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1、编号： 本科毕业设计（论文）题目：铅离子与牛血清蛋白相互作用的光谱分析Spectroscopic investigations on the interaction of Pb2+with bovine serum albuminn 学 院 专 业 班 级 学 号 姓名 指导教师 职 称 完成日期 牛血清蛋白和铅离子相互作用的光谱分析摘要：本文综合运用荧光光谱法、紫外光谱法、红外光谱法分析铅离子和牛血清蛋白相互作用的光谱特征。探究了不同的实验条件：pH、牛血清蛋白浓度、铅离子浓度、离子强度对铅离子-牛血清蛋白体系光谱的影响，以及最佳试验条件，利用紫外光谱中峰值变化或者位移初步判断铅离子与BSA
2、发生了作用。荧光光谱测定出铅离子可以引起牛血清蛋白的荧光猝灭，利用红外光谱分析铅离子对蛋白质二级结构的影响，可知-转角增加，-螺旋减小，-片层增加。关键词：铅离子；牛血清蛋白；荧光光谱；紫外可见光谱；红外光谱Abstract: In this paper，The interaction of Pb2+and bovine serum albumin (BSA) was studied by fluorescence，UV Spectrum，and infrared spectroscopy. It is explored the impact of different experimental
3、 conditions:pH，the concentration of the bovine serum albumin，the concentration of the lead ion . UV Spectrum shows that Pb2+ froms a compound with BSA. The results revealed that Pb2+caused the fluorescence quenching of BSA.Infrared spectroscopy shows the interaction between Pb2+and BSA could result
4、in the change of conformation of BSA. Thus helix structure in BSA was decreased the -sheet was increased.Keywords：lead ion；bovine serum albumin;fluorescence spectrometry；UV Spectrum；infrared spectroscopy目 录1. 引言 .41.1 紫外光谱.51.2 荧光光谱.51.3 红外光谱法.82. 实验部分.102.1 实验试剂与仪器.102.1.1 实验试剂.102.1.2 实验仪器102.2 实验
5、试剂的配制.10 2.2.1 缓冲液的配制.10 2.2.2 BSA溶液的配制.10 2.2.3 铅离子溶液的配制.103. 结果与讨论.133.1 紫外光谱图.133.1.1 不同pH条件下体系的紫外光谱图.133.1.2 不同浓度BSA下体系的紫外光谱图.143.1.3 不同浓度硝酸铅条件下的紫外光谱图133.1.4 离子强度对体系紫外光谱的影响.15 3.2 荧光光谱图.163.3 红外光谱图173.3.1 铅离子存在的红外光谱图.193.3.2 体系的红外二阶导数图.194. 结论.21参考文献.21致谢.221. 引 言在生物体中，蛋白质是极为重要的生命物质，在生命的运动和发展中起着
6、关键的作用。有关蛋白质的组成、构象及与小分子相互作用机理的研究，是目前从事化学、化学生物学、生命科学、药学和临床医学科技工作者共同关注和感兴趣的课题【1】。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的载体蛋白，它能与许多内源性物质和外源性药物等有效结合，形成结构更为复杂的复合物，直接或间接地发挥着调控蛋白质的作用【2-4】，影响蛋白质的生理作用。因此关于小分子与蛋白质等生物大分子相互作用的研究引起了人们的极大关注。蛋白质种类繁多，目前已经发现的蛋白质数量已达几百万种，但是各种蛋白质均是含有多个配位原子（如：N、O、S，有些蛋白质还含有P等）的大分子多齿配体，因此能够很容易地与金属离子或其小分子配合物相互作用
7、，并且对应不同的光谱特征。蛋白质的功能与其结构构象密切相关，有什么样的结构就有什么样的功能，反之同样成立。蛋白质某种生物功能的激活或维持往往与一些生命元素或有益元素的作用密切相关；同时，蛋白质某种生物功能或活性的减弱或消失也往往是受某种沾染元素或有害元素的影响，这些元素大多数是金属元素，它们通过与相关蛋白质的作用来稳定或改变蛋白质的结构构象，从而达到控制或影响蛋白质功能的目的。因此可以说，研究金属元素同蛋白质的相互作用特别是多种不同金属元素在近生理环境条件下同蛋白质的相互作用及作用前后蛋白质结构构象的变化，阐明某种金属元素的作用机理，从而为从分子水平上研究微量元素对人体健康的影响、预防中毒及环
8、境污染治理等有重要意义。牛血清蛋白(bovineserumalbumins，BSA)是常用的研究蛋白，因为它是血浆中含量最丰富的载体蛋白，能与体内许多内源性物质及外源性物质作用，且这类蛋白的结构己用X光测定【5-6】牛血清蛋白和人血清蛋白十分相近，两者氨基酸的排列顺序也极其相似，牛血清蛋白是一种含多个配位基团的生物有机大分子，可以与金属离子配位。所以对牛血清蛋白的分析具有十分重要的理论和现实意义。金属离子同蛋白质的相互作用除受蛋白质本身刚性和柔性结构影响外，还受金属离子电荷、半径、配位构型等因素影响，如Zn常与Cys、His以配位键形成四面体结构。另外，反应温度、反应时间、离子浓度（强度）、酸
9、度、缓冲液等均影响蛋白质与金属离子的相互作用。特别值得注意的是离子浓度对反应的影响，浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围。铅在自然界中分布极广，几乎所有的矿物中都含有铅。生活中常见的是铅离子，铅是进行工业生产、科学研究不可缺少的物质之一，在人类的生产生活中起着重要的作用。但是铅又是对人类和高等生物中最具危害的有毒元素之一，铅污染问题己给人类造成了多种灾害。铅在自然界中以多种形式存在。铅的形态
10、不同，产生的毒性也不同。研究表明，无机铅可通过生物甲基化、乙基化等反应生成相应的有机铅，而有机铅可被动植物吸收，并通过食物链富集，最终危害人类健康。铅即可造福人类，又会造成环境的污染。因此，寻求高灵敏度和高选择性的检测方法对其进行检验，具有理论和实际的意义。蛋白质与金属离子相互作用的研究早在50年代就已开始进行。自从60年代以来，许多科学工作者采用晶体结构分析和配位化学方法研究了一些金属蛋白和金属酶的结构，配合生物活性研究推测了它们的作用机理，这些研究共同构成了生物无机化学的主要研究方面。自从80年代以来，各种检测技术及计算机技术的发展为人们研究蛋白质同金属离子的相互作用打开了一个新的局面，这
11、方面我国的生物无机化学家王夔、申泮文等已作了大量的研究工作，并有多部相关的专著介绍具体的实验。常用到的检测方法如下：1.1. 紫外光谱法紫外吸收光谱分析是了解溶液中蛋白质分子构象的一种常规方法。牛血清蛋白分子大概在280nm左右有一强吸收峰。由于蛋白质不同区域有特异性的结合，结合药物后会导致上述特征吸收峰的位移，因而在牛血清蛋白溶液中加入很少量的络合物，观察牛血清蛋白的特征吸收峰是否发生位移或者峰值变化可粗略知道络合物是否与BSA发生了作用。血清蛋白可以吸收紫外光，当与小分子物质发生作用时就会相应的出现吸收峰位移或者谱峰宽度的变化。杜娜娜等结合紫外吸收光谱和荧光光谱的方法，研究了异烟肼（INH
12、）与BSA之间的相互作用，讨论了INH对BSA的荧光猝灭机制【7】。吕桂英等采用紫外一可见分子吸收光谱法研究了吐温2O存在下牛血清白蛋白与镉试剂1B的相互作用并建立了蛋白质检测的分析方法且将之应用于牛血清白蛋白产品的检验【8】。张红梅等利用紫外光谱研究了不同pH值下微乳体系中稀土Nd3+离子与牛血清白蛋白(BSA)的作用，初步探讨了微乳体系中Nd3+与牛血清白蛋白作用的机理【9】。1.2 荧光光度法荧光光谱法具有灵敏度高、选择性好、用量少等优点。利用荧光光谱法测定药物、稀土金属和牛血清蛋白作用的报道比较多【10-15】。罗红斌等人应用荧光光谱研究了岩白菜素与牛血清白蛋白(BSA)分子间的相互作
13、用，研究表明岩白菜素与BSA反应的结合常数为2.083xl04，结合位点数为1【16】。李丹等采用荧光和紫外吸收光谱法，研究了利尿脱水药山梨醇(Sorbito1)与牛血清白蛋白(BSA)的相互作用，求出了在不同温度下反应的结合常数分别7.410-5 (25oC)和1.710-4 (37)，结合位点数为1【17】。吴刚坷等在模拟人体生理环境下，用荧光分光光度法及紫外一可见分光光度法研究了解热镇痛药对乙酰氨基酚(简写作PTL)与牛血清蛋白(BSA)之间的相互反应，试验结果发现:由于非辐射能量转移引起的荧光猝灭，BSA的荧光强度因与PTL相互之间的结合反应而明显降低。按Stern- Volmer方程
14、和Lineweaver-Burk方程对所得实际数据进行了处理，求得此结合反应的静态平衡常数(KLB)为2.592X103molL-1(297K)，其结合位位置距212位色氨酸1.94nm，根据结合反应的热力学参数，推断PTL与BSA之间的结合力为硫水作用力【1】。荧光光谱研究的内容与方法如下:(1) 结合部位的确定血清白蛋白的三维晶体结构已探明，有3个类似的结构域18:Sitel，Sitell和Site1H.每个结构域又含有A与BZ个亚结构域，以槽口相对的方式形成圆筒状结构。大多数药物在血清白蛋白上的结合部位为Sitel及Sitdl。用荧光法确定药物分子在血清白蛋白上的结合部位常用以下方法。(
15、2) 用具有已知特定部位的探针来做代替4-7某些荧光探针对蛋白质不同区域有特异性的结合，根据药物加入后对荧光探针的影响可以确定药物结合部位.已知Sitel的探针有:华法令(Warfarin)，苯基保泰松(Phnylbutazone)，丹磺酞胺(dansy-lamide)等;Site11的探针有:布洛芬(ibuprofen)，氟灭酸(flufenamic acid)等。(3) 通过Forster能量转移理论来求药物与色氨酸残基之间的距离19-22蛋白质的内源荧光主要是色氨酸发出的。利用Forster能量转移理论，可以求出和蛋白质作用的药物与色氨酸残基之间的距离，由此推测药物与蛋白质结合的空间部位
16、。能量转移作用可以发生在药物一蛋白质复合物内部，也可以发生在药物与蛋白质分子之间。在后一种情况时，求得的药物与色氨酸残基之间的距离表示分子扩散过程中药物分子与色氨酸残基的最近距离22。(4) 结合位点数与结合常数的测定Scatchard作图法是研究生物大分子与有机小分子结合反应的经典方法。此法在应用时须知道反应体系中游离态药物的浓度，这一点用荧光法测定时常不易做到，而且Scatchard作图法所得结果往往不理想;因此，在研究药物分子与蛋白质的结合反应中，Scatchard作图法应用不多。张保林等曾用此法研究了蒽醌及黄酮类化合物与人血清白蛋白的结合反应11。蛋白质与药物分子发生反应时，可引起体系
17、荧光性质的改变，有2种情况:(l)药物分子无荧光，在蛋白质溶液中加人药物后，蛋白质的内源荧光被猝灭;(2)药物分子有荧光，蛋白质与药物混合后，其内源荧光被猝灭，同时药物分子的荧光被敏化增强。从荧光猝灭机理上来看，药物分子对蛋白质荧光的猝灭可分为动态猝灭和静态猝灭。动态猝灭是药物和蛋白质的激发态分子之间的相互作用而导致的荧光猝灭，遵循Stern一Volmer方程9-10:Fo/F=l+KsvCQ .(1)式中Fo为未加药物(猝灭剂)时蛋白质的荧光强度，F表示加入药物浓度为CQ时蛋白质的荧光强度，Ksv称为猝灭常数。静态猝灭是药物和蛋白质在基态时生成复合物，从而导致蛋白质荧光强度降低。对于1:1结
18、合的情况，可推导出公式:Fo/F=l+KQ(2)式中K为复合物的稳定常数，Q为游离药物分子的浓度。根据此式作Fo/F-Q图，可由回归直线斜率求得K值。用式(2)作图，发现所得回归直线往往线性关系不好，为此，将式(2)变形为双倒数公式12，该式是目前国内作者引用最多的一个公式。(Fo - F)-1=Fo -1+K-1 Fo-1Q-1(3)比较式(1) 和式(2) 可以看到, 无论是静态猝灭还是动态猝灭, Fo/F与CQ之间均存在着线性关系, 因而, 仅仅通过测量荧光强度所得到的荧光猝灭数据, 无法判断猝灭现象究竟是属于动态还是静态的. 区分动态猝灭与静态猝灭可以通过以下几个方面来确定: 动态猝灭
19、与温度有关, 温度升高将增大扩散系数，从而增大双分子猝灭常数；而温度升高可能引起配合物的稳定性下降, 从而减小静态猝灭的程度。 由于动态猝灭只影响到荧光分子的激发态, 因而并不改变荧光物质的吸收光谱; 而静态猝灭中, 基态配合物的生成往往会导致荧光物质吸收光谱的改变。 静态猝灭, 猝灭剂的存在并不改变荧光分子激发态的寿命,o/= 1； 而动态猝灭,猝灭剂的存在使荧光寿命缩短, o/=Fo/F这是区分静态猝灭与动态猝灭最确切的方法。1.3红外光谱法红外光谱各种实验技术的发展为研究蛋白质及多肽的结构与功能的关系提供了有力手段。蛋白质的二级结构与其分子内形成的不同氢键类型密切相关，红外光谱法是研究蛋
20、白质二级结构和动力学特性的有效工具【23】，通过研究蛋白质的二级结构可以探讨结构和功能的关系。刘会洲等应用红外光谱仪研究了表面活性剂水溶液中的溶菌酶的乳化和二级结构的影响，提出离子型表面活性剂与蛋白质作用，能够破坏蛋白质分子中有序的螺旋结构，增加无规卷曲结构的含量19。红外光谱是研究蛋白质二级结构的主要手段之一，它既可以对蛋白质的二级结构进行定性分析，也可以进行定量分析。1950年 Elliott和Ambrose根据模型多肽提出的红外酰胺I带16601650cm-1的峰属螺旋结构、16401630 cm-1的峰属折叠构象的假设是定性估计蛋白质二级结构的基础87-88。70年代中期发展了若干半定
21、量计算蛋白质构象的方法，这些方法的局限性在于要求很多参数，而实际工作的难度恰在于此。1983年Susi和Byler首先将二阶导数理论应用于研究二级结构，1986年他们又将卷积方法应用于二级结构分析89，使得红外分析蛋白质二级结构进入定量化阶段。蛋白质在红外区域表现为9个特征振动模式或基团频率，其中最常用于二级结构分析的是位于17001600cm-1范围的酰胺I 带。由于蛋白质含有多种不同的二级结构单元，这些构象对应的振动吸收峰重叠在一起形成宽峰，各子峰固有的宽度大于仪器分辨率，利用普通光谱技术难以将各子峰分开，而傅里叶变换红外的高分辨率、高灵敏度、高信噪比及准确的频率精度等特点，使得二阶导数、
22、去卷积技术可以应用于FTIR上，因而可把原来酰胺I带中未能分辨的峰分开，并指出各子峰的峰位值，然后通过曲线拟合，定量分析蛋白质二级结构的各个组分。目前，研究小分子、离子与白蛋白的相互作用的方法除了光谱法之外，常见的方法还有平衡渗析法、核磁共振法、离心超过滤法和量热法等【24】。一直走在生物无机化学前列的王夔等人，他们通过一系列的研究发现了金属离子与血清白蛋白配位的平衡条件、pH效应、以及金属离子(包括稀土金属离子在内)与蛋白质的主要的配位基团及位置等【25】以上各种方法中，应用较多的是紫外-可见光谱法和荧光光度法，而其中又以荧光光度法为最多，通过荧光法可以发现牛血清蛋白会发生非辐射能量转移引起
23、的荧光静态猝灭，并且可以测定计算平衡常数，结合位点，作用力的类型，以及相关的热力学常数，从而确定其他物质的加入对牛血清蛋白构象的影响；研究体系则以药物、稀土金属与牛血清蛋白的作用为多，而铅离子对牛血清蛋白构象的影响以及两者间作用的机理研究尚未见报道，因此，开展这方面的研究以寻求高灵敏度和高选择性的检测方法，具有理论和实际的意义。2. 实验部分2.1 实验试剂与仪器2.1.1实验仪器(1)970CRT型荧光分光光度计（上海分析仪器总厂）(2)UV-7502PC型紫外-可见分光光度计(日本岛津)(3)电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司)(4)10-1000L移液枪(5)Nicolet6700红
24、外光谱仪(美国热电公司)2.1.2实验试剂名 称纯度及规格试剂来源牛血清白蛋白生化试剂 国药集团化学试剂有限公司硝酸铅生化试剂 国药集团化学试剂有限公司磷酸氢二钠分析纯国药集团化学试剂有限公司磷酸二氢钾分析纯 国药集团化学试剂有限公司二次蒸馏水氯化钠分析纯国药集团化学试剂有限公司2.2 溶液的配制2.2.1 缓冲液的配制用分析天平准确称量KH2PO4、Na2HPO4分别为0.9073g和2.3852g，用100ml容量瓶配制成1/15mol/L的溶液，用酸度计调节配制pH为：6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5的缓冲液。2.2.2 BSA溶液的配制取50ml容量瓶，称量0.3400g
25、牛血清蛋白，用二次蒸馏水配置成110-4mol/L的牛血清蛋白溶液，并稀释成10-5mol/L，作为储备液放入冰箱中在低于5摄氏度条件下保存。2.2.3 铅离子浓度的配制用分析天平准确称取0.3312g的硝酸铅，用100ml容量瓶配制成0.01mol/L的溶液。并且用二次蒸馏水依次稀释为110-3mol/L、510-4mol/L、110-4mol/L、110-5 mol/L、510-5 mol/L、110-6 mol/L。（1）实验过程不同浓度的硝酸铅溶液的配制取若干10ml干净的比色皿，加入2mlBSA溶液，2mlpH=7.1的缓冲液，加入硝酸铅体积（ml）如下，并用二次蒸馏水稀释至10ml
26、。步骤 浓度mol/L 10-3510-410-410-5 510-5 110-6 12.00.00.00.00.00.024.00.00.00.00.00.030.01.00.00.00.00.040.00.02.00.00.00.050.00.04.00.00.00.060.00.00.02.00.00.070.00.00.04.00.00.080.00.00.00.01.00.090.00.00.00.00.01.0100.00.00.00.00.02.0110.00.00.00.00.04.0120.00.00.00.00.00.0（2）不同pH溶液配制取若干个比色管，加入2mlBSA
27、溶液，并依次加入2mlpH为6.0、6.5、7.0、7.5、8、8.5的缓冲液，并用二次蒸馏水稀释至10ml。（3）不同浓度的BSA浓度的配制在十一个干净的10ml的比色管中加入2mlpH=7.1的缓冲液，2mL410-4mol/L加入如下表所示的BSA溶液，用二次蒸馏水稀释至10mL步骤10-5mol/L(mL)110-4mol/L410-4mol/L11.00.00.022.00.00.033.00.00.044.00.00.050.01.00.060.02.00.070.03.00.080.04.00.090.00.02.0100.00.03.0110.00.04.0（4）测定步骤：荧光
28、：发射波长设定为350nm，测量200-600nm处的荧光光谱。所有测量均在室温(152)下进行。激发和发射单色器狭缝均为5nm。紫外：均用二次蒸馏水建立基线，扫描范围200-600nm。红外：灵敏度设定为2cm-1，测定4000-400cm-1处的光谱图3. 结果和讨论3.1紫外光谱图3.1.1 不同pH条件下体系的紫外光谱图1-6:pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5由于蛋白质中含有芳香族氨基酸侧链，主要是酪氨酸（Tyr）、色氨酸（Trp），其次是苯丙氨酸（Phe）27，它们在285nm附近产生吸收，因此可利用紫外-可见光谱研究蛋白质的结构。从图中可以看出在pH=7.5
29、时峰强度最弱。pH7.5后，随着 pH值的增大峰强度减小，pH7.5时随着pH的增加，吸收峰逐渐增加。蛋白质具有羧基和氨基这些酸碱功能团，因此对pH的变化非常敏感，过酸过碱都会导致蛋白质变性失活。血清白蛋白280nm附近的吸收峰是其肽链上2个色氨酸和19个酪氨酸残基的芳杂环的-*跃迁引起的，而240nm附近的吸收则主要是肽键C=O基的n-*跃迁引起，与蛋白质分子的-螺旋结构含量有关。在BSA等电点之后，随着体系中pH的降低，使得BSA分子间作用增强，有利于分子间和分子内的团聚作用，使蛋白质分子的构象改变，-螺旋含量减少，使240nm附近的吸收峰发生红移。同时由于体系pH值的降低，出现蛋白质肽链
30、的伸展现象，血清白蛋白的结构改变，使得包围在白蛋白分子内部的色氨酸，酪氨酸残基的芳杂环疏水基团裸露出来，疏水基之间作用增强，跃迁能量增大，从而导致285nm吸收峰发生红移【26】。有文献报道27，BSA分子中主要的结合部位可能是距 BSA的N端的第 56-57 (AspAsp)，170-171(GluAsp)，362-363(AspAsp)和560-561(AspAsp)的氨基酸羧基，而其它部位的残余-CO0-基为弱结合点。由于这些点的配位诱导引起BSA构象变化，-螺旋含量减少，从而吸收峰位置产生红移。3.1.2 不同浓度BSA下体系的紫外光谱图1-12 BSA浓度为110-5mol/L、21
31、0-5 mol/L、310-5 mol/L、410-5 mol/L、110-4 mol/L、210-4 mol/L、310-4 mol/L、410-4 mol/L、810-4 mol/L、1.210-3 mol/L、1.610-3 mol/L、2.010-3 mol/L由图中可观察到在BSA浓度为310-5 mol/L时吸光度最大。3.1.3 不同浓度的硝酸铅条件下体系的紫外光谱图1-13铅离子浓度：0，110-6mol/L，210-6 mol/L，310-6 mol/L，110-5 mol/L，210-5 mol/L，410-5 mol/L， 510-5 mol/L， 210-4 mol/L
32、，410-4 mol/L，210-3 mol/L，410-3 mol/L，210-2 mol/L紫外图谱分析可知BSA显示了蛋白质的特征吸收带，其峰位置为285 nm，随着铅离子浓度的不断加入，在285 nm附近吸收峰是其肽键上色氨酸和酪氨酸的芳杂环-*跃迁引起的。当加入铅离子时，铅离子与 BSA结合使蛋白质的分子构象发生变化。3.1.4 离子强度的影响1-8Nacl的浓度依次为0，0015mol/L，0.003 mol/L，0.0045 mol/L，0.002 mol/L，0.0025 mol/L，0.005 mol/L，0.01 mol/L，0.015 mol/L图中可以看出当Nacl的浓
33、度0.0045 mol/L时体系的荧光光谱图比较稳定，吸光度大，故选择为Nacl的浓度0.0045 mol/L最佳实验浓度。离子浓度对铅离子和牛血清蛋白的反应有很大影响，离子浓度过高或过低都不会达到理想的实验目的，因为无论是对人体有益的还是有害的元素，它们在体内都有一个相当恒定的浓度范围，任何一种元素浓度过高或过低都将对人体产生不良影响，而且蛋白质本身还存在盐析作用，因此在实验过程当中应该选择一适当的离子浓度范围，才能得到较好的实验结果。3.2 荧光图谱A-H铅离子浓度分别为0，110-6mol/L，210-6mol/L，110-5mol/L，210-5mol/L，210-4mol/L，410
34、-4mol/L,210-3 mol/L蛋白质的内源荧光主要来自于分子中的色氨酸残基和酪氨酸残基，其荧光主要来自第212位的色氨酸残基。在280nm光激发下，BSA分子中的内源荧光发射峰位于350nm附近。图为固定BSA浓度，体系荧光发射光谱随铅离子浓度改变的荧光光谱图谱的变化规律，从图中可见，随着加入的铅离子量的增加，峰形无显著变化，但发射波长有蓝移趋势（5nm），荧光强度有规律地降低，说明铅离子对BSA的荧光有猝灭作用。3.3 红外光谱图蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中多肽链本身的折叠方式，比如-螺旋、-折叠 、-转角等，酰胺 I带及酰胺带(1240cm-1)，在一定程度上能反映蛋白质二级结
35、构的变化，且酰胺 I带对蛋白质分子二级结构变化更敏感，酰胺 I带的变化可近似地表征蛋白质分子二级结构的类型。酰胺基团的特征振动名称波数/cm-1振动模式酰胺A3300N-H伸缩振动酰胺B3100酰胺II带的一次泛频，费米共振酰胺I1660C=O伸缩振动酰胺II1570N-H面内弯曲振动和C-N伸缩振动酰胺III1300C-N伸缩振动和N-H面内弯曲振动酰胺IV630O=C-N面内弯曲振动酰胺V730N-H面外弯曲振动酰胺VI600C=O面外弯曲振动吸收峰位置/cm-1归属1600-1640-折叠1640-1650 无归卷曲1650-1670-螺旋1680-1685转角结构峰位置/cm-1167
36、5 1679 1652 165516451632 163016181614指认-转角-螺旋无归卷曲-链-折叠-片层蛋白质固态与水溶液、重水溶液中二级结构成分归属主频率/cm-1结构成分固态水溶液*重水溶液*-helix1646+1.01656+2.01653+4.0-helix1653+3.0/-helix1635+1.0/-sheet1620+2.01624+0.51624+4.0-sheet/1632+1.01631+3.0-sheet/1638+1.01637+3.0转角1690+1.01666+1.01663+4.0转角1668+1.01672+1.01671+3.0转角1683+1.
37、01680+1.01683+2.0转角1675+1.01688+1.01689+2.0转角1694+0.51694+2.0无序结构/1650+1.01645+4.0注：*数据来源参见蛋白质结构分析， 阎隆飞 孙之荣 主编，清华大学出版社，1999，北京3.3.1 铅离子存在的红外光谱图牛血清蛋白溶液含410-4mol/LPb离子时牛血清蛋白溶液在 BSA缓冲液中分别加入不同浓度的铅离子，其他条件保持不变。测量得到图谱当加入一定量的Pb离子时，BSA的谱峰峰形的变化，图中可见，加入铅离子后，BSA酰胺I带l650cm-1和带1546cm-1的相对强度发生明显变化，说明BSA和Pb离子反应后，BS
38、A分子结构发生了变化。BSA有三个可能结合的位置，即羧基的氧，氨基的氮和酰基的氮。络合物中1615.45cm-1处的强吸收峰可归属为侧链COO-或其金属络合物COOM中COO-的反对称伸缩振动，而1739.57cm-1处的峰是由侧链COOH或COOR中的C=O伸展振动引起的，对应于血红蛋白中1732.29cm-1处的弱宽峰。这些都表明结果表明，铅离子的结合引起血红蛋白二级结构的较大变化，且铅离子可能结合在氨基酸残基的羰基或羧基上。3.3.2 红外二阶导数B-N铅离子浓度依次为110-6 mol/L，210-6 mol/L， 310-5mol/L,210-4 ，210-3mol/L蛋白质红外谱图
39、二级结构指认：在1675cm-1处为-转角增加，1655cm-1-螺旋，1614 cm-1为-片层，1618 cm-1为-折叠。从图中可以观察到-转角增加，-螺旋减小，-片层增加，-折叠增加。这一结果可以进一步说明铅离子和牛血清蛋白发生了相互作用，导致蛋白质分子中肽链出现部分展开，从而改变了牛血清蛋白的二级结构。4. 结论通过上述紫外、荧光、红外三大光谱分析，可以初步判断铅离子与牛血清蛋白发生作用，且两者的结合发生在氨基酸残基的羰基或羧基上。紫外图谱只能过显示了蛋白质的特征吸收带，其峰位置为285nm。铅离子会引起牛血清蛋白的荧光猝灭，BSA分子中的内源荧光发射峰位于350nm附近。体系荧光发
40、射光谱随铅离子浓度改变的荧光光谱图谱的变化规律，随着加入的铅离子量的增加，峰形无显著变化，但发射波长有蓝移趋势（5nm），荧光强度有规律地降低，说明铅离子对BSA的荧光有猝灭作用。加入铅离子后，从红外光谱图中可以观察到BSA酰胺I带l650cm-1和带1546cm-1的相对强度发生明显变化，二阶导数图中，铅离子存在时造成BSA的-转角增加，-螺旋减小，-片层增加，一定程度上改变了BSA的二级结构。参考文献 1 吴刚坷，颜承农，刘义. 荧光分光光度法研究对乙酞氨基酚与牛血清白蛋白之间的相互作用M.理化分册（工作简报），2007，43（11）：964-967.2 FENGXizeng，JINRui
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