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1、编编 号号 本本科科生生毕毕业业设设计计（ 论论文文 ） 题目：题目： 胆固醇对磷脂脂质体膜性质的影 响 食品 学院 食品科学及工程 专业 学 号 学生姓名 指导教师 II 二一二年六月 摘要 I 摘摘 要要 脂质体作为一种有效成分的载体，能够起到靶向定位，缓释有效成分，降低毒性的 作用，在国内已经成功应用于冬虫夏草，人参皂苷等中药制剂的生产，国外也使用脂质 体保持食品中某些特殊营养成分的活性1。但由于其原料磷脂，化学性质活泼，常温 下暴露在空气中就容易被氧化变质。人们发现在脂质体中加入一定比例的胆固醇溶液能 够起到稳定脂质体化学性质，改善脂质体分子结构，使脂质体被氧化速率显著降低，同 时能够
2、改善脂质体膜的通透性以及流动性2。 在本研究中，以大豆磷脂为原料研究胆固醇-脂质体混合体系的性质。通过对脂质体 体系粒径的测定，发现此混合体系的粒径先随胆固醇浓度升高而升高，之后随胆固醇浓 度升高而降低。采用TBA（硫代巴比妥酸）法，测定混合体系的被氧化程度，发现添加 了胆固醇的脂质体溶液被氧化速率明显降低，同时胆固醇浓度在15%以上时，被氧化速率 并没有明显差异。利用荧光探针法对混合体系的微极性（I1/I3）进行研究，发现此混合体 系的微极性随着胆固醇浓度的增加而减少。采用差示扫描量热法测定了脂质体的相变温 度，发现脂质体的相变温度随胆固醇浓度的上升呈先减小后增大的趋势。采用DPH为荧 光探
3、针测量此混合体系的荧光偏振度（P值），发现P值随着胆固醇浓度的增加而减小， 证明脂质体膜的流动性和通透性随之增强。通过一系列的实验确定胆固醇的最适浓度为 15%-20%。 关键词：关键词：脂质体；胆固醇；最适浓度；粒径；微极性 Abstract II ABSTRACT Liposome as a carrier of active ingredients,can be used for can targeted positioning, sustained release of active ingredients, reduce the toxic effects.It has been s
4、uccessfully used in traditional Chinese medicine preparations of Cordyceps sinensis, ginsenoside production in the domestic.In foreigh liposome is used for maintain the activity of particular nutrients in the food.However, due to its raw materials - phospholipids,has an very active chemically featur
5、e,it can be easily oxidized.It is found that adding a certain percentage of cholesterol in the liposome solution can stabileze the chemical nature of liposome and improve the molecular structure and the liposome oxidation rate was significantly lower.The mobility of the membrane is also improved. In
6、 this study,we use soybean lecithin as raw material to study the nature of the mix system of cholestrol and liposome. By determination of the liposome particle size, particle size of this mixed system first with the cholesterol concentration increased after lower cholesterol concentration. We use th
7、e method of TBA (thiobarbituric acid) to detemine the the degree of oxidation,we found that the oxidation rate is obiviously decreased with the addition of cholestrol,but when the concentration of cholestrol is higher than 15%,the further addition wont help to decrease the oxiation rate any more.The
8、 use of fluorescent probes is used to study micropolar,it is found that the micro-polarity of the mixed system decrease with increasing cholesterol concentration.Using differential scanning calorimetry method for the determination of the lipid phase transition temperature and found that the lipid ph
9、ase transition temperature showed a trend of decreases and then increases with the rise of cholesterol levels.Fluorescence polarization using DPH as a fluorescence probe measurements of this mixed system (P value), and P values with the increase of cholesterol concentration reduced to prove that the
10、 liposome membrane fluidity and permeability increase as well.In the end,we determine the the optimal concentration of cholestrol is between 15% and 20%. Keywords：Liposome; cholestrol; optimal concentration; particle size; micro-polarity 目录 i i 目目 录录 摘 要I ABSTRACT .II 目 录I 第 1 章 绪论.1 1.1 引言.1 1.2 卵磷
11、脂.1 1.3 脂质体及脂质体的制备.2 1.4 胆固醇.3 1.5 胆固醇对于脂质体的影响.3 1.6 胆固醇影响脂质体膜性质的原理.4 1.7 胆固醇脂质体混合体系的研究.4 1.7.1 TBA（硫代巴比妥酸）法.4 1.7.2 DSC（差示扫描热量仪）测定相变温度.4 1.7.3 脂质体的粒径与纳米粒径仪5 1.7.4 荧光分析技术6 1.8 国内外研究进展.7 1.9 本研究的主要内容与意义.8 1.9.1 立题背景与意义8 1.9.2 本课题研究的主要内容8 第 2 章 实验材料与方法.9 2.1 实验材料与主要仪器.9 2.1.1 试剂9 2.1.2 实验仪器设备.9 2.2 实验
12、方法.9 2.2.1 胆固醇溶液制备9 2.2.2 脂质体悬浮液制备9 2.2.3 脂质体颗粒粒径的测定.10 2.2.4 脂质体溶液 TBA 值的测定.10 2.2.5 差示扫描热量仪（DSC）测定脂质体相变温度10 2.2.6 膜微极性的测定.10 2.2.7 膜流动性测定.11 第 3 章 实验结果与讨论.12 3.1 超声处理对脂质体粒径的影响12 目录 ii 3.2 胆固醇添加量对脂质体粒径的影响12 3.3 胆固醇添加量对膜相变温度的影响13 3.4 胆固醇添加量对脂质体氧化稳定性的影响14 3.5 胆固醇添加量对脂质体膜微极性的影响15 3.6 胆固醇添加量对脂质体膜流动性的影响
13、16 第 4 章 结论与展望.17 4.1 结论17 4.2 不足之处及未来展望17 参考文献.18 致 谢.20 胆固醇对磷脂脂质体膜性质的影响 1 1 第第 1 章章 绪论绪论 1.1 引言引言 脂质体是一种由脂质构成的双分子封闭小囊，具有类似生物膜活性，可以包入各种 各样的功能成分。脂质体在人体内可以起到将功能成分缓慢释放的作用，拉长功能成分 在人体内的停留时间，使功能成分得到充分完全的利用，同时降低毒副作用1。但由于脂 质体本身易被氧化变质，本身不够稳定。近年来，学者们发现在脂质体溶液中加入一定 量的胆固醇，可以明显提高脂质体的抗氧化能力，同时是脂质体的分子结构更加趋向于 稳定，延长脂
14、质体的保质期，但添加何种比率的胆固醇才能使脂质体获得最稳定的分子 结构，最大效率的延长保质期，目前仍没有定论，因此本文将从这方面进行进一步的研 究。 磷脂脂质体作为较常见的脂质体之一，具有原料易于获取，脂质体制备操作简单等 特点，因此本实验采用磷脂脂质体为主要的研究对象。 本文主要的研究目的制备以胆固醇为调节剂的卵磷脂脂质体；测定不同贮藏天数的 脂质体的TBA变化，以确定胆固醇的添加量对于脂质体氧化稳定性的影响，使用纳米粒 径仪测定脂质体的粒径；采用DSC（差示扫描热量仪）测定脂质体的相变温度；利用芘为 荧光探针法进行脂质体的微极性研究；测定以DPH为荧光探针的不同比例胆固醇的脂质 体的荧光光
15、谱，从而研究脂质体的膜的流动性。 1.2 卵磷脂卵磷脂 卵磷脂为两性化合物，磷脂的极性、电荷、饱和状态会影响胶束的增溶作用。囊泡 是一种球形或椭圆形的单室或多室封闭双层结构的有序组织聚集体。1967年英国学者 Bangham等发现磷脂分散在水中可以形成多层囊泡，并且证明每层囊泡均为双分子层脂质 膜且被水相隔开3。由天然磷脂分子定向排列形成的双层膜包裹的闭合结构的囊泡，也称 为脂质体。 常态下，纯净的卵磷脂为淡黄色的透明或半透明的黏稠状物质，具有清淡柔和的香 味，其等电点pH值是6.7，熔点160。卵磷脂在水中通常呈现胶体状态。不同的卵磷脂在 有机溶剂中溶解度不同：卵磷脂在氯仿中的溶解性极强，在
16、乙醚、乙醇等有机溶剂中也 能很好的溶解，但不溶于丙酮，故可用有机溶剂来提取分离卵磷脂，其结构见图1-1 图 1-1 磷脂结构图 江南大学学士学位论文 2 1.3 脂质体及脂质体的制备脂质体及脂质体的制备 脂质体是一种定向药物载体，属于靶向给药系统的一种新剂型。它可以将药物粉末 或溶液包埋在直径为纳米级的微粒中，这种微粒具有类细胞结构，进入人体内主要 被网 状内皮系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主 要在肝、脾、肺和骨髓等组织器官中积蓄，从而提高药物的治疗指数，减少药物的治疗 剂量和降低药物的毒性45。 按结构和粒径，脂质体可分为单室脂质体、多室脂质体、含有表面
17、活性剂的脂质体。 按性能，脂质体可分为一般脂质体（包括上述单室脂质体、多室脂质体和多 相脂质体等） 、特殊性能脂质体、热敏脂质体、PH敏感脂质体、超声波敏感脂质体、光敏脂质体和磁 性脂质体等。按照荷电性，脂质体可分为中性脂质体、负电性脂质体、正电性脂质体。 如图1-2 图 1-2 脂质体结构示意图 脂质体的制备大致可以分为：手摇法、超声法、冻干再水化法、逆向蒸发法、表面 活性剂去除法、高压均质法。 本次实验采用的是手摇法及超声法6。 手摇法：磷脂及一定比例的胆固醇溶于氯仿/甲醇溶液中，置于圆底烧瓶中用旋转蒸 发仪蒸干有机溶剂后，倒入水相（如磷酸缓冲液），通过适当的搅拌、震荡后形成脂质 体溶液。
18、 超声法：经过手摇法制得的脂质体溶液放入超声波发生器中进行超声，经过这种方 法的得到的脂质体溶液会有更小的粒径（通常能小于100nm）。 冻干再水化法：经手摇法制得的脂质体通过冷冻干燥机升华所有水分，加入水相， 平衡分散体系，即得此法所得脂质体。 逆向蒸发法：用手摇法制得的脂质体重新溶于有机溶剂中，加入包埋物质，超声后， 减压蒸发得水性悬浮液，利用离心、色谱、透析等方法出去未包埋的成分后，即得此法 胆固醇对磷脂脂质体膜性质的影响 3 3 所制脂质体。 表面活性剂去除法：经手摇法制得的脂质体溶液中加入浓的表面活性剂，蒸干有机 溶剂，再通过透析等途径出去表面活性剂后即得此法所制的脂质体溶液。 高压
19、均质法：手摇法制得的脂质体溶液通过高压均质机后即得此法所制脂质体。 1.4 胆固醇胆固醇 胆固醇又称胆甾醇。一种环戊烷多氢菲的衍生物。早在18世纪人们已从胆石中发现 了胆固醇，1816年化学家本歇尔将这种具脂类性质的物质命名为胆固醇。胆固醇广泛存 在于动物体内，尤以脑及神经组织中最为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。 其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所 不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激 素的原料2。 如图1.3所示。 胆固醇是从脂肪不能皂化的部分分离而得到的一种二级醇，分子式为C27H45O，分 子
20、量为386.64，其中C：83.87%，H：11.99%，O：4.14%，由一个刚性的环状结构、一 个短的烷基链分支和一个羟基构成。胆固醇中的绝大部分都是疏水结构，但有一个极性 的羟基存在，所以胆固醇也是一个既亲水有亲油的分子。 最近的研究表明，在卵磷脂脂质体中添加一定量的胆固醇中，卵磷脂脂质体会出现 一系列的理化变化，使脂质体能够更加符合人们的需要，但是究竟添加多少胆固醇能够 使脂质体表现出最符合人们需求的形态，目前尚没有定论。 图 1-3 胆固醇结构图 1.5 胆固醇对于脂质体的影响胆固醇对于脂质体的影响 胆固醇具有双亲性，既亲水又亲油，起表面活性剂作用，不仅能提高脂质体的稳定 性，而且能
21、与磷脂能良好相容，能够调节脂质体膜膜脂的流动性和影响磨得通透性。混 合膜的过剩面积和动力学结果表明，胆固醇和卵磷脂是相互吸引的，即胆固醇的加入使 卵磷脂囊泡更不容易被表面活性剂破坏。实验结果表明，囊泡中的蛋白质、胆固醇和卵 磷脂分子之间是相互吸引的。相对于卵磷脂囊泡，混合体系囊泡更加稳定。胆固醇作为 表面活性剂使油包水乳液能稳定形成，胆固醇嵌入脂质体膜使得脂质体颗粒膨大，内水 相也将相应增大，但当胆固醇比例过大时，组成的脂质体的磷脂的量太少，一方面脂质 体微囊膜形成困难，另一方面所形成的脂质体膜也会变得不牢固，过高胆固醇使得脂质 江南大学学士学位论文 4 体膜亲水性太强，膜容易破坏，其中包含物
22、将很容易渗漏出来2。 图1-4 脂质体的形成 1.6 胆固醇影响脂质体膜性质的原理胆固醇影响脂质体膜性质的原理 胆固醇的一端是亲水的羟基，另一端是甾醇环和疏水环基链，是一种两亲分子。其 本身是构成脂质体的重要组成。在脂质体中，胆固醇镶嵌于磷脂分子之间，胆固醇的羟 基端与磷脂的头基相结合，另一端插入双分子层疏水烷基链中。胆固醇与磷脂双分子层 的作用分为两种：一种为羟基与磷脂头基间的氢键作用，另一种为甾醇环烷基链结构在 磷脂疏水链之间的填充作用7。适量的胆固醇可以增加磷脂脂质体膜的刚性，增加其稳定 性，但过量的胆固醇会使双分子层超过可容纳的限度，造成双分子层的破坏，使磷脂脂 质体失去稳定的结构，最
23、终导致破裂。 1.7 胆固醇胆固醇脂质体混合体系的研究脂质体混合体系的研究 目前对于胆固醇脂质体混合体系的研究，一般采用研究其特征参数（脂质体粒径， 脂质体微极性，脂质体膜流动性等）的方法，本次研究将针对脂质体在加入了胆固醇之 后的抗氧化能力以及其他各种理化指标的变化，以达到得出胆固醇最适添加量的目的。 1.7.1 TBA（硫代巴比妥酸）法（硫代巴比妥酸）法 TBA法的原理是脂质过氧化的降解产物之一一丙二醛(MDA)，可以与硫代巴比妥酸 成色。在520nm处进行比色测定，可检测丙二醛相对含量的变化，以了 解生物膜质过氧 化的情况。 TBA法是一非常简便的方法，一般实验室均可进行。此法与荧光法、
24、化学发 光法等有较好的相关性，但不足之处是灵敏度较差，某些因素应加以控制，如线粒体污 染，样品中的铁离子等8。 经过TBA法处理过的磷脂脂质体样品一般呈粉红色，被氧化程度越高，丙二醛的含 量越高，颜色越升，于分光光度仪上所测得的吸光值也就越深。 1.7.2 DSC（差示扫描热量仪）测定相变温度（差示扫描热量仪）测定相变温度 1）脂质体相变温度的定义 脂质体膜双分子层由排列整齐且致密的胶晶态变为疏松混乱的液晶态，这一转变我们 即称之为脂质体的相变温度。 2）DSC（差示扫描热量仪） 胆固醇对磷脂脂质体膜性质的影响 5 5 差示扫描热量仪（differential scanning calorim
25、etry）是一类在严格控制程序温度下，测 量输入（或取出）试样和参比物的平衡热量差仪器。 通过对样品的变温热分析状况，可以检测出脂质体的相变温度时的热量释放情况。 相变温度对于热敏感脂质体来说是相当重要的一个参数，直接关系到脂质体的稳定 性。当脂质体处于“液晶”态时，膜的横切面增大，双分子层厚度减少，膜流动性增加， 从而使被包裹在脂质体内的药物透膜速度增加，使脂质体不稳定，因此较高的相变温度 有利于维持脂质体的稳定9。 而某些热敏脂质体正是利用了其对温度敏感的特征。这一类脂质体的相变温度通常 略高于37摄氏度。当处于常温时，这一类脂质体处于胶晶态，结构稳定能够很好的达到 保存药物的功能，而当被
26、服用了之后，到达了温度较高的靶向部位时，由于温度超过了 脂质体的相变温度，脂质体相变为液晶态，此时就将其包埋的有效成分释放出来，成功 的作用于靶向部位。 图1.5 差示扫描热量仪工作原理图 1.7.3 脂质体的粒径与纳米粒径仪脂质体的粒径与纳米粒径仪 粒径是脂质体形态学中很重要得一项指标，粒径大小直接影响到了脂质体的各方面 的性质。特别在作为抗癌药物的载体时，脂质体的粒径直接影响了药物的靶向性，释放 速率及治疗效果。一般认为，粒径较小的脂质体更为稳定9。在生产实验过程中，一般可 以采用超声等手段减小脂质体的粒径。 不同的包埋物对于磷脂脂质体的粒径要求也不同，如：当药物为口服药时，粒径较 小的脂
27、质体更能够促进药物有效成分的吸收，因此要求粒径更小的脂质体。 通过超声、均质均可以减小磷脂脂质体的粒径。一般情况下，再添加了适量的胆固 醇后磷脂脂质体的粒径会增大，但胆固醇浓度过大时，会造成磷脂脂质体粒径的急剧减 小。此内容详见第二章。 纳米粒度仪是用物理的方法测试固体颗粒的大小和分布的一种仪器，采用数字相关 器的纳米激光粒度仪，其采用高速数字相关器和高性能光电倍增管作为核心器件，具有 操作简便、测试快捷、高分辨、高重复及测试准确等特点，是纳米颗粒粒度测试的首选 产品。 江南大学学士学位论文 6 图 1.6 纳米粒度仪原理图 1.7.4 荧光分析技术荧光分析技术 荧光分析是指利用某些物质在紫外
28、光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定 性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测 量则始于本世纪60年代10。荧光定量分析常采用直接比较法，将试样与已知物质同时放 在紫外光源下，根据它们所发荧光的性质、颜色和强度，鉴定它们是否含有同一荧光物 质。某些物质在加入某种试剂后，其产物会产生荧光，也可采用同样方法鉴定。最常用 的方法是用荧光分光光度计绘制试样的荧光激发光谱和荧光发射光谱，并与已知物质的 这两种光谱进行比较，从而鉴定所含成分11。 膜类物质并不产生荧光，因此，人们通常用一些能自发进入膜中非极性链区域的荧 光团去标记它们。其中
29、，使用最普遍的就是1，6一二苯基一1，3，5一己三烯(DPH)，由 于其在水中的低溶解和低发射性质，DPH只有存在于膜结构中才能发出荧光。DPH及其 衍生物广泛应用于研究膜流动性等10。 本次研究中采用了芘和DPH作为荧光探针分别测定磷脂脂质体膜的微极性和流动性。 芘：有机化合物，淡黄色单斜晶体（纯品为无色），具有芳香，可燃，不溶于水， 易溶于乙醇、乙醚。可进行亲电取代，如卤化、硝化、磺化等反应。芘主要存在于煤焦 油沥青的蒸馏物中。芘为有机合成原料，经氧化可制取1,4,5,8-萘四甲酸，用于染料、合 成树脂、分散性染料和工程塑料；酰化后可制还原染料艳橙GR及其他多种染料。还可制 杀虫剂、增塑剂
30、等。 DPH：黄色片状结晶。溶于热丙酮，微溶于苯、氯仿和冷丙酮，不溶于水、乙醇 和乙醚等。熔点200203。有刺激性。 胆固醇对磷脂脂质体膜性质的影响 7 7 图 1-7 发光机理 图 1-8 典型的荧光物质结构 1.8 国内外研究进展国内外研究进展 脂质体最初是由英国学者Bangham和Standish将磷脂分散在水中进行电镜观察时发现 的。磷脂分散在水中自然形成多层囊泡，每层均为脂质的双分子层；囊泡中央和各层之 间被水相隔开，双分子层厚度约为4纳米3。后来，将这种具有类似生物膜结构的双分子 小囊称为脂质体。1971年英国莱门等人开始将脂质体用于药物载体1。 D.Bach, E.Wachte
31、l, E.Borochov等人早在上世纪80年代就开始对在磷脂中添加脂质体 进行研究，并初步确定了胆固醇通过嵌入磷脂双分子层中以达到稳定脂质体结构，加强 抗氧化作用的机理。随着电子显微镜技术的成熟，人们能够更清晰的观察到了胆固醇影 响脂质体膜性质的机理12。 由于脂质体的主要作用是作为有效成分，如药物，的载体，使有效成分能够在体内 缓慢释放，提高有效成分作用效率，能与我国的传统中药完美结合。国内学者已于20世 纪80年代陆续开始将我国中草药中的有效成分进行脂质体包埋的研究，如双参脂质体口 服液13、冬虫夏草脂质体口服液14、人参皂苷脂质体1516、黄氏多糖脂质体17、人参多 糖脂质体18、丹参
32、酮前体脂质体19、三七总皂苷脂质体20等已在制备方法和医学性质上 进行了深入的研究。 目前，国外也已将脂质体成功的应用于食品工业，如乳铁传递蛋白脂质体用于食品 的抗菌、卵黄高磷蛋白脂质体用在乳品和干肉中放置脂质氧化、维生素C脂质体用于降低 失活。许多用于治疗癌症、抗真菌的脂质体药物已经被批准用于临床研究458。 胆固醇目前作为脂质体制备中不可缺少的一种成分，已经越来越受到国内外研究学 江南大学学士学位论文 8 者的重视。 1.9 本研究的主要内容与意义本研究的主要内容与意义 1.9.1 立题背景与意义立题背景与意义 脂质体作为一种有效成分的载体，能够起到靶向定位，缓释有效成分，降低毒性的 作用
33、。在脂质体溶液中加入胆固醇可以明显提高脂质体的抗氧化能力，并改变脂质体的 一些其他性质。目前所做的研究大多为如何使有效成分和脂质体相融合，但对于添加多 少胆固醇能够在增加脂质体的抗氧化能力的同时又不影响其包埋有效成分的能力甚至能 增强其靶向定位，降低毒性的能力，现在尚无定论。本研究的目的就是通过实验研究不 同胆固醇浓度的脂质体溶液的性质，以得出胆固醇的最适添加量，从而为脂质体的制备 提供依据，并为下一步植物固醇代替胆固醇，提供参考2122。 1.9.2 本课题研究的主要内容本课题研究的主要内容 1）制备以胆固醇为调节剂的卵磷脂脂质体； 2）测定不同贮藏天数的脂质体的TBA变化，以确定胆固醇的添
34、加量对于脂质体氧化稳定 性的影响； 3）使用纳米粒径仪测定脂质体的粒径； 4）采用DSC（差示扫描热量仪）测定脂质体的相变温度； 5）利用芘为荧光探针法进行脂质体的微极性研究； 6）测定以DPH为荧光探针的不同比例胆固醇的脂质体的荧光光谱，从而研究脂质体的膜 的流动性。 本科生毕业论文（设计）题目 9 9 第第 2 章章 实验材料与方法实验材料与方法 2.1 实验材料与主要仪器实验材料与主要仪器 2.1.1 试剂试剂 试剂名称生产厂家 大豆磷脂（Pc90）江苏曼氏生物科技有限公司 磷酸氢二钠（AR）国药集团化学试剂有限公司 磷酸二氢钠（AR）国药集团化学试剂有限公司 甲醇（AR）国药集团化学试
35、剂有限公司 三氯甲烷（AR）国药集团化学试剂有限公司 无水乙醇（AR）国药集团化学试剂有限公司 胆固醇（AR）国药集团化学试剂有限公司 芘，99.0Aldrich 产品 硫代巴比妥酸国药集团化学试剂有限公司 三氯乙酸国药集团化学试剂有限公司 浓盐酸（AR）国药集团化学试剂有限公司 2.1.2 实验仪器设备实验仪器设备 仪器名称生产厂家 旋转蒸发仪南京予凯仪器设备有限公司 Mettler AL-204 电子精密天平梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司 XMTE-2000 数显恒温水浴锅南京予凯仪器设备有限公司 F-7000 荧光光谱仪日本 Hitach 公司 Zetasizer nano ZS 纳
36、米粒度仪 英国 Malvern 公司 KJ-300 超声波发生器无锡市科洁超声电子设备有限公司 WEZ UV-2010 紫外可见分光光度计尤尼柯（上海）仪器有限公司 SHB-IIIA 循环水式多用真空泵南京予凯仪器设备有限公司 Pyris 1 DSC 美国 Perkin Elmer 公司 78 HW-1 型恒温磁力搅拌器江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司 2.2 实验方法实验方法 2.2.1 胆固醇溶液制备胆固醇溶液制备 称取0.251g胆固醇至于烧杯中，加入100mL氯仿/甲醇（2：1V/V）混合液，用玻璃棒 搅拌至完全溶解后，常温贮于棕色瓶 。 2.2.2 脂质体悬浮液制备脂质体悬浮液制备
37、取0.2 g大豆磷脂置于50mL小烧杯中，按表2-1加入配置好的混合溶液，用玻璃棒加大 豆磷脂充分溶解后，转移至圆底烧瓶中，放入1.0g左右玻璃珠，在45、40r/min的条件下， 接入旋转蒸发仪，蒸发有机溶剂，持续1h，在瓶内壁形成一层薄膜。于旋转蒸发仪上取 下烧瓶后，立即加入50mL磷酸盐缓冲液（10mM，pH7.4），水化脂质薄膜，形成50mL粗 脂质悬浮液。于烧瓶中加入搅拌子后，用磁力搅拌器于600r/min的条件下搅拌30min。搅 拌完成后，叫样品液体转移至50mL小烧杯中，置于超声波发生器中，将样品超声30min， 所得滤液置于暗处放置12 h进行下步操作。 表 2-1 脂质体样
38、品各成分含量 PC:Chol(mol) Chol 溶液 (mL) 氯仿/甲醇（V/V 2：1） 溶液(mL) 江南大学学士学位论文 10 0030 5%228 15%624 25%1020 50%2010 2.2.3 脂质体颗粒粒径的测定脂质体颗粒粒径的测定 采用动态光散射法（DLS）测定脂质体的粒径，测定条件为散射角90， （250.1）时平衡2min，所有的样品做三次平行，数据取自至少两组独立样品的平均 值。 2.2.4 脂质体溶液脂质体溶液 TBA 值的测定值的测定 （1）TBA溶液的配制 准确称取硫代巴比妥酸0.75g，三氯乙酸30g于200mL烧杯中，加入稀盐酸 （0.1mol/L）
39、200mL，于沸水浴中加热使完全溶解。 （2）TBA测定步骤 1）于试管中准确添加1mL样品溶液，5mL上述TBA溶液，摇匀后沸水浴30min。 2）沸水浴中取出后，稍冷却，倒入离心管，配平后，于5000r/min离心机中离心 10min。 3）去离心后上清液于532nm波长下，以TBA溶液为空白参照，测定其吸光值。 4）重复上述步骤3次，作为平行参比。 2.2.5 差示扫描热量仪（差示扫描热量仪（DSC）测定脂质体相变温度）测定脂质体相变温度 按顺序依次打开氮气、冷源、控制器、DSC主机以及软件程序，预热至少15min。分 别在参比池和样品池中加入适量体积的去离子水和待测样品，称量时保证两端
40、池子与样 品质量总和相等。设置温度范围为20-70，温度梯度为5/min。所有的样品做三次平行， 数据取自至少两组独立样品的。 2.2.6 膜微极性的测定膜微极性的测定 芘对其周围的微环境较敏感，广泛用来检测聚合物形成的胶束等的微环境。芘溶液 的荧光发射光谱有5个特征峰，分别在372，379，384，394，480 nm附近。芘的第一发射 峰与第三发射峰强度比值I1/I3 (在372 nm处荧光强度与在384 nm处的比值) 会随着溶液极 性的减小而下降。因此，I1/I3常用来表征其所处环境极性的大小，该值越大表明芘探针所 处微环境的极性越大；反之，若I1/I3越小则表明花探针所处微环境的极性
41、越小22。制备 10-4mol/mL的芘的甲醇溶液，取0.5mL芘溶液于三角瓶中，氮气吹干，加入40mL所制备 的粗脂质体乳状液，控制温度40超声1 h。 本科生毕业论文（设计）题目 1111 图 2-1 芘的结构 2.2.7 膜流动性测定膜流动性测定 用磷酸盐缓冲液配制210-6的DPH溶液，取0.5mL DPH溶液加入到5mL稀释5倍的脂 质体溶液中，平衡12h，用荧光光谱仪测定分别测激发与发射偏振器平行和垂直时的荧光 强度，Ex=360nm，Em=430nm，激发电压700v，激发和发射狭缝都为5nm。按公式 P= = FGF / F+ GF计算偏振度，其中代表两个偏振器设定方向平行，代
42、表 两个偏振器设定方向相反，G为光栅校正因子。 图2-2 DPH结构图 江南大学学士学位论文 12 第第 3 章章 实验结果与讨论实验结果与讨论 3.1 超声处理对脂质体粒径的影响超声处理对脂质体粒径的影响 粒径作为脂质体的一项重要物理指标，影响着脂质体的各方面性质。一般认为，粒 径较小的脂质体化学性质更为稳定，粒径较大的脂质体可以包埋更多的有效物质。我们 将未添加胆固醇的脂质体进行超声处理，将测出的粒径与未超声的脂质体粒径相比较， 其结果如图3-1。 0 2 4 6 8 0.1110100100010000 Intensity (%) Size (r.nm) Size Distributio
43、n by Intensity Record 27: 声 声 声 声Record 29: 声 声 声 声 声 图 3-1 粒径分布图 从图3-1中，我们可以看出，经过超声的脂质体，其粒径不但有所减小，而且分布更 为集中，未经过超声的脂质体，粒径分散较广，粒径较大。说明超声对于脂质体可以起 到减小粒径，使粒径分布更为集中的作用。图中的脂质体于粒径1000nm以上时都有分布， 应为大分子物质聚集，可采用过滤去除。 3.2 胆固醇添加量对脂质体粒径的影响胆固醇添加量对脂质体粒径的影响 粒径是脂质体形态学中很重要得一项指标，粒径大小直接影响到了脂质体的各方面 的性质。对脂质体进行超声目的是为了调整脂质体
44、的粒径，使粒径分布在比较小的范围 内，使其粒径满足我们最终的要求（注射，口服，靶相位置等）。小粒径的脂质体稳定 性较好，但由于体积的减小，其能包埋的有效成分也会减少，因此我们需要找到粒径适 中，既能满足包埋有效成分的需要，同时又能有较高稳定性的脂质体。我们同时对不同 胆固醇浓度的脂质体进行了超声处理，测出的粒径与未超声的脂质体粒径相比较，其结 果如图3-2。 本科生毕业论文（设计）题目 1313 图 3-2 不同胆固醇浓度脂质体的粒径曲线图 如图3-2，我们可以明显的看出，超声之后的脂质体粒径有大幅度的减小。同时，我 们明显的发现随着胆固醇加入量的增加，脂质体的粒径呈现出先增大然后急剧减小的现
45、 象。这是由于胆固醇镶嵌于脂质体中，使脂质体的结构发生变化。胆固醇镶嵌在双分子 层中，增加了膜的刚性，加强了稳定性同时也增大了粒径，然而当胆固醇的添加量超过 了双分子层的可容纳限度后，会造成膜结构的破坏，使脂质体失去稳定的结构，破裂成 许多新结构的物质，此物质的尺寸较原脂质体小。因此我们可以观察到，随着胆固醇浓 度的增加，脂质体的粒径呈现出先增大然后急剧减小的过程。 图 3-3 胆固醇嵌入脂质体示意图 我们将经过超声处理的脂质体于常温下避光保存于小烧杯中，测量其粒径与保存天 数的关系，其结果如表3-1。 表 3-1 超声情况下脂质体粒径随胆固醇及天数的变化量 胆固醇浓度 05%15%25%50
46、% 第 1 天 107.2118.3162.1187.363.2 第 2 天 103.1114.4149.7215.066.7 第 6 天 99.7138.3175.1256.178.2 由表3-1我们可以看出，经过超声处理的脂质体粒径较小，大约在100到200nm之间， 较小的粒径保证了脂质体结构的稳定性。脂质体的粒径随着保存天数的增加有增大的趋 势，这可能由两方面原因造成，首先保存天数的增加，使胆固醇于脂质体双分子层有更 多的时间相互反应，使更多的胆固醇能够进入双分子层中，造成了脂质体粒径的增大： 其次，长时间的静置使溶液中的物质聚集，这些聚集物造成了测量中平均粒径的增大。 江南大学学士学
47、位论文 14 3.3 胆固醇添加量对膜相变温度的影响胆固醇添加量对膜相变温度的影响 膜一般会有三种形态，胶晶相，液晶相，和液体有序相。相变温度是脂质体由“胶 晶”态转变为“液晶”态时的温度，当脂质体处于“液晶”态时，膜的横切面增大，双 分子层厚度减少，膜流动性增加，从而使被包裹在脂质体内的药物透膜速度增加，使脂 质体不稳定，因此相变温度越高，脂质体越稳定。因此我们采用示差扫描量热法，测量 了不同胆固醇浓度脂质体的相变温度，其结果如图3-4，图3-5所示。 图3-4 不同胆固醇浓度脂质体DSC热分析图 图 3-5 磷脂脂质体相变温度随胆固醇浓度的变化 从图3-4中我们可以发现，当胆固醇浓度在20
48、%以下时，相变温度随着胆固醇浓度的 提高而降低，之后相变温度随着胆固醇浓度的提高而有所提高。胆固醇作为磷脂脂质体 的重要组成部分，他们之间的相互作用分为胆固醇的羟基与磷脂极性头基的作用以及胆 固醇刚性环状结构及相接的碳氢尾链平行穿插在磷脂的碳氢链中。在低浓度的情况下， 胆固醇会倾向于干扰磷脂极性头基间的作用，使双分子层更为松散，降低其相变温度； 而当胆固醇浓度逐步增大时，胆固醇也会逐渐开始倾向于穿插在磷脂碳氢链中，使磷脂 双分子层的结构更为紧密，干扰头基的作用就相对的削弱了，就造成了脂质体相变温度 的升高。 本科生毕业论文（设计）题目 1515 同时我们发现，实验所制备出的磷脂脂质体在15%胆
49、固醇浓度左右时，其相变温度略 高于37摄氏度，此时，脂质体可以较好的达到靶向定位，缓释有效成分，降低毒性的目 的。 3.4 胆固醇添加量对脂质体氧化稳定性的影响胆固醇添加量对脂质体氧化稳定性的影响 TBA（硫代巴比妥酸）法的原理是脂质过氧化的降解产物之一一丙二醛(MDA)，可 以与硫代巴比妥酸成色。在520nm处进行比色测定，可检测丙二醛相对含量的变化，以了 解生物膜质过氧化的情况。磷脂脂质体经过TBA法处理后显粉红色，被氧化程度越深， 丙二醛含量越高，颜色越深，用紫外分光光度仪在520nm处测量出的吸光值也就越高。4 我们将脂质体溶液连续避光培养5天，每天测量其TBA值，结果如图3-6。 图 3-6 经 TBA 法处理后的磷脂脂质体吸光值随培养天数的变化 脂质体在悬浮液中会由于光、氧、金属等因素发生脂质的氧化和水解反应。19卵磷 脂是构成脂质体膜的基本物质，它的化学性质不稳定，易于氧化水解，氧化产物，破坏 脂质体膜的完整性，影响脂质体的包封率，也会增加毒性。因此有时在制备脂质体的过 程中除了添加胆固醇来降低其被氧化速率外，