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1、 绵阳师范学院本科生毕业论文（设计）题 目 蛇苔过氧化物酶Cys127-gly突变体与酵母表达载体的构建 专 业 生 物 技 术 院 部 生命科学与技术学院 学 号 0811420347 姓 名 指 导 教 师 答 辩 时 间 2012年5月 蛇苔过氧化物酶Cys127-gly突变体与酵母表达载体的构建 摘 要：本研究以过氧化物酶基因为原材料，构建其突变体，使氨基酸序列中的色氨酸转换为甘氨酸，酶蛋白中失去二硫键。然后利用设计好的引物扩增突变体序列以及质粒DNA，利用双酶切法产生粘性末端，使突变体DNA与质粒DNA连接产生重组体。再利用电穿孔转化法将重组质粒转入酵母细胞中进行表达。并挑选阳性菌株
2、进行PCR和双酶切鉴定。 该试验通过过氧化物酶突变体的构建与表达，获得了含甘氨酸的过氧化物酶蛋白，为过氧化物酶的进一步研究奠定了基础。关键词：突变体；表达载体；PCR ；琼脂糖凝胶电泳；双酶切Snake moss peroxidase Cys127-gly mutants and the construction of yeast expression vectorUndergraduate: Qiu Yongxiu Supervisor:Bian Chunxiang Abstract：In this study, Construct mutant by using peroxidase ge
3、ne as raw material，making the tryptophan become to glycine in the conversion of amino acid sequence。Enzyme protein lost its disulfide。Then use the designed primers to amplify mutant sequences，as well as plasmid DNA, Use the double enzyme method to produce sticky end。Then connect the mutant DNA and p
4、lasmid DNA to produce recombinant。Then use Electroporation conversion method to Transplant recombinant plasmid into yeast cells to express。And the select out the positive strains，using them to do the PCR and double restriction enzyme identification.The test by constructing and expressing the peroxid
5、ase mutant ，Obtaining the protein containing glycine peroxidase，laying the foundation for further study of peroxidaseKey words: mutant； expression vector； PCR； Agarose Gel Electrophoresis ；Double Digests 目 录1前言.11.1蛇苔过氧化物酶的研究现状.11.1.1蛇苔的研究现状.11.1.2过氧化物酶的研究现状.11.2突变体的研究现状.21.3表达载体的研究现状.21.4实验目的.31.5实
6、验意义.32实验材料.32.1实验样品.32.2实验培养基.32.3主要仪器及试剂.52.4主要试剂的配置.53实验方法.53.1实验流程.53.2实验步骤.63.2.1突变体的构建.63.2.2突变体与质粒表达载体的扩增与纯化.63.2.3双酶切产生粘性末端.73.2.4目的基因与表达载体的连接.73.2.5重组质粒的转化.73.2.6重组子的筛选及鉴定.94结果及分析.94.1阳性菌株的生长状况.94.2突变体通过PCR扩增及纯化后产生的DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图谱.104.3阳性菌株中提取的质粒经PCR扩增产生的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱.104.4阳性菌株中提取的质粒经双酶切产生DN
7、A序列的琼脂糖凝胶电泳图谱.115讨论.12参考文献.13致谢.151 前言1.1蛇苔过氧化物酶的研究现状1.1.1蛇苔的研究现状2008年，历经30年研究的中国苔藓植物研究项目喜获了国家自然科技进步二等奖。国内外学者认为这将对苔藓综合性研究成果具有奠基性、开拓性和创新性，并且对生物医药等产业发展起到重要作用13。苔藓植物是植物界中的一个重要门类，属于低等植物，约占全世界植物总数的5。从分类学角度可将苔藓植物分为三类：角苔纲(Hornworts)、苔纲(Liverworts)、藓纲(Mosses)。大约在300万年前，地球上就有了苔藓，比有花植物早了约200万年。苔藓分布很广，能适应多种气候环
8、境，世界各处几乎都有分布，尤其多生于阴暗潮湿地区，如热带雨林和山林，特别是土坡、沟边或沼泽地等。苔藓植物虽然分布面积较广，但密度较小，种间杂生，不易区别和分离，难以大量采集，对其进行化学成分的研究长期受到忽视，直到近3O年来，随着分析仪器精密性越来越好，分析技术不断进步，测定一个天然产物的结构所需要的量越来越少，苔藓植物化学成分的研究才取得一定进展。研究结果表明，苔藓植物中具有许多新颖的结构骨架，含有不少生物活性成分。苔藓植物是具有潜力的天然产物的宝库14。 蛇苔（Conocephalum conicum）是蛇苔科蛇苔属植物。植物体叶状，深绿色，革质，具光泽，多回二歧分叉，表面可见六角形或菱形
9、的气室，气孔单一型，位于气室中央。腹面中部具多数假根，两侧各有一列深紫色鳞片。雌雄异株。 雌托具长柄，并具一假根沟，生于叶状体背面先端，圆锥形，托下着生58个总苞，每苞内具一个孢蒴，孢蒴长梨形，具短柄。蛇苔的生境多分布于溪边林下湿碎石和土上。分布于我国各省区，以及俄罗斯远东地区、朝鲜、日本、欧洲和北美洲。蛇苔常用于解热、消肿止痛、用于治疗毒蛇咬伤、烧伤烫伤、无名肿痛等15。民间一直沿用蛇苔(Comocep-batum conicus(L.) Dun)捣碎外敷治毒蛇咬伤、烫伤。1.1.2过氧化物酶的研究现状过氧化物酶(Peroxidase，POD，EC编号：1.11.1.7)是一类从植物、动物、
10、微生物中提取出来的氧化还原酶，其以血红素为辅基，参与生物体内的生理代谢1。在有机体的新陈代谢过程中，过氧化物酶主要是催化分解生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其它毒素2。 过氧化物酶是广泛存在于各种动物、植物和微生物体内的一类氧化酶。催化由过氧化氢参与的各种还原剂的氧化反应：RH2+H2O22H2O+R。植物过氧化物酶的研究可追溯到1809年用愈创树脂为底物进行的颜色反应。但直到一个世纪之后才开展此酶的分离和命名。已知的催化反应底物超过200种，以及多种过氧化物和辅助因子。迄今被研究最深入的应首推辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)。早在1940年，Thore
11、ll即用电泳方法从部分纯化的辣根组织中区分出2种不同的HRP，之后此酶在植物正常和应激反应代谢中发挥重要作用而受到广泛关注，并对此酶进行了大量研究，涉及酶的种类、等电点、氨基酸组成和序列、生理功能，以及基因表达和调控的分子机制等。迄今此酶作为一种商品化试剂也广泛用于免疫组织化学、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，并成为重要的诊断试剂3。 POD作为植物细胞内重要的组成成分，具有许多非常重要的生理功能。由于其成分和结构的复杂性，同功酶的多样性，以及多基因编码特点，造成对其功能的认识尚不全面。迄今已肯定的功能有：参与活性氧代谢，在活性氧代谢过程中，POD发挥了重要作用。参与木质素和木拴质的
12、合成，木质素和木栓质的积累与POD活性增强之间的关系已被许多试验所证实。参与生长素的降解，由POD参与的吲哚乙酸的氧化分解功能早已被注意。参与其它物质的氧化过程， 许多体外试验发现，POD可参与催化谷胱甘肽、NADH、DTT、草酰乙酸、氢醌、酪氨酸、阿魏酸等酚类化合物的氧化11，12。生理功能与环境胁迫的关系，除了与植物正常代谢和生长发育相关的结构型POD外，很大部分POD的合成属于诱导表达型 。过氧化物酶可作为矮生品种的预选标志，植物的高度与过氧化物酶活性呈负相关，这与细胞中IAA被氧化、减慢生长速度有关，McCune(1959)进行豌豆生长实验时发现。其生长速度与过氧化物酶活性呈反比。1.
13、2突变体的研究现状在遗传分析中，为了获得某一组分的功能，而将其敲除形成的个体叫做突变体。突变体往往具有与野生型不同的表型，这样就为缺失组分的功能提供了有益的信息。同样，现在会将含有某一组分过表达的个体也称为突变体。产生突变体的方法有物理和化学诱变、同源重组、基因沉默以及插入突变等。突变体库就是由某种方法产生的、包含各种不同基因突变的群体。通过突变体确定基因的功能，有正向遗传学和反向遗传学两种策略。反向遗传学是从突变的基因序列出发，鉴定该基因突变产生的突变体，最终确定该基因的功能。正向遗传学是从突变的表型出发克隆到发生了突变的基因，确定该基因的功能。结构基因组学的研究为反向遗传学研究提供了大量的
14、待鉴定的基因序列，反向遗传学研究也成为功能基因组研究的一个重要手段。物理、化学诱变比较容易得到饱和突变体库，但突变基因的克隆要用较复杂的图位克隆法难以在获得全基因组测序信息的基础上进行基因功能的研究。同源重组的酵母和鼠类中用得比较成功的一种方法，但植物中同源重组率比较低。基因沉默在线虫的突变体库构建中得到成功应用，但并不适合于植物。1.3表达载体的研究现状表达载体（Expression vectors）就是在克隆载体基本骨架的基础上增加表达元件（如启动子、RBS、终止子等），使目的基因能够表达的载体。如表达载体pKK223-3是一个具有典型表达结构的大肠杆菌表达载体。其基本骨架为来自pBR32
15、2和pUC的质粒复制起点和氨苄青霉素抗性基因。在表达元件中，有一个杂合tac强启动子和终止子，在启动子下游有RBS位点（如果利用这个位点，要求与ATG之间间隔5-13bp），其后的多克隆位点可装载要表达的目标基因。常用细菌质粒进行构建，构建过程中运用限制性核酸内切酶切割出与目的基因相合的末端（多为黏性末端，也有平末端），采用DNA连接酶连接，导入生物体实现表达。标记基因可帮助识别质粒并检测是否成功整合到染色体DNA中。1.4试验目的通过构建蛇苔过氧化物酶的突变体，利用双酶切使表达载体与突变体产生相同的粘性末端，将二者连接，采用电击法将重组质粒导入酵母中进行表达。筛选出阳性菌株，因甘氨酸代替了色
16、氨酸，产生不含二硫键的酶蛋白。并对质粒及突变序列进行鉴定。1.5试验意义该试验通过过氧化物酶突变体的构建与表达，获得了含甘氨酸的过氧化物酶蛋白，为过氧化物酶的进一步研究奠定了基础。2试验材料2.1试验样品 蛇苔过氧化物酶基因序列 、酵母、质粒表达载体、引物2.2试验培养基及常用溶液溶液名称Reagents溶液配方PrescriptionLB培养基（1L, pH 7.2）胰化蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 5gYEB培养基（pH 7.4）牛肉浸膏5g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨5g/L，蔗糖5g/L，硫酸镁0.04g/LBuffer I50mmol/L葡萄糖，25mmol/LTris(p
17、H8.0)；10mmol/L EDTA(pH8.0)，高压灭菌Buffer II0.2M NaOH，1%SDS，现用现配Buffer III5 mmol/L 乙酸钾60mL，冰乙酸11.5 mL，水28.5 mLYPD培养基TB Buffer3.0g PIPES (10mmol/L)，2.2g CaCl2H2O (5mmol/L)，18.6g KCl定容100 mL10mg/L溴化乙锭10mL水中加入0.1g溴化乙锭，磁力搅拌器搅拌数小时以确保其完全溶解，然后室温保存于棕色瓶中。SDS电泳加样缓冲液（0.08 mmol/L Tris.Cl，pH 6.8）常用1.6mL浓缩胶缓冲贮液（1mol/
18、L Tris. Cl，pH 6.8；4mL 10% SDS，0.3g 二硫苏糖醇（或1mL-巯基乙醇），2.5mL8甘油，0.1mg 溴酚蓝；双蒸水稀释至20（1），4保存。考马斯亮蓝R-250染色液45mL甲醇，45mL H2O，10mL冰乙酸溶解0.25g考马斯亮蓝R25010 %过硫酸铵（10mL）1g过硫酸铵定容10mL0.5 mol/L EDTA（1L pH8.0）在800mL水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na2H2O），在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调节溶液的pH值至8.0(约需NaOH颗粒20g)然后定容至1L分装后高压灭菌，备用考马斯亮蓝R-250脱色
19、液乙醇50mL，冰乙酸100mL，ddH20 850mL，充分混合后使用固定液甲醇250InL，乙酸37.5mL，ddH20 212.5 mL，充分混合后使用转移缓冲液Trisl.93g，甘氨酸9g，加ddH20定容至IL，调节pH为8.18.4。TBS(Tris盐缓冲液)5mL 2mol/L Tris-HCl(pH7.5)，37.5mL 4mol/L NaCl，加ddH2O定容至1L。封闭液(3% BSA/TBS)称取3gBSA，加TBS定容至100mL，4保存。30 丙稀酰胺溶液（100mL）29g丙稀酰胺与1g N, N-亚甲双丙稀酰胺混和，去离子水定容至100mLSDS电泳脱色液（10
20、0mL）45mL甲醇，45mL H2O，10mL冰乙酸 混和10 SDS溶液（100mL）10g SDS 定容至100mL分离胶缓冲液（100mL 1.5mol/L pH8.8）18.171g Tris固体与8.5mL 0.1mol/L HCl 混和加水定容至100mL 续表2-4溶液名称Reagents溶液配方Prescription浓缩胶缓冲液（100mL 1.0mol/L pH6.8）12.12gTis固体加水定容100mL0.1 SDS溶液（100mL）0.1g SDS固体定容100mLSDS电泳加样缓冲液（0.08 mmol/L Tris.Cl，pH 6.8）常用1.6mL浓缩胶缓冲
21、贮液（1mol/L Tris. Cl，pH 6.8；4mL 10% SDS，0.3g 二硫苏糖醇（或1mL-巯基乙醇），2.5mL8甘油，0.1mg 溴酚蓝；双蒸水稀释至20（1），4保存。Tis-甘氨酸电泳缓冲液900mL水中溶解15.1g Tis-碱和94g甘氨酸，然后加50mL10% SDS定容至1L。2.3主要仪器仪器型号产地梯度PCRThemo-HybaidPx2美国旋涡混合器Voreex-Genie2美国超低温冰箱MDF-192 日本超纯水系统Milli-QBiocel美国迷你离心机MINISPIN PLUSGermany超声破碎仪JY92-II宁波科生仪器厂恒温制冷和加热水浴Ch
22、illMaster德国电穿孔系统Gpxcell美国冷冻干燥仪Vo802-oos台湾电子分析天平BP211D德国超滤仪MillPore Labscale TF美国生物大分子纯化系统AKTA Explorer美国GE公司常规电泳系统(一套)Mini-PROTEIN 3 CellPowerPac HC美国BIO-RAD紫外可见分光光度计Uitrospec3300pro美国GE公司恒温培养培养箱PYS-DHS 400-BS-2上海康华生化仪器厂冷冻离心机5415DIR德国恒温水浴锅HH-6上海康华生化仪器厂超净工作台SB-JC-1A上海康华生化仪器厂全自动高压灭菌锅SANYO LA60 Autocla
23、ve日本荧光系统显微镜Olympus BX51 日本凝胶成像分析系统UNIVERSAL HOOD II美国BIO-RAD超纯水系统Milli-QBiocel美国制冰机Sim-F124日本3试验方法3.1试验流程方案设计突变体的构建突变体与质粒表达载体的扩增与纯化双酶切目的基因与表达载体的连接电穿孔转化重组子的筛选及鉴定3.2试验步骤3.2.1突变体的构建3.2.2突变体与质粒表达载体的扩增与纯化3.2.2.1Cys127Gly POD编码区序列的扩增取Cys127Gly POD序列作为模板，分别以构建好的引物进行PCR扩增。每一样品的PCR扩增体系均为50L，其中包括：Taq DNA聚合酶0.
24、25L(5U/L )Buffer(l0PCR缓冲液)5LMgCl23L (25mmol/L)dNTP4L(20mmol/L)引物（10mol/L）各2LcDNA模板2LddH2O31.75LTotal50L引物GYHWF Sense: CTTACGTACAGTTGAGGCCAGACTTTTACGAGC SnaB IGYHWR Antisense: AACCTAGGAGAGTTGGGCTTCCTGCAGTTG Avr II 59.9配制反应体系在超净工作台上进行，反应设不含DNA模板的阴性对照，以防止外源DNA污染造成的错误。反应体系配制完成后进行瞬时离心，并以石蜡油封顶，然后放于PCR仪进行扩
25、增。PCR扩增条件（常规PCR）：94 30s30次59.9 30s72 1min4 保存3.2.2.2 质粒的PCR扩增（方法同上）3.2.2.3 PCR扩增产物的检测及纯化用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果，并回收、纯化。本实验使用Omega公司生产的UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒进行回收，具体操作步骤按Omega公司的凝胶回收试剂盒的说明书进行。3.2.3双酶切产生粘性末端分别对Cys127Gly POD编码区序列的DNA片段和质粒进行双酶切处理。消化反应如下：10K buffer4.0LDNA片段或质粒表达载体10LSnaB I1.0LAvr 1.0LddH2O24L37酶切
26、3h，取出65水浴10min，冰水浴1-2min，4，12000g，离心1min；用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物，分别回收酶切片段，回收产物于-20保存备用。3.2.4目的基因与表达载体的连接连接反应体系：10ligase buffer2L酶切片段2L酶切表达载体3LT4连接酶1LddH2O12Ltotal20L16保温过夜，65保温10min，终止反应。转化感受态细胞Top10，转化后的细胞悬液铺于LB平板上(Amp(100g/mL)，37恒温箱培养过夜。3.2.5重组质粒的转化 电穿孔转化步骤： （1）、实验前两天，将转化用酵母菌株的单菌落接种于5mlYPD培养基中，30过夜培养至饱
27、和。（2）、转化前一天晚上，在装有500mlYPD培养基的2L无菌烧瓶中接种适量的过夜培养液，与30剧烈摇动培养过夜，直到细胞密度达110细胞ml（OD6001.31.5，根据菌株不同而异）这一细胞密度表明细胞处于对数生长的中后期。如果不知道精确的生长时间，可以用不同体积的饱和培养液接种3个不同的烧瓶（3）、于4以4000g离心收获培养细胞，细胞用80ml无菌水重悬。为了增加细胞对电击的感受性，继续步骤4，如果这种处理并不需要的话，可接步骤（6）.可选用乙酸锂处理细胞，用这些步骤制备酵母菌会增加操作时间，但如果在随后使用时要冷冻细胞，那么就不应进行这一过程。（4）加入10ml 10TE缓冲液，
28、pH7.5.摇晃混匀，再加入10ml 10乙酸锂贮液，旋转摇匀，于30轻轻摇动45min。（5）加2.5ml 1molL DTT，并同时旋转摇动，于30轻轻摇动15min。（6）将酵母菌悬液稀释在500ml水中，洗涤3次，每次以4000 6000g于4离心沉淀细胞，依次重悬细胞，所用的溶液如下：第一次沉淀：250ml冰冷的水第二次沉淀：20 30ml冰冷的1molL山梨醇第三次沉淀：0.5ml冰冷的1molL山梨醇每次重悬细胞时应剧烈吹打沉淀，使细胞完全分散开。最后重悬酵母菌的体积应在1.0 1.5ml之间最终的OD600应为约200。使用Bio-Rad公司的Gene Pusler（7）往一个
29、无菌、冰冷的1.5ml微量离心管加入40ul浓缩的酵母菌细胞核100ng待转化的DNA（体积5ul），混匀。待转化DNA应溶于低离子浓度的缓冲液，如TE或无菌超纯水中。不必进行一定时间的温育，这一时间可灵活掌握；在转化过程中不需要担体DNA，加担体DNA会急剧降低转化效率。使用10ng的质粒DNA转化时可获得最大的转化效率，而使用100ngDNA转化时，则可获得数目最多的转化体。（8）将酵母与转化DNA混合物转移到冰冷的0.2cm间隙的一次性电击池中。（9）以1.5kV、25uF、200作脉冲转化，电路中应包括Bio-rad 脉冲控制仪，如不这样便会损坏Gene Pulser。基因脉冲仪设定的
30、时间常数在4.2 4.9ms之间。（10）往电击池加入1ml冰冷的1molL山梨醇回收酵母细胞，然后用无菌的巴斯德吸管轻轻吹吸混匀。（11）将酵母菌液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30培养3 6天，直到平板上出现菌落。使用Life Technologies的Cell-Porator（12）往一支无菌，冰冷的1.5ml微量离心管中，加入20uL浓缩的酵母菌和待转化的DNA。DNA用量要100ng，体积5uL。（13）将酵母菌DNA混合物转移到0.15cm间隙的电转槽中。（14）以400V，10uF，低电阻下进行脉冲转化。（15）取10uL电转混合物加到1.5ml无菌的薇离心管中，其中含有0
31、.5ml冰冷的1molL山梨醇。（16）将酵母菌悬液直接涂布在山梨醇选择培养基平板上，于30培养3 6天直到平板上出现菌落。3.2.6重组子的筛选及鉴定随机挑取5个单菌落(带有转化产物的平板)进行PCR和双酶切鉴定，以保证筛选的可靠性。具体步骤，于5mL/50mL的尖底离心管中，37液体培养16h，碱裂解法提取重组质粒，PCR扩增后，0.8%琼脂糖电泳检测。将提取的质粒进行双酶切，0.8%琼脂糖电泳检测。4结果与分析4.1阳性菌株的生长状况4.2突变体通过PCR扩增及纯化后产生的DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图谱4.3质粒通过PCR扩增及纯化后产生的DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图谱4.4阳性菌株中提
32、取的质粒经PCR扩增产生的DNA的琼脂糖凝胶电泳图谱及阳性菌株中提取的质粒经双酶切产生DNA序列的琼脂糖凝胶电泳图谱5.讨论参考文献1 RODRIGUEZLDPEZ J N, LDWE DJ, HERNANDEZRUIZ J, el a1.【J】.J AmChem Soc, 200l, 23:l l838-ll847 2 罗勇军, 罗光富, 黄应平等人. 过氧化物酶模拟及应用研究进展. 分析测试学报, 2004年9月第5期, 第23卷: 36142. 3 阎双勇，谭振波，李仁贵 .水稻插入突变库构建研究进展. 中国生物工程杂志, 第24卷第6期4 Bolwell GP, Wojtaszek D
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39、本论文是在边春象老师的悉心指导下完成的，从论文的选题、实验设计、结果分析，乃至定稿成文无不凝结着导师的心血和汗水。边老师渊博的知识、敏锐而活跃的思维方式、实事求是的科研精神、严谨的治学态度，将使我受益终生。实验是在绵阳师范学院分子生物学与生物制药重点实验室完成的。在这里边老师给了我一个宽松自由的平台，可以让我自由的发挥。在实验过程中，得到了老师和同学的支持与协助。 最后感谢绵阳师范学院给予我学习进步的机会，感谢绵阳师范学院的学习科研和学习氛围给予我科学严密的思维观念和进步认真的做事风格。在此，谨向帮助过我，批评过我，指导过我的所有的人表示最衷心、最真诚的谢意！衷心感谢在百忙之中抽出时间审阅本论文的老师们！ 2012年5月