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1、毕业论文(设计) 题 目浅谈植物细胞的悬浮培养技术姓 名姚虎学号专 业生物工程（070404）指导教师王大红职称讲师 中国武汉二一二年四月目 录摘要3关键词3Abstract3Key words3前言41实验原理42实验器材与材料42.1.实验器材42.2材料42.3试剂53.实验方法54.注意事项55.规模化培养66.存在问题与前景展望66.1.植物细胞的存在优势66.2.植物细胞培养的困难66.3.前景展望67.参考文献78.致谢7植物细胞的悬浮培养技术摘 要由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单
2、细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.本实验介绍最常用的悬浮培养技术.关键词植物细胞；悬浮培养；细胞分裂；细胞学Plant cell suspension culture technologyAbstractBecause plant cells are gathered together for the characteristic, therefore, in postmitotic, often cannot be like bacterial cells as separate, but mostly with cell clusters
3、 form, still cannot cultivate is completely single cell suspensions. To single cell culture or selection of cell clones to yarn, need for plate culture, micro chamber training and nursing culture. In this experiment, only the introduction of the most common suspension culture technologyKey words. Pl
4、ant cells；Suspension culture；Cell division；Cytology前言将游离的植物细胞或小的细胞团置于液体培养其中进行培养和生长的一种技术,称为植物细胞悬浮培养.它是从愈伤组织的液体培养基础上发展起来的一种新的培养技术.50年代起,米尔（Muir）等便对单细胞培养进行了探讨和研究,得到了万寿菊,烟草单细胞和细胞团的悬浮液.1958年斯图尔德等进行了胡萝卜愈伤组织的悬浮培养,并得到了完整的再生植株. 三十多年来,从试管的悬浮培养发展到太空量的发酵罐培养,从不连续培养发展到半连续和连续培养.80年代以来,作为生物技术中的一个组成部分,正在发展成为一门新兴的产业体
5、系.悬浮培养技术为研究植物细胞的生理、生化、遗传和分化的机理提供实验材料,也为利用植物细胞进行次和代谢物的工业生产提供技术基础外,还在育种、快速繁殖、原生质体培养,体细胞杂交以及作为基因转化的受体等方面均得到了广泛地应用. 由于植物细胞具有聚集在一起的特性,因此,在分裂后,往往不能像细菌细胞那样各自分开,而是大多以细胞团的形式存在,至今还不能培养完全是单细胞的悬浮液.要进行单细胞培养或选择细胞无性纱,需要进行平板培养,微室培养和看护培养.本实验介绍最常用的悬浮培养技术.1，实验原理植物离体培养可产生愈伤组织.将疏松型的愈伤组织悬浮在液体培养基中并在振荡条件下培养一段时间后,可形成分散悬浮培养物
6、.良好的悬浮培养物应具备以下特征：（1）主要有单细胞和小细胞团组成；（2）细胞具有量盛的生长和分裂能力,增殖速度快；（3）大多数细胞在形态上应具有分生细胞的特征,它们多呈等径形,核一质比率大,胞质浓厚,无液胞化程度较低.要建成这样的悬浮培养体系,首先需要有良好的起始培养物迅速增殖的疏松型愈伤组织.然后经过培养基成分和培养条件的选择,并经多次断代培养才能达到.悬浮培养细胞经长期继代培养后,染色体常有变异现象,细胞的再生能力也有逐渐降低的趋势,然而对于以上生产有用代谢特质为目的的大量培养,这种再生能力的降低不一定有不良影响.2.实验器材与材料2.1.实验器材 超净工作台、高压灭菌锅、旋转式摇床、水
7、浴锅、倒置显微镜、镊子、酒精灯、三角瓶、移液管、pH计、恒温培养室、不锈钢网、血细胞计数板、漏斗2.2材料松软的烟草或胡萝卜愈伤组织.2.3试剂 2.3.1.附加2%蔗糖,1%甘露醇,500mg/L水解乳蛋白,1.5ml/L,2,4-D的MS培养基,PH调到5.66.2. 2.3.2 .8%三氧化铬（CrO3）.3、实验方法1.用镊子夹取出生长旺盛的松软愈伤组织,放入三角瓶中并轻轻夹碎.每100ml三角瓶含灭过菌MS培养基1015ml,每瓶接种11.5g愈伤组织,以保证最初培养物中有足够量的细胞.2.将已接种的三角置于旋转式摇床上.在100r/min,2528条件下,进行振荡培养.3.经610
8、天培养后,若细胞明显增殖,可向培养瓶中加新鲜培养基10ml,必要时,可用大口移液管将培养物分装成两瓶,继续培养.（若细胞无明显增殖,可能是起始材料不适当,应考虑用旺盛增殖期的愈伤组织重新接种）.可进行第一次继代培养. 4.悬浮培养物的过滤：按“3”法继代培养几代后,培养液中应主要由单细胞和小细胞团（不多于20个细胞）组成.若仍含有效大的细胞团,可用适当孔径的金属网筛过滤,再将过滤后的县浮细胞继续培养. 5.细胞计算.取一定体积的细胞悬液,加入2倍体积的8%的三氧化铬（CrO3）,置700C水浴处理15min.冷却后,用移液管重复吹打细胞悬液,以使细胞充分分散,混匀后,取一滴悬液置入血细胞计数板
9、上计数. 6.制作细胞生长曲线：为了解悬浮培养细胞的生长动态,可用以下方法绘制生长曲线图：（1）鲜重法（fresh weigh method） 在传代培养的不同时间,取一定体积的悬浮细胞培养物,离心收集后,称量细胞的鲜重,以鲜重为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制鲜重增长曲线.（2）干重法（dry weigh method ）可在称量鲜重之后,将细胞进行曲烘干,再称量干重.以干重为纵坐标,培养时间为横坐标,绘制细胞干重生长曲线.上述两种方法均需每隔2天取样一次,共取7次,每个样品重复三次,整个实验进行期间不再往培养瓶中换入新鲜培养液.7. 细胞活力的检查：对于初学者,往往需要检测活细胞的比率.可在
10、培养的不同阶段,吸取一滴细胞悬液,放在载玻片上,滴一滴0.1%的酚藏花红溶液（用培养基 配制）染色,在显微镜下观察.激活细胞均不着色,而死细胞则很快被染成红色.也可用0.1%荧光双醋酸酯溶液染色,凡活细胞将在紫外光诱发下显示蓝绝色荧光,有经验的操作者,则可根据细胞形态,胞质环流判别细胞的死活.8.细胞再生能力的鉴定：为了解悬浮培养细胞是否仍具有再生能力,可将培养细胞转移到琼脂固化的培养基上,使基再形成愈伤组织,进而在分化培养基上,诱导植株的分化。4、注意事项： 1.上述步骤均灭菌操作,培养基、用具、器皿等要高压灭菌后方可使用.2.如培养液混浊或呈现乳白色,表明已污染.3.每次继代培养时,应在倒
11、置显微镜下观察培养物中各类细胞及其它残余物的情况以有意识地留下圆细胞,弃去长细胞5、规模化培养：植物细胞培养的工业化需要高投资, 而所得产品浓度和产率都非常低。鉴于这一点, 只有在比传统提取法和化学合成法更经济或无其他生产方法时, 利用植物细胞培养技术才是一种较好的选择。现在一致认为, 产率是限制植物细胞培养工业化的一个重要因素, 例如Drapean等证明只有在C.roseus生产的ajmalincine 的产率提高4倍时, 植物细胞培养法才经济可行。由于产品的产率受次级代谢物的分泌、有机体的生长和生物量的影响, 所以提高产率就要综合考虑生物学和工艺学两方面的原因, 选育稳定高产的优良细胞株和
12、优化培养条件是解决植物培养经济可行性的有效途径川。近几十年, 植物细胞悬浮培养技术取得了飞速发展, 利用悬浮培养生产次级代谢产物也显示出巨大的潜力, 但大部分生产还是在小规模下进行, 真正应用商业化大规模生产的并不多。许多植物细胞培养技术已被申请专利, 但目前事实证明几乎没有几种是经济可行的。除了代谢产物产率低、成本高、操作技术难度大和反应器的设计不成熟等因素外,其最主要的原因还在于培养过程和反应器的难以放大。随着对植物细胞培养特征、培养过程和反应器放大的更深人的研究, 植物细胞悬浮培养的潜能将会更好的发挥出来。6、存在问题与前景展望6.1，植物细胞与动物细胞，微生物比较存在的优势植物细胞培养
13、与动物细胞相比有以下优越性：动物细胞大都分为贴壁生长，需要黏附在支持物上，这样使大规模培养受到限制，而植物细胞大部分为悬浮培养。无需支持物，因此可以大规模培养。此外，植物细胞由于具有细胞壁，对剪切力的敏感性要小于动物细胞。动物细胞培养一般需要血清，培养成本较贵。与微生物相比，植物细胞体积较大，聚集成团，比微生物生长慢，特别是其对剪切力的敏感性要大于微生物，只能在相对低得剪切力下操作，这样势必因为混合不充分而影响营养物质的传递；其次，植物细胞的生理和代谢活动较低，仅要求较低的氧传递速率，过高的通气速率反而抑制细胞生长和产物合成；此外，植物细胞生长缓慢，发酵时间长，维持无菌操作更为困难。6.2，植
14、物细胞培养过程中存在的困难植物细胞的长度多为10100微米，形状多为球形或圆柱形，因细胞分化后不易分离，而且在间歇培养的后期分泌胞外多糖，所以长易聚集成团。聚集体常包括上百个细胞，直径能达几个微米。用图像分析和筛选技术发现不同细胞系，不同细胞年龄，不能培养条件下细胞团的形式也不同。在反应器中进行培养植物细胞的过程中，有两个限制条件需要考虑：一是在培养后期细胞大量生长，细胞聚集在有限的空间内，使碳和氮传递不均一从而造成细胞的死亡；另外一个限制条件是植物细胞对剪切力敏感是植物死亡的另一主要原因。6.3，前景展望对于药用植物来说，细胞悬浮培养的最终目的是利用高产株系进行大规模培养，通过生物和工程技术
15、方法的结合以实现高效生产次生代谢产物。对于研究比较透彻的模式植物，则多在细胞学，生理生化上取得了突破的进展。为生理学和生理生化做出了突出的贡献。近年来，图像分析技术已被用于植物细胞培养过程中细胞颜色，生长速率，形态，聚集体尺寸以及结构的分析与研究，他的优点是操作简单，非侵入性和有针对性的对细胞进行监测。这样使维持高质量细胞生长态势的控制成为可能。这些技术为人们带来了希望，同时要注意的是在实现大规模工业生产之前必须解决的问题是经济与技术的可行性。由于植物细胞培养可以实现人工调控，成为生产植物次生代谢产物的最有潜力和吸引力的研究领域。同时，为快速有效的诱导抗性植物，进行高产细胞株的筛选和稳定性研究
16、（就是利用转基因和重组DNA技术创造生产快，代谢产物产量高的植物细胞株，并对这些高产细胞株的稳定性进行研究）实现大规模扩繁和人工种子的生产提供了更为有效的途径。总之，植物细胞悬浮培养有着广阔的发展前景。在人类面临能源危机，资源短缺，环境污染日益严重的情况下，研究与利用植物细胞培养工程其意义尤为深远。参考文献1刘春朝, 王玉春, 郑重, 等剪切力对植物细胞悬浮培养的影响。化工冶金，1998,19（4）:379-384.2 Scragg A H ,Allan E J,Lekie F E .Effect of shear on the viabillty of plant cell suspensi
17、ons. Enzyme Microbiol Techmol ,1988,10:361-367.3朱新贵, 郭勇 玫瑰茄悬浮细胞合成花青素的光效应研究:学位论文.广州: 华南理工大学,1998.4吴兆亮, 胡滨, 元英进, 等 南方红豆杉细胞两液相培养过程动力学。化工学报，2000,51（5）：637-642.5Mirjalili N,Linen J C.Gas phase composition offects on suspension cultures of Taxus cuspidate.Biontech Bioeng,1995,48:123-132.6 刘志伟, 郭勇,张晨植物细胞培养
18、生物反应器的研究进展现代化工，1999,19（8）：14-16.致 谢本论文是在我的指导老师王大红的悉心指导下完成的。他严肃的科学态度，严谨的治学精神，精益求精的工作作风，深深地感染和激励着我。从课题的选择到论文的最终完成，王老师都始终给予我细心的指导和不懈的支持，在此谨向王老师致以诚挚的谢意和崇高的敬意！ 感谢武汉职业技术学院生物工程系的全体老师在几年的大学生活和学习中给予的关心和帮助，同时衷心感谢应用化学实验室，生化分离实验室，微生物实验室的实验员老师在我大学期间给予的帮助，才使我的课业能顺利进行。感谢武职制药10303班所有的同学和代课老师，他们让我的大学生活丰富多彩。最后，我要特别感谢我的家人，没有你们的支持，就没有今天的我。 愿把我的幸福和快乐都送给关心和支持过我的人，也愿他们一切如意！