黄酒糟蛋白提取工艺研究毕业论文.doc

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1、 本科生毕业论文 学院（系）： 生物与化学工程学院 专 业： 生物工程 学 生： 指导教师： 完成日期 2015 年 5 月 本科生毕业论文 黄酒糟蛋白提取工艺研究 On Technology for Extracting Protein from Rice Wine Grains 总计： 毕业论文 17 页 表 格： 6 个 插 图 ： 6 幅 黄酒糟蛋白提取工艺研究 本本 科科 毕毕 业业 论论 文文 黄酒糟蛋白提取工艺研究 On Technology for Extracting Protein from Rice Wine Grains 学 院（系）： 生物与化学工程学院 专 业： 生

2、物工程 学 生 姓 名： 学 号： 指 导 教 师（职称）： 评 阅 教 师： 完 成 日 期： 2015 年 5 月 黄酒糟蛋白提取工艺研究 i 黄酒糟蛋白提取工艺 生物工程专业 摘 要黄酒发源于中国，黄酒糟是黄酒酿造工业的主要副产物，也是一种丰富 的蛋白质资源。但其热能比较低，不溶性物质多，难以直接利用，造成了其中的蛋白 质资源的极大浪费。本论文通过单因素试验和正交试验，确定碱性内切蛋白酶提取黄 酒糟蛋白的最佳工艺条件：加酶量为 2000u/g，pH 值为 10，反应温度 50，反应时间 2h，料液比 1:8，此工艺下蛋白提取率为 47.40%。 关键词 黄酒糟蛋白；碱性内切蛋白酶；蛋白提

3、取率；提取工艺 黄酒糟蛋白提取工艺研究 The Extraction Technology of Protein from Rice Wine Grains Biological Engineering Major Abstract: Rice wine originated in China. Rice wine grains that is the main byproduct of rice wine brewing industry is also a rich resource of protein. But its energy is relatively low , has mu

4、ch insoluble material and cant be used directly,causing a great waste of protein resources.Through single factor and orthogonal experiment,the optimum conditions for enzymic extraction of protein can be determined and they were:enzyme dosage 2000u/g, pH 10, temperature 50,reaction time 2h and the ra

5、tio of stuff to water 1:8.Under these conditions ,the protein extraction rate was 47.40%. Key words: The rice wine grains protein; Alcalase; extraction rate of protein; extraction technology 黄酒糟蛋白提取工艺研究 目 录 1 绪论.1 1.1 黄酒糟简介 1 1.1.1 黄酒糟的来源1 1.1.2 黄酒糟的主要成分1 1.1.3 黄酒糟的研究现状1 1.2 黄酒糟蛋白的开发价值 2 1.3 黄酒糟蛋白提取

6、工艺的可行性分析 3 1.4 本课题的研究内容.3 2 试验材料与方法.4 2.1 试验材料4 2.1.1 试验原料4 2.1.2 试验试剂4 2.1.3 试验仪器5 2.2 试验方法5 2.2.1 原材料预处理及工艺流程5 2.2.2 蛋白质的标准曲线制作6 2.2.3 单因素试验6 2.2.4 原料中的总蛋白含量及蛋白提取率计算7 2.2.5 正交试验设计8 3 结果与分析.9 3.1 蛋白质的标准曲线 9 3.2 原料中的总蛋白含量 9 3.3 试验结果分析 9 3.3.1 加酶量对蛋白提取率的影响9 3.3.2 pH 对蛋白提取率的影响.10 3.3.3 反应温度对蛋白提取率的影响10

7、 3.3.4 反应时间对蛋白提取率的影响11 3.3.5 料液比对蛋白提取率的影响11 3.3.6 正交试验11 4 结论.15 参考文献.16 致谢.17 黄酒糟蛋白提取工艺研究 0 1 绪论 1.1 黄酒糟简介 1.1.1 黄酒糟的来源 黄酒也被称作米酒，是中国的民族特产；源于绍兴，是世界上最古老的酒类之一； 且唯中国有之，是酒中之祖，酒中之王。其酿造技术独树一帜，堪称“天下一绝”， 1 是祖国宝贵的科学文化遗产，成为东方酿造界的典型代表和楷模。其中以浙江绍兴 2 黄酒为代表的麦曲稻米酒是黄酒历史上最悠久、最有代表性的产品。黄酒是以大米、 黍米为原料，用麦曲或小曲做糖化发酵剂。经过蒸料，拌

8、以麦曲、米曲或酒药，进行 糖化和发酵酿制而制成的酿造酒，享有“国酒”之美誉。其酒性温和雅致、风味醇厚、 香气浓郁、营养丰富，成为我国上下普遍饮用的第一酒类饮品。黄酒糟是黄酒酿造工 业的主要副产物，数量巨大，来源集中，是发酵酒醪经压榨、分离去酒液后留下的固 形物。我国拥有黄酒生产企业 500 多家，因此，黄酒糟的数量是相当可观的。黄酒糟 的各种成分主要来自酿酒原料。同时，在糖化、发酵过程中发生一系列复杂的生物化 学变化，从而又增加了一些新的代谢产物。另外，发酵结束后，酵母细胞大量沉淀下 来，经压榨残留在酒糟中，绝大多数营养物质也保存下来，所以黄酒糟的研究利用将 会有十分广阔的应用前景。 3 1.

9、1.2 黄酒糟的主要成分 酒糟的成分和原料大致相似，不过百分比有些许不同。因为从原料到酒精经过了 一系列的糖化、发酵等生物化学的复杂变化，而产生了一些新的物质成分。一般来说 黄酒糟中的主要成分有乙醇、淀粉、糖、纤维素、糊精、灰分、丰富的蛋白质和一些 风味物质（挥发酸和不挥发酸等）等。其中含有 30%40%左右的蛋白质，是具有开 4 发潜力的蛋白饲料资源，但含水量高，不易久置，易造成环境污染。其中氨基酸种类 齐全，谷氨酸的含量最高，其次为亮氨酸和天冬氨酸。在酿制黄酒所选的原料为大米 时，其蛋白质含量在 8左右；若以小麦作为原料，则蛋白质含量高达 12。而在酿 造黄酒的过程中，只是利用了原料中的糖

10、分，绝大部分蛋白质并没有得到充分利用， 最后遗留于黄酒糟中，因此可以说黄酒糟是一种丰富的蛋白质资源。经过分级沉降的 方法对黄酒糟蛋白进行了组成成分进行分析，可以得知谷蛋白和球蛋白是其中的主要 组成部分。 3 1.1.3 黄酒糟的研究现状 黄酒，世界最古老的酒种之一。虽然黄酒的生产已经有几千年的历史，但是黄酒 糟的研究却始于八十年代末期。黄酒糟中由于不溶性物质多，很难直接利用，它对酒 黄酒糟蛋白提取工艺研究 1 厂来说是废弃物，只当做饲料处理甚至是烂掉，造成黄酒糟中大量的可利用资源如蛋 白质、有机酸、还原糖、脂肪等的大大浪费，也会污染环境。黄酒糟也有一部分可以 用来作为继续生产白酒或是生产食醋的

11、原料，但与此同时很多对于黄酒糟的研究也并 没有应用于实际生产当中。 3 目前，酒糟的研究方向主要集中在酒糟液的分析测定和性能比较、酒糟液的分离 和处理、酒糟分离液和酒糟渣的综合开发利用等方面。而且在这么多的酒糟研究中， 啤酒糟的研究占了绝大多数。在少数的黄酒糟研究中，黄酒糟蛋白的研究更是寥寥无 几。下面我将针对国内外学者对黄酒糟的研究开发进行简单论述。 3 彭涛利用黄酒糟通过连续发酵和深层发酵来生产食醋。谷海先等人研究生产特 5 鲜酱油的技术时应用了复合风味蛋白酶及麸曲酸性蛋白酶、麸曲糖化酶水解黄酒糟。 6 杨国军生产“香糟卤”时向黄酒糟中添加天然植物混合香辛料等调味成分。王素萍 7 进行酵母

12、蛋白饲料的开发则使用了固态发酵大米黄酒糟。汪建国等人通过酸水解黄 8 酒糟方式生产复合氨基酸。还有国外学者通过黄酒糟制得甘油，或者生产淀粉酶和 9 纤维素酶，制取糖用活性碳，外敷治疗关节炎等疾病。目前，黄酒糟因其年产量大、 10 工业副产物多，以及营养丰富备受广大国内外研究者的关注。在各类研究中利用黄酒 糟来生产饲料、培养食用菌和进行厌氧发酵生产沼气还是较深入和广泛的，这不仅节 约资源，而且还保护生态环境。 1.2 黄酒糟蛋白的开发价值 近年来，随着世界人口的快速增长和环境的急剧恶化，蛋白资源的缺乏已经成为 全人类需要共同面临的严峻问题。开辟新的蛋白质资源，增加饲用蛋白质产量的问题 迫在眉睫。

13、此外，酒糟 BOD 值（生化需氧量或生化耗氧量，表示水中有机物等需氧污 染物质含量的一个综合指示）极高，若不经处理直接排入河道，会造成严重的环境污 染。 对于目前现有的蛋白质资源，特别是对我国大量低值蛋白资源的精深加工，是解 决长期以来严重制约我国食品工业发展问题的必然途径。植物蛋白具有较高的营养价 值，是人们赖以生存的一类数量庞大的蛋白质资源。黄酒糟蛋白质含量丰富、质量较 好，水不溶性的谷蛋白是其中含量最大的；而且和大米蛋白相比较，黄酒糟中的蛋白 具有碱溶解性较低的优点 。经过蛋白酶水解后变为水解蛋白，该水解蛋白具有人体代 谢和生理调节功能，易消化吸收，食用安全性高，可被用作保健食品的原料。

14、另外它 能改善口感、增加风味，所以它作为一种较为理想的风味物质和营养强化剂被广泛地 应用于饮料及其他相关食品行业。但是目前技术还不成熟，尚未将其充分转化为更 11 合理更有价值的资源，大量的黄酒糟仅作低价饲料，甚至可能会霉烂污染环境。黄酒 糟营养价值丰富，研究其蛋白提取工艺不但能够降低黄酒企业的生产成本，还能有效 地减少环境污染。 12 黄酒糟蛋白提取工艺研究 2 因此研究黄酒糟蛋白质的最佳提取工艺对其综合利用具有重要的意义。在黄酒糟 的研究开发利用过程中本着变废为宝的角度，需要开创一条既可减少环境污染，又可 以节约资源、降低生产成本的新思路。同时，因为黄酒糟、白酒糟和啤酒糟中的组成 含量也比

15、较相似，这样深入对黄酒糟蛋白的研究开发也就为其他酒糟的开发利用提供 了可参考的重要依据。 13 1.3 黄酒糟蛋白提取工艺的可行性分析 黄酒糟蛋白属于植物蛋白的一种，植物蛋白的提取方法有很多，最常用的是酸法、 碱溶酸沉法以及酶法。传统方法是以酸法提取为主，但由于酸法水解温度较高，一般 在 100以上。原料中的碳水化合物易脱水，含硫氨基酸会分解产生含硫化合物，使产 品具有一股臭味。而且水解程度难以控制，活性肽含量低，水解产物中盐分含量较高。 碱溶酸沉法，是一种简单易行的提取方法，比如在大豆蛋白等分离提取中就有着十分 广泛的应用。但在高碱性条件下，碱水解会引起蛋白质的变性和水解，氨基酸的结构 会遭

16、到破坏，蛋白质的营养价值也随之降低，同时也增加了非蛋白成分，使得蛋白难 以提取。酶法则是通过酶水解植物蛋白将其中的蛋白质分解成氨基酸和分子量较小的 多肽而提取出来。酶法水解反应条件温和、副反应较少、有害物质产生少、水解程度 也容易控制，特别是对营养物质成分的保留上，具有不可比拟的优点。所以说酶法提 取蛋白质是植物蛋白提取乃至未来食品与生化工艺发展方向的指标。 3 碱性内切蛋白酶是由造育的地衣芽孢杆菌发酵而得，主要成分为枯草杆菌蛋白酶， 是一种内肽酶，催化部位为丝氨酸，分子量约为 27300。它能水解蛋白质分子肽链生成 多肽或氨基酸，具有较强的分解蛋白质的能力。在碱性环境下(pH 为 912)催

17、化蛋白质， 主要生成物质为肽类及氨基酸。其最适温度范围为 4055，添加量一般为 5002500u/g。碱性内切蛋白酶水解酒糟，因其适合的作用条件是在碱性环境下，这更 有利于碱溶性蛋白谷蛋白等的溶解。因为酒糟蛋白原本就可以通过碱提的方法制得， 在碱酶的高提取率中，部分应归功于碱提的作用。碱性内切蛋白酶对天然底物的专一 性甚强，有终端疏水性氨基酸的专一性，主要裂解疏水性氨基酸的终端如：亮氨酸、 异亮氨酸、缬氨酸等，而疏水性氨基酸在终端比在肽链间的苦味小。除此之外，由 14 于碱性内切蛋白酶是微生物酶，来源广、成本低、适合工业化生产，是比较理想的工 业用酶。 因此，综上所述考虑到蛋白质的提取效率和

18、避免蛋白水解液的苦味性，本课题决 定采用碱性蛋白酶研究黄酒糟蛋白的酶法提取工艺。 1.4 本课题的研究内容 本课题是以黄酒糟为原料，研究黄酒糟蛋白的酶法提取工艺，旨在充分开发利用其 中含量最大的水不溶性谷蛋白，提高蛋白质的提取效率。以此极大地缓解我国蛋白资 黄酒糟蛋白提取工艺研究 3 源匮乏的严峻现状，并可有效地发展经济，实现食品工业、化工产业、农业、环保等 方面的可持续发展。 2 试验材料与方法 2.1 试验材料 2.1.1 试验原料 表 1 试验原料 原料名称采购时间 产地 黄酒糟2015 年 4 月河南省南阳市 2.1.2 试验试剂 表 2 试验所用主要试剂 试剂生产厂家（产地） 纤维素

19、酶 15000u/g 碱性内切蛋白酶 200000u/g 混合指示剂 浓硫酸 上海抚生实业有限公司 河南金源生物科技有限公司 天津市科密欧化学试剂有限公司 天津致远化学试剂有限公司 过氧化氢天津致远化学试剂有限公司 氢氧化钠 硫酸钾 天津市德恩化学试剂有限公司 国药集团化学试剂有限公司 硼酸北京化学试剂公司 盐酸中平能化集团开封东大化工有限公司 CuSO45H2O北京化学试剂公司 牛血清蛋白北京化学试剂公司 黄酒糟蛋白提取工艺研究 4 2.1.3 试验仪器 表 3 试验所用主要仪器 刻度试管，烧杯，容量瓶，三角瓶，移液管，天平等试验室常用玻璃仪器。 2.2 试验方法 2.2.1 原材料预处理及

20、工艺流程 （1）原材料预处理 黄酒糟粉末的制备 黄酒糟经干燥处理后用高转速粉碎机粉碎，然后过 60 目筛。 水洗除杂 准确称取 3.00g 黄酒糟粉末，按 1:6 的比例加水，搅拌使黄酒糟粉末均匀分散于水 中，在 60的温度下水浴振荡 30min，之后以 4000r/min 的速度离心 5min，弃上清液。 纤维素酶水解 经过水洗之后，黄酒糟中还有一些粗纤维等不溶性物质未能有效除去，只能通过 酸法或酶法来降解。因此还需要用纤维素酶将纤维素降解，以便解除蛋白质与纤维素 的结合，释放蛋白质，提高蛋白质的提取率。 准确称取 3.00g 水洗除杂后的黄酒糟湿基，按照 1:8 的比例加水，在 50水浴锅

21、 内保温，待锥形瓶内料液温度达到 50后，调整 pH 值到 5(采用 1mol/L 的 NaOH 来调 整)。按照 28u/g 的酶量添加纤维素酶，水浴振荡 30min 结束；在反应过程中不断加碱， 名称 型号生产厂家 电子天平 BS-210S北京赛多利斯天平有限公司 高速万能粉碎机 FW-100北京中兴伟业仪器有限公司 电热恒温振荡水槽 SHC-28郑州杜甫仪器厂 电热恒温干燥箱CS101-A北京市永光明医疗仪器厂 电热恒温水浴锅 HH-S巩义设备有限公司 721 分光光度计 721上海精密仪器厂 低温高速离心机TDL-40B北京中兴伟业仪器有限公司 自动纯水蒸馏器 SZ-96上海亚荣生化仪

22、器厂 气流烘干器 KQ-B长城科工贸有限公司 精密 pH 计 pH S-25上海精科雷磁 黄酒糟蛋白提取工艺研究 5 维持反应体系 pH 在设定值的0.1 之内。反应结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭 活处理。以 4000r/min 的速度离心 10min，弃上清液收集沉淀物。最后干燥处理。 （2）工艺流程 准确称重 3.00 g 处理后的黄酒糟加水调整适当 pH 值和温度酶解灭酶 (100，15 min)离心(4000r/min，10 min)收集上清液紫外分光光度法测定吸光值 根据吸光值计算蛋白质含量。 2.2.2 蛋白质的标准曲线制作 由于酪氨酸、色氨酸残基和苯丙氨酸所含有的苯环

23、具有共轭双键，使得蛋白质 15 分子具有吸收紫外光的性质，其最大吸收峰位于 280nm 附近（不同的蛋白质吸收波长 略有差别）。在最大吸收峰处，吸光度与蛋白质的含量成正比，其关系服从朗伯-比耳 定律。利用在一定的波长下，蛋白质溶液的光吸收值与其浓度的正比关系，则可以测 定其中的蛋白质的含量。该测定法具有简单灵敏快速、高选择性、干扰易消除、不 15 消耗样品，且稳定性好、不干扰测定等优点。 16 测定蛋白质溶液在 280nm 处的吸光度值是最常用的紫外吸收法。许多蛋白质在一 定浓度和一定波长下的光吸收值有文献数据可查，根据此光吸收值可以较准确地计算 蛋白质浓度。若查不到待测蛋白质的光吸收值，则可

24、选用一种与待测蛋白质的酪氨酸 和色氨酸含量相近的蛋白质作为标准蛋白质，用标准曲线法进行测定。标准蛋白质溶 液配制的浓度为 1.0mg/mL。常用的标准蛋白质为牛血清蛋白（BSA）。 准确称取 25mg 牛血清蛋白粉末，于小烧杯中溶解，摇匀后加入到 25mL 的容量瓶 中，配置成 1mg/mL 的牛血清蛋白标准溶液。将得到的标准牛血清蛋白标准溶液精密 吸取 0.0mL，1.0mL，1.5mL，2.0mL，2.5mL，3.0mL，4.0mL 分别于七个洁净的 4mL 刻度试管中，然后向每个刻度试管中各加入蒸馏水 4.0mL，3.0mL，2.5mL，2.0mL，1.5mL，1.0mL，0.0mL 充

25、分振荡后静置 6min，在 280nm 处测吸光度。以蛋白质浓度和对应的吸光值为对应坐标，绘制标准曲线。 2.2.3 单因素试验 （1）加酶量对蛋白提取率的影响 准确称取经处理过的黄酒糟 3.00g，按照 1:8 的料水比加水，于 50水浴锅中保温， 而后调整 pH 值到 11(采用 1mol/L 的 NaOH 调整)。按照 500u/g、1000u/g、1500u/g、2000u/g、2500u/g 的加酶量添加碱性内切蛋白酶，水浴振 荡 2h，在反应过程中不断加酸或碱，维持反应液中 pH 在设定值 110.1 范围内。反应 结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭活处理，然后调整 pH

26、至 7，以 4000r/min 的速 度离心 10min，收集上清液。用紫外分光光度法测定上清液的吸光值，进而算得蛋白 3 质含量，最后计算蛋白提取率。 黄酒糟蛋白提取工艺研究 6 （2）pH 对蛋白提取率的影响 准确称取经处理过的黄酒糟 3.00g，按照 1:8 的料水比加水，于 50的水浴锅内保 温，而后调整 pH 值为 9、10、11、12。按照 2000u/g 的加酶量添加碱性内切蛋白酶， 水浴振荡 2h，在反应过程中不断加酸或碱，维持反应液中 pH 在设定值0.1 范围内。 反应结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭活处理，然后调整 pH 至 7，以 4000r/min 的速度离

27、心 10min，收集上清液。用紫外分光光度法测定上清液的吸光值，进而算得 3 蛋白质含量，最后计算蛋白提取率。 （3）反应温度对蛋白提取率的影响 准确称取经处理过的黄酒糟 3.00g，按照 1:8 的料水比加水，于 50的水浴锅内保 温，而后调整 pH 值到 11(采用 1mol/L 的 NaOH 调整)。按照 2000u/g 的加酶量添加碱 性内切蛋白酶，在 40、45、50、55的温度下下水浴振荡 2h，在反应过程中不 断加酸或碱，维持反应液中 pH 在设定值 110.1 范围内。反应结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭活处理，然后调整 pH 至 7，以 4000r/min 的速度离

28、心 10min，收集上清 液。用紫外分光光度法测定上清液的吸光值，进而算得蛋白质含量，最后计算蛋白 3 提取率。 （4）反应时间对蛋白提取率的影响 准确称取经处理过的黄酒糟 3.00g，按照 1:8 的料水比加水，于 50的水浴锅内保 温，而后调整 pH 值到 11(采用 1mol/L 的 NaOH 调整)。按照 2000u/g 的加酶量添加碱 性内切蛋白酶，水浴振荡 1h、2h、3h、4h，在反应过程中不断加酸或碱，维持反应液 中 pH 在设定值 110.1 范围内。反应结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭活处理， 然后调整 pH 至 7，以 4000r/min 的速度离心 10min

29、，收集上清液。用紫外分光光度 3 法测定上清液的吸光值，进而算得蛋白质含量，最后计算蛋白提取率。 （5）料液比对蛋白提取率的影响 准确称取经处理过的黄酒糟 3.00g，按照 1:8、1:12、1:16、1:20 的料水比加水， 于 50的水浴锅内保温，而后调整 pH 值到 11(采用 1mol/L 的 NaOH 调整)。按照 2000u/g 的加酶量添加碱性内切蛋白酶，水浴振荡 2h，在反应过程中不断加碱，维持反 应液中 pH 在设定值 110.1 范围内。反应结束后在沸水浴中加热 15min 进行酶灭活处 理，然后调整 pH 至 7，以 4000r/min 的速度离心 10min，收集上清液

30、。用紫外分光 3 光度法测定上清液的吸光值，进而算得蛋白质含量，最后计算蛋白提取率。 2.2.4 原料中的总蛋白含量及蛋白提取率计算 原料中的总蛋白含量使用微量凯氏定氮法测定，其原理如下：样品与浓硫酸共热， 含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，反应生成硫酸铵。经强碱碱化 使之分解放出氨，用水蒸气蒸馏法将氨蒸至无机酸溶液中（蒸馏）。然后再用标准酸 溶液进行滴定，滴定所用无机酸的量相当于被测样品中的氨的量（滴定），根据所测 黄酒糟蛋白提取工艺研究 7 得的氨量即可计算出样品的氮含量。再根据含氮量计算得到总蛋白含量。 总蛋白含量（%）= 氮含量6.25100% 蛋白质提取率（%）=%10

31、0 - 原料中总蛋白质质量 加入的蛋白酶质量提取液中总蛋白质量 2.2.5 正交试验设计 鉴于各因素之间的相互影响，在单因素试验的基础上，选取加酶量、pH、反应温 度、反应时间、料液比五个因素进行正交试验，以蛋白质提取率为指标，并对结果进 行方差分析，以获得最佳提取工艺条件。 黄酒糟蛋白提取工艺研究 8 3 结果与分析 3.1 蛋白质的标准曲线 图 1 牛血清蛋白的标准曲线 根据数据得到牛血清蛋白标准溶液和吸光度之间的一元线性回归方程为： y=1.8598x-0.0056 其中 x:280nm 处的吸光值；y:牛血清蛋白的浓度；经过计算，相关系数为： R =0.9994，回归极显著。故可以用该

32、方法测量蛋白质的含量。 2 3.2 原料中的总蛋白含量 黄酒糟粉末经过水洗除杂和纤维素酶处理之后，使用微量凯氏定氮法测得含氮量， 经进一步计算得到其总蛋白含量为 39.60%。 3.3 试验结果分析 3.3.1 加酶量对蛋白提取率的影响 黄酒糟蛋白提取工艺研究 9 图 2 加酶量对蛋白质提取率的影响 由图 2 可知，当加酶量从 500u/g 增至 2000u/g 时，蛋白提取率也随之平稳增长。 但当加酶量大于 2000u/g 时，蛋白提取率增长趋势减缓。原因是在底物浓度不断被酶完 全饱和前，加酶量的增大提高了碱性蛋白酶对酒糟中蛋白的作用能力。但是，当酶浓 度逐渐增长到底物浓度不能使其饱和时，酶

33、解程度缓慢，提取率就不能再随其成正比 增长。 3.3.2 pH 对蛋白提取率的影响 图 3 pH 对蛋白质提取率的影响 由图 3 可知，当 pH 值小于 10 时，蛋白质提取率随 pH 值的增大而上升，pH 值在 10 时，蛋白质的提取率达到最大值，之后随 pH 值的增大而减小。pH 值在 10 左右， 蛋白提取率较高，说明在这个范围内，碱性蛋白酶有较高活性，低于或高于此范围， 酶活力都会有所降低。 13 3.3.3 反应温度对蛋白提取率的影响 黄酒糟蛋白提取工艺研究 10 图 4 反应温度对蛋白质提取率的影响 由图 4 可知，在 4550的范围内，随着温度的上升，蛋白质提取率有明显的提 高；

34、当温度为 50时，蛋白提取率最高。高于 50后，蛋白质提取率反而下降。原因 可能是反应温度超过了其酶反应的最适温度，而导致蛋白质发生变性、降解反应，降 低了提取效率。因此该碱性内切蛋白酶的最适反应温度是在 4550之间。 3.3.4 反应时间对蛋白提取率的影响 图 5 反应时间对蛋白质提取率的影响 由图 5 可知，在反应的前 3h，随着时间的延长，蛋白质的提取率稳步上升；在 3h 之后，蛋白提取率增长缓慢。总之，前 3 h 内，蛋白质的水解速度极快；当溶液中积 累了一定量的多肽和氨基酸等水解产物时，蛋白质得率增长减缓。这是因为蛋白质水 解是可逆反应，积累的这些物质会对酶解反应有一定的抑制作用。

35、同时，高温环境也 会使大量的酶失活。因此，正交试验中反应时间定为 3h。 13 3.3.5 料液比对蛋白提取率的影响 黄酒糟蛋白提取工艺研究 11 图 6 料液比对蛋白质提取率的影响 由图 6 可知，在最初的料液比为 1:8 时，蛋白质提取率为最大值，之后随着加液量 的增加，蛋白提取率持续降低。因为当料液比过低时，反应体系会比较黏稠，流动性 差，黄酒糟不能很好地与蛋白酶结合，反应不能充分进行。当料液比过高时则降低了 酶的相对浓度，使其与底物碰撞的几率大大降低。因此最适宜的料液比是 1:8。 3.3.6 正交试验 在影响蛋白质提取率的五个单因素里面，料液比与蛋白提取率呈现负相关性，而 且在料液比

36、为 1:8 时几乎达到了最大提取率。实际操作中，发现料液比过低时，反应体 系过稠难以搅拌混合，体系分散不均匀，所以料液比不能选择太低。但是料液比过高 时不仅降低反应速率，同时也会增加蛋白水解液的浓缩操作时间，增加生产成本与周 期，因此正交试验中也将采取料液比为 1:8，不再验证分析。 3 根据上述分析，在单因素实验的基础上，将采用正交表进行试验，以蛋白 4 9 3L 质提取率为指标，研究加酶量(A)、pH(B)、温度(C)、时间(D)四因素对黄酒糟蛋白提取 率的影响，以便得出其最优化的因素水平组合。 表 4 因素水平选择表 因素 水平 加酶量(A)pH(B)反应温度(C)反应时间(D) 116

37、00u/g10402h 21800u/g10.5453h 32000u/g11504h 黄酒糟蛋白提取工艺研究 12 表 5 试验方案及试验结果计算表 试验号 A B C D 提取率 （%） 1 1 1 1 1 36.91 2 1 2 2 2 31.23 3 1 3 3 3 34.83 4 2 1 2 3 35.69 5 2 2 3 1 37.20 6 2 3 1 2 34.29 7 3 1 3 2 47.40 8 3 2 1 3 32.63 9 3 3 2 1 44.64 102.97 120 103.83 118.75 K1 107.18 101.06 111.56 112.92 T=33

38、4.82 K2 124.67 113.76 119.43 103.15 K3 34.32 40 34.61 39.58 K1 35.73 33.69 37.19 37.64 K2 黄酒糟蛋白提取工艺研究 13 41.56 37.92 39.81 34.38 K3 7.24 6.31 5.2 5.2 Rj 表 6 方差分析表 变异来源自由度平方和方差F 值 F 显著性 A288.2844.1429.23 01.99 2201 . 0 ， F B262.131.0520.56 00.19 2205 . 0 ， F C240.5620.2813.43 D2 38.4219.2112.72 误差 e2

39、 3.011.51 从表 5 中可知，在试验取值范围内，通过比较值大小，可以得出四个因素对蛋 Rj 白质提取率影响主次因素是：加酶量pH反应温度=反应时间。通过比较 K 值大小， 可以确定出各因素的优水平是 A B C D 即：加酶量 2000u/g、pH 为 10、反应温度 3131 50、反应时间 2h。从方差分析表 6 中可知，只有加酶量、pH 两个因素在试验设计水 平上表现出显著。本试验的指标是越大越好，即蛋白质提取率也越高。因此，加酶量 应选择 2000u/g、pH 为 10。 对于不显著性因素反应温度和反应时间来说，可以综合单因素及正交试验的结果 ，碱性内切蛋白酶的最适温度应该是在

40、 50左右。蛋白提取率会随着反应时间加长 13 而不断提高，但是需要考虑到成本和方便操作等方面的问题以此来选取最适水平。在 设定的反应温度和 pH 范围内，蛋白的提取率在反应时间 2h 时最高，在此条件下其蛋 白提取率为 47.40。因此总的来说，本试验选取的最佳条件应该为，加酶量为 2000u/g，pH 值为 10，反应温度 50，反应时间 2h。 黄酒糟蛋白提取工艺研究 14 4 结论 本试验在对多种植物蛋白提取方法进行研究比较的基础上，为了提高黄酒糟蛋白 的提取率，先是采用了水洗除杂，然后纤维素酶酶解进行原材料预处理，接着再进行 黄酒糟蛋白酶法提取工艺路线。针对黄酒糟组织致密，粗纤维含量

41、高的成分特点，使 用碱性内切蛋白酶通过酶水解植物蛋白将其中的蛋白分解成氨基酸和分子量较小但溶 解性很好的的短肽而提取出来。通过对各个操作因素进行了合理的研究分析并进行试 验设计，在单因素试验和正交试验之后，得出如下结论：在加酶量为 2000u/g，pH 值 为 10，温度 50，反应时间 2h 的条件下，蛋白质提取率可以达到最高 47.40%。 同时，各个因素对黄酒糟中蛋白质提取率的影响是相互联系、相互制约的，其影 响规律在不同水平上相差较大，并呈非简单的线性函数关系。因此我们在实际生产和 研究中有必要寻找各个操作参数的最佳条件，通过对各个操作因素进行了合理的研究 分析并进行试验设计以取得最大

42、收益。 17 黄酒糟蛋白提取工艺研究 15 参考文献 1 励建荣. 黄酒工业的现状和发展方向J. 酿酒, 2000,32(1):2-4. 2 杨国军. 中国黄酒业调研报告J. 中国酿造, 2005,(4):1-5. 3 姜健美. 黄酒糟蛋白酶法提取工艺研究D. 中国科学院上海冶金研究所, 2007. 4 李华, 施佳慧. 黄酒糟的氨基酸组成及脂类成分分析J. 安徽农业科学, 2009,37(34):1742-1743. 5 彭涛. 利用黄酒糟生产食醋J. 兰州科技情报,2000,29(2):2-3. 6 谷海先, 周建明. 黄酒糟酶法水解制各特鲜酱油的研究J. 中国调味品, 2003,(3):

43、10-12. 7 杨国军. 利用黄酒糟生产“香糟卤”J. 酿酒科技, 2003,(2):108-109. 8 王素萍. 大米黄酒糟酵母蛋白饲料的开发、中试生产及其产品应用研究D. 江南大学出版社, 2005. 9 汪建国, 钱非, 奕水明. 用黄酒糟生产复合氨基酸的试制J. 酿酒科技,2001(3):65-66. 10 Marshall W.G, Wordsworth J.I. Rice science and technologyM. New York :Marcel Dekker, Inc. 1994,237-259. 11 李志军, 鲁宁华, 张明. 水解蛋白的研究和应用J. 食品工业,

44、2003(10):36-38. 12 David W.J. Thompson. Response surface expermentationJ. Journal of Food Processing and Preservation,1982,18(6):155-158. 13 左楠楠, 王小伟, 金海如. 酶法提取黄酒糟蛋白工艺研究J. 山西农业科学,2012,40(12). 黄酒糟蛋白提取工艺研究 16 14 Hamada J.S. Use of proteases to enhance solubilization of rice bran proteinsJ. Food Bioche

45、m ,1998,23:307-321. 15 李媛. 磁性聚合物微球的制备与应用D. 河北科技大学出版社, 2010. 16 彭艳. 副猪嗜血杆菌神经氨酸酶的理化特性及其免疫原性研究D. 四川农业大学出版社, 2010. 17 刘建忠, 熊亚红, 翁丽萍. 生物过程的优化N. 中山大学学报(自然科学版), 2002,(6)132-136. 致谢 踉踉跄跄地忙碌了将近两个月，我的毕业论文也终将告一段落。在论文完成之际，我要特别感 谢我的指导老师-老师虽身负教学、科研重任，但仍百忙之中抽出时间，耳提面命，殷殷之情尽在 谆谆教诲中。老师作为一个优秀负责、经验丰富的老师，无论是在论文的选题、构思和材料

46、的收集 方面，还是在我试验操作以及撰写论文的过程中，都使我得到了她悉心的教诲和无私的帮助。特别 是她渊博的学识、深厚的学术素养、严谨的治学精神和一丝不苟、孜孜不倦的工作作风时刻激励着 我努力踏实，并将鞭策我在未来的学习工作中锐意进取、奋发向上，使我终生受益。毕竟“经师易 得，人师难求”，在此我要对老师再一次表示真挚地感谢和深深的敬意。 此外，我的试验和论文最终能够得以顺利完成，也要感谢所有授我以业的大学老师。虽然他们 没有直接参与我的试验和论文指导，但在大学四年里，他们的谆谆教导使我不断成长，收获无数， 却无以回报，终生难忘。同时，我也十分感谢和我一起做试验的几个同学，试验过程中遇到了许多 不

47、懂的，我们相互讨论也克服了不少困难。所以整个试验过程中虽然很辛苦，但也十分快乐。还有 许多不知名字的人，也许他们只是我生命中的匆匆过客，但他们对我的支持和帮助依然在我的心中 留下了深刻的印象。在此无法一一罗列，但对他们，我始终心怀感恩。感恩之情难以用语言量度， 请允许我谨以最朴实的话语致以最崇高的敬意。 黄酒糟蛋白提取工艺研究 17 光阴荏苒一挥间 ，厉兵秣马又四年，生命中最美好的四年大学生活就这样将近尾声。四年的 大学生活是我人生这条线上的一小段，却是最闪闪发光、值得回味的一段。因为它包含了太多的汗 水和收获、眼泪和欢笑，为我确立未来的人生方向起着至关重要的作用。大学期间，我所得到的不 仅只是书本上的知识，大学里良好的环境氛围也在潜移默化地影响着我的学习方式和思维模式。所 有这些学习生活的能力和行为方式的转变，是我这四年学习中最大的收获，这也必将影响我未来一 生的发展。在一个人漫长的生长过程中，需要的不仅仅是知识方面的积累，还需要正确的思想态度 和积极乐观的人生观、价值观、世界观。知识可以不断获得，而人生观一旦形成，对