） 3 实验方法 3.1 活化菌种 取工程菌种 10 l 接入装有 3 ml 的 LB 液体培养基的试管 （含有卡那青霉素，其工作浓度为 50 g/ml）中。于 37 摇床振 荡培养 8-12 小时。 3.2 扩大培养 将试管中活化的 1 ml 菌液接种到 300 ml LB 培养基，同时加 入 300 l 卡那青霉素（终浓度 50 g/ml）培养基于 37 恒温培 养箱中培养 2-3 小时。 3.3 IPTG 诱导 AK 基因的表达 实验中在不同的培养时间（用 OD 值表征菌体密度）加入 IPTG 诱导表达发现，当 OD=0.6-

23、0.8 时，加 150 l 的 IPTG 至终 浓度为 0.2 mM 时 AK 的表达量达到最大。 3.4 蛋白质提取 （1）将上述各管于 4 ，5000 r/m 离心 10 min； （2）弃上清，使沉淀物质重悬，每 1 g 沉淀加 5 ml 裂解液； （3）在冰上进行 10 min,间隔为 2 秒钟的超声波破壁,直到沉 淀变得澄清为止； 11 （4）于 4，12000 rpm，离心 10 min，取上清，得到 AK 的 粗提液。 3.5 蛋白质的检测 测定 AK 的活性7： 新鲜配制测活底物，保存于 4取 5 l 上清加入装有 1mlAK 底物塑料比色皿迅速混匀，通过紫外分光光度法测 A5

24、75下降值 SDS-PAGE 电泳8.9： （1）安装双垂直板电泳槽； （2）配 12%的分离胶 15ml，浓缩胶 5ml； （3) 制样：取样品 10 1 加样品缓冲液以 401 混合，100加热 5 min ， 15000g，4离心 1 min； （4）上样：用微量注射器加样 15-20 1）电泳：在凝胶上加 80V/cm 电压，待染料进入分离胶后将电压提高到 140V/cm 继续电泳直到染料到达底部； （5）电泳：在凝胶上加 80 V/cm 电压，待染料进入分离胶后将电 压提高到 140 V/cm 继续电泳直到染料到达底部； （6）固定和染色：用考马斯亮蓝 R-250 染色液浸泡，加热几

25、分 钟； （7）脱色：半小时更换一次脱色液，处理 3-5 次，直到胶板呈现 淡蓝色。 3.6 蛋白质的纯化 （1）CMC 阳离子交换层析 平衡平衡：3 倍柱床体积 Buffer A（pH=8.0）平衡 12 上样上样：插 A280滤光片，调 A 值、T 值；打开采集器；打开电脑 蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。将粗提液 60ml 上 柱，流速约为 1.4ml/min 洗脱洗脱：Buffer A (pH=8.0)洗柱，同时在 280nm 处进行连续紫外检 测，收集洗脱峰 （2）S-100 凝胶过滤层析 平衡平衡：3 倍柱床体积 Buffer B 透析平衡 上样上样：待插 A280滤光片，

26、调 A 值、T 值；打开采集器；打开电 脑蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。稳定后将过 CMC 的洗脱液 120 mL 浓缩到 50 mL 上柱，流速约 1 ml/min。 洗脱洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱，同时在 280 nm 处进行连续紫外检 测，根据电脑监测波峰收集蛋白并留样测活、电泳。 （3）Q-Sepharose 阴离子交换层析 平衡平衡：3 倍柱床体积 Buffer B 透析平衡 上样上样：待插 A280滤光片，调 A 值、T 值；打开采集器；打开电脑 蛋白核酸检测系统，保存文档并按开始采集。稳定后将经过 S- 100 处理的蛋白上柱，流速约 1 ml/min

27、。 洗脱洗脱：Buffer B (pH=8.0)洗柱将 Buffer B 溶液和 1mol/L NaCl 的 Buffer B 溶液各 300mL 于梯度混合仪的两容器中逐步混合由低浓 度到高浓度进行洗脱蛋白。流速 0.98mL/min 同时在 280nm 处进 行连续紫外检测，设定每根收集试管收集流出蛋白时间，根据微 电脑记录仪显示曲线，分别收集峰值的洗脱液根据波峰对每管收 集蛋白测活并留样、电泳检测纯化程度。 13 4 结果与分析 4.1 AK 诱导表达电泳图 诱导后表达的蛋白经检测具有精氨酸激酶活性，并且由图可 知，对应分子量 43KD 处有一条表达量相对较高的蛋白带，这与 精氨酸激酶的

28、分子量比较吻合，初步推断其为 AK。 97.4 66.2 43 31 20.1 14.4 1 2 MW (KD) 1-1 AK 经过经过 CMC 离子交换层析图和诱导表达电泳图离子交换层析图和诱导表达电泳图 1、上清 2、标准蛋白质 14 4.2 蛋白质经 CMC 离子交换的层析谱图和电泳图 4.2.1 如图 1-1 所示。由于 CMC 是阳离子交换树脂，而精氨酸 （AK）在 Buffer A（pH=8.0）下带负电荷，所以不被吸附在其上； 带正电荷的杂蛋白会被吸附，因此可以我们得到的是一个主要由 带负电荷形成的单一的峰。 图图 2-1.2-1. AKAK 经经 CMCCMC 离子交换后的层析

29、谱图离子交换后的层析谱图 15 4.2.2 将由 CMC 纯化后的蛋白溶液收集，经 SDS-PAGE 电泳检 测得到如 1-2 图所示结果。由图可知，部分在 pH=8.0 条件下带负 电荷的杂蛋白被分离除掉。 . 1 2 3 图图 2-2. SDS-PAGE 图谱图谱 1、过 CMC 2、上清 3、标准蛋白质 97.4KD 66.2KD 43KD 31KD 20.1KD 14.4KD AK 16 4.3 蛋白质经分子筛 S-100 交换的层析谱图和电泳图 4.3.1 将经 CMC 纯化后的蛋白溶液经浓缩，上样到分子筛 S-100 进一步分离纯化，得到几个洗脱峰，如图 3-1。分步收集每个峰 的

30、蛋白溶液进行活性检测，发现第一个峰含精氨酸激酶。通过上 面的电泳图可以发现在 AK 附近存在比其分子量大的杂蛋白，由 于分子筛本身的分离效率，分离时的流速等因素的影响，导致在 主峰之中出现了杂蛋白峰。 4.3.2 另外通过 SDS-PAGE 电泳，如图 3-2，确定较高纯度的精 氨酸激酶来并管，用于进一步纯化操作。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 图图 3-1 S-100 凝胶层析谱图层凝胶层析谱图层 AK 峰峰 17 3-2 纯度较高各管纯度较高各管 SDS-PAGESDS-PAGE 图谱图谱 17 以及 9 道是经 S-洗脱收集的有纯度较高的管；8、标准蛋白 4.4 蛋白质经 Qsep

31、harose 阳离子交换的层析谱图和电 泳图 4.4.1 将合并后的含 AK 蛋白溶液经 Qsepharose 纯化后得到如 图 ，由于不同的蛋白在 pH=8.0 的 BufferB 缓冲液中所带电荷不 同，与树脂的结合能力有差别，所以用盐进行洗脱时梯度时，会 出现连续几个峰，所示结果。活性检测显示第一个洗脱主峰含 AK。由峰形可知纯化效果较好，由于有杂蛋白具有与 AK 相近的 电荷特性，从而导致一个与 AK 主峰部分重叠的杂峰出现。 如图如图 4-1. AK 经经 Q-sepharose 离子交换后的层析谱图离子交换后的层析谱图 18 4.4.2 将主峰处的蛋白分布收集的各管测活后，分别通过

32、 SDS- PAGE 电泳检测得到图 4-2。 由图可知，AK 达到了度，经检测 其具有很高的活性。 97.4 66.2 42.7 31 20.1 14.4 19 图图 4-2 过过 Q-Sepharose 的的 SDS-PAGE 图谱图谱 17 以及 9 道是经 Q-Sepharose 洗脱收集的；8、标准蛋白质 4.5 AK 经各步纯化后的 SDS-PAGE 电泳图谱 如图 5-1 为细胞破碎离心得到的上清溶液以及通过各步纯化后所 得溶液的 SDS-PAGE 电泳图。由该图可知，我们经过的纯化策略 达到了比较理想的效果。 1 2 3 4 5 6 20 如图如图 5-15-1，AKAK 经各

33、步纯化后的经各步纯化后的 SDS-PAGESDS-PAGE 图谱图谱 1、标准蛋白 2、上清 3、盐析 4、经过 CMC 处理的蛋白质 5、经过 S-100 处理的蛋白质 6、 Q-Sepharose 5 讨论 （1）由于精氨酸激酶基因的菌种是保存甘油中，我们在进行接 种扩大培养到含卡纳霉素的 LB 培养基锥形瓶中，首先要把原菌 液接种到含 LB 培养基的小试管中进行活化 812 小时。由于不 同的菌种的生长情况有差异，在加 IPTG 值的要求不同。根据参 考文献得出，诱导 AK 基因表达最适宜的 OD600值为 0.60.8 ， 另外，我们通过实验得出，IPTG 诱导时间为 3 小时。IPT

34、G 终浓 度，为 0.2 mM （2）由于诱导 AK 表达的 IPTG 的浓度较低，小于 1 mM 的情况 下，不易产生包涵体，因此，我们在后面的破壁、离心、分别取 上清和沉淀，分别用测活和电泳检测，发现沉淀中几乎没有 AK。 21 （3）根据参考文献得出，精氨酸激酶活性可以通过测定在 575nm 处精氨酸激酶 1min 内的下降值。所用底物主要包括 Arginine，Mg(AC)2。观察精氨酸激酶的热力失活曲线知道精氨酸 激酶在 30 活性最高，另外 pH 值的变化对精氨酸激酶的活性影 响很大，当 pH 等于 8.2 时活性最强。测活时底物的要放在 25 下保温一段时间，最适 pH 值为 8

35、.2。 （4）将粗提的蛋白首先通过 CMC 阳离子交换层析，将带正电荷 的杂蛋白挂于柱子，精氨酸激酶和其它蛋白洗脱出来，由于 CMC 阳离子交换层析有稀释作用，以及分子筛对上样体积的要求（柱 床体积的 515%） ，所以需要浓缩洗脱液，然后通过 S-100 凝 胶过滤层析，再经过 Q-Sepharose 阴离子交换层析进行进一步纯 化，精氨酸激酶能结合于柱子，但是却能挂上大量的杂蛋白，然 后用 1 mol/L 的 NaCl 进行梯度洗脱分部收集得到较纯的精氨酸激 酶，由公式计算得 NaCl 浓度为 0.23M 时，AK 蛋白开始洗脱下来。 在这个过程中都要进行测活以及电泳图谱来确定精氨酸激酶的

36、活 性和纯度。 （5）由电泳图谱可看出经过于 S-100 凝胶过滤层析分离纯化的效 果不是很明显，主要原因是精氨酸激酶（40 KD）附近有许多杂 蛋白的电泳带，而 SephacrylTM10 的分离范围是 103105。这 个范围较大，难于把杂蛋白分开。 （6）要有好的分离效果要注意层析柱的高度和体积；上样量的 大小；洗脱梯度的形状和洗脱体积；洗脱速度；分级物的收集量。 22 参考文献： 1 France R M, Sellers D S and Grossman S H. Purification characterization and hydrodynamic properties of

37、 arginine kinase from gulf shimp (Penaeus aztecus). Arch Biochem Biophys, 1997, 345(1): 73-78 2 Zhou G, somasundaram T,blanc E,et al.Transition state structure of arginine kinase:implications for catalysis of bimolecular reaction .Proo Natl Acad sci USA,1998,95(15):357-359 3 Tsou C L. Configurationa

38、l flexibility of enzyme active sites. Science, 1993, 262(5132): 380-381 4潘继承 精氨酸激酶的折叠及其部分结构的研究 博士学位论文 北京：清 华大学 F2004(4):1-2 5 美J.萨姆不鲁克 D.W.拉萨尔 分子克隆 科学出版社 上册 15 章 （12171259） 。 6France,Richard Morris ,PhD Purification and phicical characterization of arginine kinase from Penaeus aztecus: Evidence for

39、a molten globule folding intermediate. Univercity of South Florida,1994(1) 7Yu Z,Pan J and Zhou H.M A direct continuous pHspectrophotometric assay for arginine kinase activity. Protein and peptide letters,2002.9 (6) 545-552, 8 陆健 等 蛋白质纯化技术及应用 化学工业出版社 第一版 2005：22-24. 9汪家政，范明 .蛋白质技术手册.科学出版社.2005：77110